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Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

Wellesley College

Buforin II &#x662F;&#x6E90;&#x81EA;&#x6700;&#x521D;&#x5206;&#x79BB;&#x80C3;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x4E2D;&#x4E9A;&#x6D32;&#x87FE;&#x870D;&#x87FE;&#x870D;&#x7684;&#x80BD; 21-&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x6027;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x6297;&#x83CC;&#x80BD;&#x3002;&#x5B83;&#x88AB;&#x5047;&#x8BBE;&#x901A;&#x8FC7;&#x8F6C;&#x8FD0;&#x5230;&#x7EC6;&#x80DE;&#x65E0;&#x819C;&#x901A;&#x900F;&#x6027;&#x589E;&#x9AD8;&#xFF0C;&#x5E76;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5230;&#x6838;&#x9178;&#x76EE;&#x6807;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x7684;&#x7EC6;&#x83CC;&#x3002;&#x4EE5;&#x524D;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x53D1;&#x73B0; buforin II &#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x548C;&#x819C;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x4E0E;&#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x8102;&#x8D28;&#x6210;&#x5206;&#x3002;&#x5728;&#x6B64;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7528;&#x8102;&#x56CA;&#x6CE1;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x548C;&#x5206;&#x5B50;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66; (MD) &#x6A21;&#x62DF;&#x6765;&#x6DF1;&#x5165;&#x4E86;&#x89E3; buforin &#x4E8C;&#x3001; &#x5982;&#x4F55;&#x4EE5;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#x4EA4;&#x4E92;&#x4E0E;&#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x80C6;&#x78B1; (PC)&#x3001; &#x78F7;&#x8102;&#x9170;&#x7518;&#x6CB9; (PG) &#x548C;&#x78F7;&#x8102; (PE) &#x8840;&#x8102;&#x3002;&#x8367;&#x5149;&#x5149;&#x8C31;&#x6D4B;&#x91CF;&#x540C;&#x610F;&#x524D;&#x4E00;&#x79CD;&#x8BF4;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x4E8C;&#x4E0D;&#x7EAF; PC &#x56CA;&#x6CE1;&#x4E0E;&#x4EA4;&#x4E92;&#x7684; buforin&#x3002;&#x5C3D;&#x7BA1;&#x5982;&#x6B64;&#xFF0C;&#x51CF;&#x5C11;&#x7684;&#x8FDB;&#x5165;&#x5230;&#x76F8;&#x5BF9;&#x4E2D;&#x7ACB;&#x7684; PC &#x819C;&#x5728;&#x6A21;&#x62DF;&#x671F;&#x95F4;&#x7684;&#x9634;&#x79BB;&#x5B50; PG &#x819C;&#x80BD;&#x7684;&#x5173;&#x8054;&#x4E0E; BF2 &#x6613;&#x4F4D;&#x7EAF; PG &#x819C;&#x901A;&#x8FC7;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x7684;&#x51CF;&#x5C11;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#x663E;&#x793A; PC &#x819C;&#x8FDB;&#x5165;&#x6A21;&#x62DF;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x5982;&#x4F55; buforin II &#x6700;&#x521D;&#x53EF;&#x80FD;&#x7A7F;&#x900F;&#x7EC6;&#x80DE;&#x819C;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC; MD &#x6A21;&#x62DF;&#x8FD8;&#x5141;&#x8BB8;&#x6211;&#x4EEC;&#x8003;&#x8651;&#x5982;&#x4F55;&#x4E2D;&#x6027; PE &#x8840;&#x8102;&#x5F71;&#x54CD;&#x80BD;&#x6BD4; PC &#x4EE5;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#x3002;&#x5C24;&#x5176;&#xFF0C;&#x80BD;&#x5728; PE &#x8840;&#x8102;&#x6C34;&#x5E73;&#x4E0E;&#x6A21;&#x62DF;&#x4E86;&#x66F4;&#x87BA;&#x65CB;&#x7684;&#x4E8C;&#x7EA7;&#x7ED3;&#x6784;&#x3002;&#x5706;&#x4E8C;&#x8272;&#x6027;&#x6D4B;&#x91CF;&#xFF0C;&#x4E5F;&#x663E;&#x7136;&#x5728;&#x7ED3;&#x6784;&#x4E2D;&#x7684;&#x66F4;&#x6539;&#x3002;PE &#x4E5F;&#x51CF;&#x5C11;&#x4E86;&#x819C;&#x8FDB;&#x5165;&#x6A21;&#x62DF;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x5728;&#x573A; PE &#x5728;&#x4EE5;&#x524D;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x4E2D;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x7684;&#x60C5;&#x51B5;&#x4E0B;&#x51CF;&#x5C11;&#x6613;&#x4F4D;&#x5173;&#x8054;&#x3002;&#x5728;&#x4E00;&#x8D77;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7ED3;&#x679C;&#x63D0;&#x4F9B;&#x5982;&#x4F55;&#x8102;&#x8D28;&#x6210;&#x5206;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5F71;&#x54CD; buforin &#x4E8C;&#x3001; &#x7ED3;&#x6784;&#x548C;&#x529F;&#x80FD;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5C06;&#x6709;&#x76CA;&#x4E8E;&#x52AA;&#x529B;&#x8BBE;&#x8BA1;&#x4E0E;&#x6240;&#x9700;&#x7684;&#x6297;&#x83CC;&#x5242;&#x548C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7A7F;&#x900F;&#x5C5E;&#x6027;&#x7684;&#x591A;&#x80BD;&#x5206;&#x5B50;&#x6C34;&#x5E73;&#x6DF1;&#x5165;&#x3002;

Buforin &#x4E8C;&#x3001; &#x7ED3;&#x6784;&#x548C;&#x819C;&#x8FDB;&#x5165;&#x8102;&#x8D28;&#x7EC4;&#x6210;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;

Buforin II&#x306F;&#x5F53;&#x521D;&#x3001;&#x30A2;&#x30B8;&#x30A2;&#x30D2;&#x30AD;&#x30AC;&#x30A8;&#x30EB;&#x30D2;&#x30AD;&#x30AC;&#x30A8;&#x30EB;gargarizans&#x306E;&#x80C3;&#x7D44;&#x7E54;&#x304B;&#x3089;&#x5358;&#x96E2;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x7531;&#x6765;&#x306E;21&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x30DD;&#x30EA;&#x30AB;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;&#x6027;&#x6297;&#x83CC;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x306F;&#x3001;&#x819C;&#x900F;&#x904E;&#x305B;&#x305A;&#x306B;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x3078;&#x306E;&#x8EE2;&#x4F4D;&#x3084;&#x6838;&#x9178;&#x306B;&#x7D50;&#x5408;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x7D30;&#x83CC;&#x306E;&#x5E83;&#x3044;&#x7BC4;&#x56F2;&#x3092;&#x5BFE;&#x8C61;&#x3068;&#x3059;&#x308B;&#x4EEE;&#x8AAC;&#x304C;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x4EE5;&#x524D;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;buforin II&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x3068;&#x819C;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306F;&#x8102;&#x8CEA;&#x7D44;&#x6210;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x308F;&#x304B;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;buforin II&#x306F;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30B3;&#x30EA;&#x30F3;&#xFF08;PC&#xFF09;&#x3001;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30B0;&#x30EA;&#x30BB;&#x30ED;&#x30FC;&#x30EB;&#xFF08;PG&#xFF09;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30DB;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A1;&#x30C1;&#x30B8;&#x30EB;&#x30A8;&#x30BF;&#x30CE;&#x30FC;&#x30EB;&#x30A2;&#x30DF;&#x30F3;&#xFF08;PE&#xFF09;&#x8102;&#x8CEA;&#x3068;&#x7570;&#x306A;&#x3063;&#x3066;&#x3084;&#x308A;&#x53D6;&#x308A;&#x3059;&#x308B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3078;&#x306E;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x3092;&#x5F97;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x8102;&#x8CEA;&#x5C0F;&#x80DE;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x3068;&#x4E00;&#x7DD2;&#x306B;&#x5206;&#x5B50;&#x52D5;&#x529B;&#x5B66;&#xFF08;MD&#xFF09;&#x30B7;&#x30DF;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x86CD;&#x5149;&#x5206;&#x5149;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x304C;buforin II&#x306F;&#x3001;&#x7D14;&#x7C8B;&#x306A;PC&#x306E;&#x5C0F;&#x80DE;&#x3068;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3057;&#x306A;&#x3044;&#x3068;&#x3044;&#x3046;&#x4EE5;&#x524D;&#x306E;&#x4E3B;&#x5F35;&#x306B;&#x540C;&#x610F;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x306B;&#x3082;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x3001;&#x30B7;&#x30DF;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x4E2D;&#x306B;&#x30A2;&#x30CB;&#x30AA;&#x30F3;&#x6027;&#x306E;PG&#x819C;&#x5BFE;&#x4E2D;&#x6027;PC&#x819C;&#x306B;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x6E1B;&#x5C11;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C8;&#x30EA;&#x306F;&#x3001;&#x7D14;&#x7C8B;&#x306A;PG&#x819C;&#x3092;&#x901A;&#x3057;&#x3066;BF2&#x8EE2;&#x5EA7;&#x3067;&#x5B9F;&#x9A13;&#x7684;&#x306B;&#x89B3;&#x5BDF;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3068;&#x76F8;&#x95A2;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002; 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PE&#x306F;&#x3001;&#x4EE5;&#x524D;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;PE&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x4E0B;&#x3067;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;&#x305F;&#x8EE2;&#x5EA7;&#x3068;&#x76F8;&#x95A2;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x30B7;&#x30DF;&#x30E5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3067;&#x306F;&#x819C;&#x306E;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C8;&#x30EA;&#x3092;&#x3001;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x4E00;&#x7DD2;&#x306B;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x8102;&#x8CEA;&#x7D44;&#x6210;&#x7269;&#x306F;buforin II&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x3068;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x3069;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x5206;&#x5B50;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3067;&#x306E;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3001;&#x76EE;&#x7684;&#x306E;&#x6297;&#x83CC;&#x5264;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x7D30;&#x80DE;&#x6D78;&#x900F;&#x6027;&#x3092;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3092;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x52AA;&#x529B;&#x3067;&#x6709;&#x7528;&#x3067;&#x3042;&#x308D;&#x3046;&#x3002;

Buforin II&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x3068;&#x819C;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C8;&#x30EA;&#x306E;&#x8102;&#x8CEA;&#x7D44;&#x6210;&#x306E;&#x5F71;&#x97FF;

Buforin II is a 21-amino acid polycationic antimicrobial peptide derived from a peptide originally isolated from the stomach tissue of the Asian toad Bufo bufo gargarizans. It is hypothesized to target a wide range of bacteria by translocating into cells without membrane permeabilization and binding to nucleic acids. Previous research found that the structure and membrane interactions of buforin II are related to lipid composition. In this study, we used molecular dynamics (MD) simulations along with lipid vesicle experiments to gain insight into how buforin II interacts differently with phosphatidylcholine (PC), phosphatidylglycerol (PG), and phosphatidylethanolamine (PE) lipids. Fluorescent spectroscopic measurements agreed with the previous assertion that buforin II does not interact with pure PC vesicles. Nonetheless, the reduced entry of the peptide into anionic PG membranes versus neutral PC membranes during simulations correlates with the experimentally observed reduction in BF2 translocation through pure PG membranes. Simulations showing membrane entry into PC also provide insight into how buforin II may initially penetrate cell membranes. Our MD simulations also allowed us to consider how neutral PE lipids affect the peptide differently than PC. In particular, the peptide had a more helical secondary structure in simulations with PE lipids. A change in structure was also apparent in circular dichroism measurements. PE also reduced membrane entry in simulations, which correlates with decreased translocation in the presence of PE observed in previous studies. Together, these results provide molecular-level insight into how lipid composition can affect buforin II structure and function and will be useful in efforts to design peptides with desired antimicrobial and cell-penetrating properties.

Effect of lipid composition on buforin II structure and membrane entry.

Buforin II est un 21-amino-acide peptide polycationique antimicrobien d&#xE9;riv&#xE9; d&#x26;#39;un peptide isol&#xE9; &#xE0; l&#x26;#39;origine &#xE0; partir du tissu de l&#x26;#39;estomac asiatique crapaud gargarizans Bufo. Il est &#xE9;mis l&#x26;#39;hypoth&#xE8;se de cibler un large &#xE9;ventail de bact&#xE9;ries par translocation dans les cellules sans perm&#xE9;abilisation de la membrane et de se lier aux acides nucl&#xE9;iques. Des recherches ant&#xE9;rieures ont trouv&#xE9; que les interactions de structure et de la membrane de buforin II sont li&#xE9;s &#xE0; la composition lipidique. Dans cette &#xE9;tude, nous avons utilis&#xE9; la dynamique mol&#xE9;culaire (MD) des simulations avec les exp&#xE9;riences de v&#xE9;sicules lipidiques &#xE0; mieux comprendre comment buforin II interagit diff&#xE9;remment avec de la phosphatidylcholine (PC), le phosphatidylglyc&#xE9;rol (PG), et la phosphatidyl&#xE9;thanolamine (PE) des lipides. Fluorescentes mesures spectroscopiques d&#x26;#39;accord avec l&#x26;#39;affirmation pr&#xE9;c&#xE9;dente que buforin II n&#x26;#39;interagit pas avec les v&#xE9;sicules PC purs. N&#xE9;anmoins, l&#x26;#39;entr&#xE9;e r&#xE9;duite du peptide dans les membranes anioniques par rapport PG membranes neutres PC pendant simulations en corr&#xE9;lation avec la r&#xE9;duction observ&#xE9;e exp&#xE9;rimentalement dans BF2 translocation &#xE0; travers des membranes PG purs. Simulations montrant l&#x26;#39;entr&#xE9;e membrane dans PC fournissent &#xE9;galement des informations sur la fa&#xE7;on dont buforin II peut d&#x26;#39;abord p&#xE9;n&#xE9;trer les membranes cellulaires. Nos simulations de dynamique mol&#xE9;culaire nous a &#xE9;galement permis d&#x26;#39;examiner comment neutres lipides PE affectent le peptide diff&#xE9;remment que le PC. En particulier, le peptide a une structure plus h&#xE9;lico&#xEF;dale secondaire dans les simulations avec les lipides en PE. Un changement dans la structure s&#x26;#39;est &#xE9;galement manifest&#xE9;e dans les mesures de dichro&#xEF;sme circulaire. PE a &#xE9;galement r&#xE9;duit l&#x26;#39;entr&#xE9;e de membrane dans les simulations, ce qui correspond &#xE0; la translocation a diminu&#xE9; dans la pr&#xE9;sence de PE observ&#xE9;s dans les &#xE9;tudes pr&#xE9;c&#xE9;dentes. Ensemble, ces r&#xE9;sultats fournissent au niveau mol&#xE9;culaire de mieux comprendre comment la composition lipidique peut affecter buforin II structure et la fonction, et sera utile dans les efforts visant &#xE0; concevoir des peptides avec souhait&#xE9;es des propri&#xE9;t&#xE9;s antimicrobiennes et de p&#xE9;n&#xE9;tration cellulaire.

Effet de la composition lipidique sur Buforin II Structure et Entr&#xE9;e membrane

Buforin II ist ein 21-amino Acid Polycationic antimikrobiellen Peptid, ein Peptid, das isoliert urspr&uuml;nglich aus dem Magen-Gewebe der asiatischen Kr&ouml;te Bufo Bufo Gargarizans abgeleitet. Es ist die Hypothese eine Vielzahl von Bakterien unter an translocating in Zellen ohne Membrane Permeabilization und an Nukleins&auml;uren binden. Bisherige Untersuchungen gefunden Lipid-Zusammensetzung die Struktur und Membran Wechselwirkungen zwischen Buforin II verwandt sind. In dieser Studie haben wir Molekulardynamik (MD)-Simulationen zusammen mit Lipid Vesikel Experimente verwendet, um einen Einblick in die Interaktion Buforin II anders mit Phosphatidylcholin (PC), Phosphatidylglycerol (PG) und Phosphatidylethanolamin (PE) Lipide. Fluoreszierende spektroskopische Messungen stimmte die fr&uuml;here Behauptung, dass Buforin, die II keine Interaktion mit reinen PC-Bl&auml;schen bietet. Dennoch korreliert der reduzierte Eintrag des Peptids in anionischen PG-Membranen gegen&uuml;ber neutral PC-Membranen bei Simulationen mit der experimentell beobachtete R&uuml;ckgang der BF2 Translokation durch reines PG-Membranen. Simulationen Zeige Membran Eintrag in PC auch einen Einblick in wie Buforin II zun&auml;chst Zellmembranen durchdringen kann. Unsere MD-Simulationen konnten auch wir wie neutral PE Lipide beeinflussen das Peptid anders als PC betrachten. Das Peptid hatte insbesondere eine mehr spiralf&ouml;rmige Sekund&auml;rstruktur in Simulationen mit PE-Lipiden. Eine &Auml;nderung der Struktur zeigte sich auch bei Circulardichroismus Messungen. PE reduziert auch Membran-Eintrag in Simulationen, die mit verminderter Translokation in Anwesenheit von PE, die in fr&uuml;heren Studien beobachtet korreliert. Zusammen bieten diese Ergebnisse molekularer Ebene Einblick wie Lipid-Zusammensetzung Buforin II Struktur und Funktion beeinflussen kann und n&uuml;tzlich bei Bem&uuml;hungen um Peptide mit gew&uuml;nschten antimikrobielle und Zelle durchdringenden Eigenschaften zu entwerfen.

Wirkung der Lipid-Komposition auf Buforin II Struktur und Membran-Eintrag.

Buforin II &egrave; un peptide antimicrobico polycationic 21-amino acido derivato da un peptide originariamente isolato dal tessuto dello stomaco del rospo Bufo bufo gargarizans asiatico. Si &egrave; ipotizzato per una vasta gamma di batteri come destinazione di translocating nelle cellule senza permeabilization membrana e l&#39;associazione di acidi nucleici. Precedente ricerca ha scoperto che la struttura e la membrana interazioni di buforin II sono legate alla composizione lipidica. In questo studio, abbiamo utilizzato simulazioni di dinamica molecolare (MD) insieme con gli esperimenti di vescicola lipidici per comprendere in modo buforin II interagisce diversamente con fosfatidilcolina (PC), fosfatidilglicerolo (PG) e lipidi fosfatidiletanolammina (PE). Misurazioni spettroscopiche fluorescente concordano con la precedente affermazione che buforin che II non interagiscono con le vescicole PC pure. Tuttavia, la voce ridotta del peptide in anionici membrane PG versus membrane PC neutrale durante le simulazioni correla con la riduzione osservata sperimentalmente in BF2 traslocazione attraverso le membrane PG pure. Simulazioni mostrando anche membrana entrata PC permettono di percepire come buforin II inizialmente possono penetrare le membrane cellulari. Nostre simulazioni MD ci ha anche permesso di considerare effetto di lipidi neutro come PE il peptide diversamente da PC. In particolare, il peptide aveva una struttura secondaria elicoidale pi&ugrave; nelle simulazioni con lipidi PE. Un cambiamento nella struttura inoltre era evidente nelle misure di Dicroismo circolare. PE ridotto anche voce di membrana nelle simulazioni, che correla con traslocazione ridotta in presenza di PE osservata in studi precedenti. Insieme, questi risultati forniscono spaccato a livello molecolare come composizione lipidica pu&ograve; influenzare la funzione e buforin II struttura e sar&agrave; utile per gli sforzi per la progettazione di peptidi con propriet&agrave; cellula-penetrante e antimicrobico desiderato.

Effetto della composizione lipidica su ingresso buforin II struttura e membrana.

Buforin II&#xB294; 21 &#xC544;&#xBBF8;&#xB178; &#xC0B0; polycationic &#xD56D;&#xADE0; &#xC131; &#xD3A9;&#xD0C0;&#xC774;&#xB4DC; Bufo bufo gargarizans &#xC544;&#xC2DC;&#xC544; &#xB450; &#xAEBC; &#xBE44;&#xC758; &#xC704;&#xC7A5; &#xC870;&#xC9C1;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6D0;&#xB798; &#xACE0;&#xB9BD; &#xB41C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD30C;&#xC0DD; &#xB41C;. &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; permeabilization &#xC5C6;&#xC774; &#xC140;&#xC73C;&#xB85C; translocating&#xC744; &#xD575; &#xC0B0; &#xD558; &#xC5EC; &#xBC15;&#xD14C;&#xB9AC;&#xC544;&#xC758; &#xB113;&#xC740; &#xBC94;&#xC704;&#xB97C; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xAC00;&#xC124;&#xC744; &#xC138;&#xC6E0;&#xB2E4;. &#xC774;&#xC804; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB294; buforin II&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAD6C;&#xC870;&#xC640; &#xB9C9; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xAD6C;&#xC131;&#xC5D0; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xBC1C;&#xACAC;. &#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C;&#xB294; buforin II phosphatidylcholine (PC), phosphatidylglycerol (PG)&#xC640; phosphatidylethanolamine (PE) &#xC9C0;&#xC9C8; &#xB2E4;&#xB974;&#xAC8C; &#xC791;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825;&#xC744; &#xC5BB;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xAE30; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xD568;&#xAED8; &#xBD84;&#xC790; &#xC5ED;&#xD559; (MD) &#xC2DC;&#xBBAC;&#xB808;&#xC774;&#xC158;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD615;&#xAD11; &#xBD84; &#xAD11; &#xCE21;&#xC815; &#xD569;&#xC758; &#xC774;&#xC804; &#xC8FC;&#xC7A5; &#xADF8; buforin II &#xC21C;&#xC218; PC vesicles &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7FC;&#xC5D0;&#xB3C4; &#xBD88;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0;, &#xC2DC;&#xBBAC;&#xB808;&#xC774;&#xC158; &#xC911; &#xC911;&#xB9BD; PC &#xB9C9; &#xB300; &#xC74C;&#xC774;&#xC628; PG &#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C; &#xD3A9;&#xD0C0;&#xC774;&#xB4DC;&#xC758; &#xAC10;&#xC18C; &#xD56D;&#xBAA9; BF2 &#xC804; &#xC21C;&#xC218; PG &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C9;&#xC744; &#xD1B5;&#xD574; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xAD00;&#xCC30; &#xB41C; &#xAC10;&#xC18C;&#xC640; &#xC0C1;&#xAD00; &#xAD00;&#xACC4;&#xAC00;. &#xC2DC;&#xBBAC;&#xB808;&#xC774;&#xC158; &#xB610;&#xD55C; PC&#xC5D0; &#xB9C9; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC8FC;&#xB294; buforin II&#xC774; &#xC138;&#xD3EC; &#xB9C9; &#xCE68;&#xD22C; &#xCC98;&#xC74C; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; MD &#xC2DC;&#xBBAC;&#xB808;&#xC774;&#xC158;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xBA74; PC&#xC640; &#xB2E4;&#xB974;&#xAC8C; &#xC5B4;&#xB5BB;&#xAC8C; &#xC911;&#xB9BD; PE &#xC9C0; &#xC9C8;&#xC758; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC;&#xB97C; &#xACE0;&#xB824; &#xD558;&#xB294; &#xC788;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD2B9;&#xD788;, &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; PE &#xC9C0;&#xC9C8;&#xACFC; &#xC2DC;&#xBBAC;&#xB808;&#xC774;&#xC158;&#xC5D0; &#xB354; &#xD5EC;&#xB9AC;&#xCEEC; &#xC774;&#xCC28; &#xAD6C;&#xC870;&#xB97C; &#xD588;&#xB2E4;. &#xAD6C;&#xC870;&#xC5D0; &#xBCC0;&#xD654;&#xB97C; &#xC6D0;&#xD615; &#x9EC4; &#xCE21;&#xC815;&#xC5D0;&#xB3C4; &#xD588;&#xB2E4;. PE &#xB610;&#xD55C; &#xAC10;&#xC18C; &#xC804; &#xC774;&#xC804; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xAD00;&#xCC30; &#xB41C; PE&#xC758; &#xC874;&#xC7AC;&#xC640; &#xC5F0;&#xACB0; &#xD558;&#xB294; &#xC2DC;&#xBBAC;&#xB808;&#xC774;&#xC158;, &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xD56D;&#xBAA9; &#xAC10;&#xC18C;. &#xD568;&#xAED8;, &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC; &#xBD84;&#xC790; &#xC218;&#xC900;&#xC758; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xC870;&#xC131; buforin 2 &#xCC28; &#xAD6C;&#xC870;&#xC640; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBBF8;&#xCE60; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xACFC; &#xC6D0;&#xD558;&#xB294; &#xD56D;&#xADE0; &#xBC0F; &#xC140; &#xAD00;&#xD1B5; &#xC18D;&#xC131;&#xC73C;&#xB85C; &#xD3A9; &#xD2F0; &#xB4DC; &#xB514;&#xC790;&#xC778;&#xC758; &#xB178;&#xB825;&#xC5D0; &#xB3C4;&#xC6C0;&#xC774; &#xB420; &#xAC83;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Buforin 2 &#xCC28; &#xAD6C;&#xC870;&#xC640; &#xB9C9; &#xD56D;&#xBAA9;&#xC5D0; &#xC9C0;&#xC9C8; &#xC131;&#xBD84;&#xC758; &#xD6A8;&#xACFC;.

Buforin II es un 21-amino&#xE1;cido policati&#xF3;nico p&#xE9;ptido antimicrobiano derivado de un p&#xE9;ptido aislado originalmente del tejido del est&#xF3;mago de la asi&#xE1;tica gargarizans sapo Bufo bufo. Se postula para apuntar a una amplia gama de bacterias por translocaci&#xF3;n en c&#xE9;lulas sin permeabilizaci&#xF3;n de la membrana y la uni&#xF3;n a &#xE1;cidos nucleicos. La investigaci&#xF3;n anterior encontr&#xF3; que las interacciones de estructura y de la membrana de buforin II est&#xE1;n relacionados con la composici&#xF3;n lip&#xED;dica. En este estudio, hemos utilizado la din&#xE1;mica molecular (MD) simulaciones de experimentos, junto con las ves&#xED;culas de l&#xED;pidos para conocer mejor c&#xF3;mo buforin II interact&#xFA;a de manera diferente con la fosfatidilcolina (PC), fosfatidilglicerol (PG), y los l&#xED;pidos fosfatidiletanolamina (PE). Fluorescentes mediciones espectrosc&#xF3;picas de acuerdo con la afirmaci&#xF3;n anterior de que buforin II no interact&#xFA;a con las ves&#xED;culas de PC puros. No obstante, la entrada reducida del p&#xE9;ptido en las membranas ani&#xF3;nicas PG versus membranas neutras PC durante simulaciones se correlaciona con la reducci&#xF3;n observado experimentalmente en BF2 translocaci&#xF3;n a trav&#xE9;s de membranas PG puros. Las simulaciones que muestran la entrada de membrana en el PC tambi&#xE9;n se proporcionan datos sobre c&#xF3;mo buforin II al principio puede penetrar en las membranas celulares. Nuestras simulaciones MD tambi&#xE9;n nos ha permitido considerar como neutrales l&#xED;pidos PE afecta el p&#xE9;ptido diferente a PC. En particular, el p&#xE9;ptido ten&#xED;a una estructura secundaria m&#xE1;s helicoidal en simulaciones con los l&#xED;pidos de PE. Un cambio en la estructura era tambi&#xE9;n evidente en las mediciones de dicro&#xED;smo circular. PE tambi&#xE9;n se reduce la entrada de la membrana en las simulaciones, que se correlaciona con la disminuci&#xF3;n de la translocaci&#xF3;n en la presencia de PE observado en estudios previos. En conjunto, estos resultados proporcionan a nivel molecular idea de c&#xF3;mo puede afectar a la composici&#xF3;n lip&#xED;dica buforin estructura II y funci&#xF3;n, y ser&#xE1; &#xFA;til en los esfuerzos para dise&#xF1;ar p&#xE9;ptidos con propiedades antimicrobianas y deseados de c&#xE9;lulas penetrante.

Efecto de la Composici&#xF3;n de l&#xED;pidos en Buforin Estructura II y entrada de membrana

&#x62DF;&#x5357;&#x82A5;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x5305;&#x542B;&#x5728; AHA1 &#x548C; AHA2 &#x57FA;&#x56E0;&#x4E2D;&#x65AD;&#xFF0C;&#x4E24;&#x4E2A;&#x6700;&#x9AD8;&#x8868;&#x8FBE;&#x62DF;&#x5357;&#x82A5;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x819C; H &#x4E9A;&#x578B; (+)-ATPase &#x7684;&#x5BB6;&#x5EAD;&#xFF0C;&#x5F97;&#x5230;&#x5206;&#x79BB;&#x548C;&#x5B9A;&#x6027;&#x3002;&#x542B;&#x6709;&#x4EFB;&#x4E00;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EAF;&#x5408;&#x529F;&#x80FD;&#x635F;&#x5931;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x690D;&#x7269;&#x5728;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x4F1A;&#x6B63;&#x5E38;&#x751F;&#x957F;&#x3002;&#x8F6C;&#x5F55;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x548C;&#x8D28;&#x8C31;&#x6D4B;&#x91CF;&#x8BC1;&#x660E;&#x7F3A;&#x4E4F;&#x6740;&#x4F24;&#x529B;&#x7684;&#x5355;&#x57FA;&#x56E0;&#x7A81;&#x53D8;&#x4E0D;&#x662F;&#x53D7; RNA &#x6216;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x6C34;&#x5E73;&#x589E;&#x52A0;&#x5173;&#x8054;&#x7684;&#x8865;&#x507F;&#x3002;&#x9009;&#x62E9;&#x53CD;&#x5E94;&#x76D1;&#x6D4B;&#x4F7F;&#x7528;&#x5408;&#x6210;&#x91CD;&#x540C;&#x4F4D;&#x7D20;&#x6807;&#x8BB0; C &#x7EC8;&#x7AEF;&#x80F0;&#x9176;&#x80BD;&#x4E0E;&#x4E09;&#x91CD;&#x56DB;&#x6781;&#x8D28;&#x8C31;&#x8BA1;&#x7684;&#x5C16;&#x523A;&#x7684;&#x6807;&#x51C6;&#x663E;&#x793A;&#x66F4;&#x9AD8;&#x7684;&#x6C34;&#x5E73;&#x7684;&#x78F7;&#x9178;&#x5316;&#x8FD9;&#x4E24;&#x4E2A;&#x4E9A;&#x578B;&#x57FA;&#x56E0;&#x7A81;&#x53D8;&#x5728;&#x89C4;&#x7BA1;&#x82CF;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x7559;&#x3002;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x6839;&#x7684;&#x4F53;&#x5185; ATPase &#x6D3B;&#x6027;&#x7684;&#x63AA;&#x65BD;&#x4F7F;&#x7528;&#x80DE;&#x5916; pH &#x6D4B;&#x5B9A;&#xFF0C;&#x5206;&#x6CCC;&#x6D3B;&#x52A8;&#x5C11;&#x8D28;&#x5B50;&#x4E2D;&#x627E; aha2 &#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x3002;&#x9664; 100 &#x4E0D;&#x540C;&#x751F;&#x957F;&#x6761;&#x4EF6;&#xFF0C;&#x51CF;&#x5C11;&#x819C;&#x7535;&#x4F4D; (&#x9AD8;&#x5916;&#x90E8;&#x94BE;) &#x6216; pH &#x68AF;&#x5EA6; &#xFF08;&#x5916;&#x90E8;&#x9AD8; ph &#x503C;&#xFF09; aha2 &#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x7684;&#x589E;&#x957F;&#x9020;&#x6210;&#x51CF;&#x5C11;&#x90A3;&#x4E9B;&#x4E0E;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x76F8;&#x6BD4;&#x3002;&#x5C3D;&#x7BA1;&#x5355;&#x4E2A;&#x7A81;&#x53D8;&#x7406;&#x60F3;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x751F;&#x957F;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x7684;&#x6B63;&#x5E38;&#x5916;&#x89C2;&#xFF0C;&#x5305;&#x542B;&#x53CC;&#x5408;&#x5B50;&#x7A81;&#x53D8;&#x7684;&#x80DA;&#x80CE;&#x662F;&#x81F4;&#x547D;&#x7684;&#x8FD9;&#x8868;&#x660E;&#xFF0C;&#x5982;&#x6240;&#x6599;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x79CD;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7EDD;&#x5BF9;&#x5FC5;&#x8981;&#x7684;&#x690D;&#x7269;&#x7EC6;&#x80DE;&#x529F;&#x80FD;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x8BC1;&#x660E;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x57FA;&#x56E0;&#x4E00;&#x8D77;&#x6267;&#x884C;&#x57FA;&#x672C;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x548C;&#x5176;&#x5355;&#x4E00;&#x57FA;&#x56E0;&#x7A81;&#x53D8;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x7531;&#x91CD;&#x53E0;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x548C;&#x5197;&#x4F59;&#x529F;&#x80FD;&#x6A21;&#x5F0F;&#x4EE5;&#x53CA;&#x8865;&#x507F;&#x53CA;&#x5176;&#x7C7B;&#x4F3C;&#x7269;&#x4E00;&#x7EA7;&#x5927;&#x591A;&#x4F1A;&#x88AB;&#x5C4F;&#x853D;&#x3002;

&#x53D8;&#x5F02;&#x62DF;&#x5357;&#x82A5;&#x690D;&#x7269;&#x4E0E;&#x964D;&#x4F4E;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x819C;&#x8D28;&#x5B50;&#x6CF5;&#x6D3B;&#x6027;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x8868;&#x5F81;&#x3002;

Arabidopsis mutants containing gene disruptions in AHA1 and AHA2, the two most highly expressed isoforms of the Arabidopsis plasma membrane H(+)-ATPase family, have been isolated and characterized. Plants containing homozygous loss-of-function mutations in either gene grew normally under laboratory conditions. Transcriptome and mass spectrometric measurements demonstrate that lack of lethality in the single gene mutations is not associated with compensation by increases in RNA or protein levels. Selected reaction monitoring using synthetic heavy isotope-labeled C-terminal tryptic peptides as spiked standards with a triple quadrupole mass spectrometer revealed increased levels of phosphorylation of a regulatory threonine residue in both isoforms in the mutants. Using an extracellular pH assay as a measure of in vivo ATPase activity in roots, less proton secreting activity was found in the aha2 mutant. Among 100 different growth conditions, those that decrease the membrane potential (high external potassium) or pH gradient (high external pH) caused a reduction in growth of the aha2 mutant compared with wild type. Despite the normal appearance of single mutants under ideal laboratory growth conditions, embryos containing homozygous double mutations are lethal, demonstrating that, as expected, this protein is absolutely essential for plant cell function. In conclusion, our results demonstrate that the two genes together perform an essential function and that the effects of their single mutations are mostly masked by overlapping patterns of expression and redundant function as well as by compensation at the post-translational level.

Molecular characterization of mutant Arabidopsis plants with reduced plasma membrane proton pump activity.

Mutants d&#39;Arabidopsis contenant des perturbations de g&egrave;ne d&#39;AHA1 et AHA2, les deux plus fortement exprim&eacute;e isoformes de la membrane plasmique de Arabidopsis H (+)-famille de l&#39;ATPase, ont &eacute;t&eacute; isol&eacute;s et caract&eacute;ris&eacute;s. Plantes contenant des mutations perte de fonction homozygotes du g&egrave;ne soit croissent normalement dans des conditions de laboratoire. Transcriptome et mesures par spectrom&eacute;trie de masse d&eacute;montrent que le manque de d&eacute;termination de la l&eacute;talit&eacute; dans les mutations du g&egrave;ne unique n&#39;est pas associ&eacute;e &agrave; la compensation par l&#39;augmentation des niveaux d&#39;ARN ou prot&eacute;ine. S&eacute;lectionn&eacute; de surveillance &agrave; l&#39;aide de lourds isotopique marqu&eacute; C-terminal tryptiques peptides synth&eacute;tiques comme normes enrichis avec un spectrom&egrave;tre de masse quadripolaire triple a r&eacute;v&eacute;l&eacute; des niveaux accrus de la phosphorylation des r&eacute;sidus thr&eacute;onine r&eacute;glementaires dans les deux isoformes chez les mutants. &Agrave; l&#39;aide d&#39;un test de pH extracellulaire comme mesure de l&#39;activit&eacute; ATPase in vivo dans les racines, moins proton s&eacute;cr&eacute;tant l&#39;activit&eacute; a &eacute;t&eacute; trouv&eacute; chez le mutant aha2. Parmi 100 diff&eacute;rentes conditions de croissance, ceux qui diminuent le potentiel de membrane (forte concentration de potassium externe) ou un gradient de pH (pH externe haute) a entra&icirc;n&eacute; une r&eacute;duction de la croissance du mutant aha2 par rapport &agrave; la souche sauvage. Malgr&eacute; l&#39;apparition normale des mutants simples dans des conditions de croissance id&eacute;ales de laboratoire, les embryons contenant des mutations homozygotes doubles sont l&eacute;tales, d&eacute;montrant que, comme pr&eacute;vu, cette prot&eacute;ine est absolument essentielle pour la fonction des cellules v&eacute;g&eacute;tales. En conclusion, nos r&eacute;sultats d&eacute;montrent que les deux g&egrave;nes r&eacute;alisent ensemble une fonction essentielle et que les effets de leurs mutations unique sont pour la plupart masqu&eacute;s en superposant des modes d&#39;expression et la fonction redondante, ainsi que par la r&eacute;mun&eacute;ration post-traductionnelle.

Caract&eacute;risation mol&eacute;culaire des plantes mutantes de Arabidopsis avec activit&eacute; de pompe de proton r&eacute;duit la membrane plasmique.

Mutantes de Arabidopsis que contienen alteraciones del gen en AHA1 y AHA2, los dos m&aacute;s altamente expresan isoformas de la membrana plasm&aacute;tica de Arabidopsis H (+)-familia de la ATPasa, se han aislado y caracterizado. Las plantas que contienen mutaciones homocig&oacute;ticas de p&eacute;rdida de funci&oacute;n en cualquiera de los dos genes crecieron normalmente bajo condiciones de laboratorio. Transcriptoma y espectrometr&iacute;a de masa medidas demuestran que falta de mortalidad en las mutaciones del gen &uacute;nico no se asocia con compensaci&oacute;n por aumentos en los niveles de ARN o prote&iacute;na. Reacci&oacute;n seleccionada monitoreo utilizando pesados marcados con is&oacute;topos c-terminal tr&iacute;pticos p&eacute;ptidos sint&eacute;ticos como normas inoculadas con un espectr&oacute;metro de masas de triple cuadrupolo revelaron niveles crecientes de fosforilaci&oacute;n de un residuo de treonina reglamentario en ambas isoformas de los mutantes. Usando un an&aacute;lisis de pH extracelular como una medida de la actividad in vivo de la ATPasa en ra&iacute;ces, menos protones secretoras de actividad fue encontrada en el mutante aha2. Entre 100 diferentes condiciones de crecimiento, los que disminuyen el potencial de membrana (alto potasio externo) o gradiente de pH (pH alto externa) ha provocado una reducci&oacute;n en el crecimiento del mutante aha2 en comparaci&oacute;n con el tipo salvaje. A pesar de la apariencia normal de mutantes solos bajo condiciones de crecimiento ideales de laboratorio, embriones que contienen mutaciones homocig&oacute;ticas dobles son letales, demostrando que, como era de esperar, esta prote&iacute;na es absolutamente esencial para la funci&oacute;n de la c&eacute;lula vegetal. En conclusi&oacute;n, nuestros resultados demuestran que los dos genes juntos realizan una funci&oacute;n esencial y que los efectos de sus solas mutaciones son en su mayor&iacute;a enmascarados mediante la superposici&oacute;n de patrones de expresi&oacute;n y funci&oacute;n redundante, as&iacute; como por la compensaci&oacute;n del nivel de la poste-de translaci&oacute;n.

Caracterizaci&oacute;n molecular de plantas mutantes de Arabidopsis con actividad de bomba de protones reducida de membrana plasm&aacute;tica.

Arabidopsis Mutanten mit Gen Unterbrechungen bei AHA1 und AHA2, die beiden am meisten hoch ausgedr&uuml;ckt Isoformen der Plasmamembran Arabidopsis H (+)-ATPase-Familie, wurden isoliert und charakterisiert. Pflanzen mit homozygote Loss of Function-Mutationen im entweder gen wachsen normalerweise unter Laborbedingungen. Transkriptom und massenspektrometrischen Messungen zeigen, dass mangelnde Letalit&auml;t in den einzelnen Gen-Mutationen keine Entsch&auml;digung durch Erh&ouml;hungen der RNS oder Protein Ebenen zugeordnet. Ausgew&auml;hlte Reaction monitoring mit synthetischen schwere Isotop mit der Bezeichnung C-terminalen tryptic Peptide wie Spike Standards mit einem triple Quadrupol-Massenspektrometer umfassendere Phosphorylierung von regulatorischen Threonin R&uuml;ckst&auml;nde in beiden Isoformen in Mutanten offenbart. Verwenden eine extrazellul&auml;re pH-Assay als Ma&szlig; f&uuml;r die in-vivo-ATPase-Aktivit&auml;t in den Wurzeln, weniger Proton sezernierende Aktivit&auml;t der Mutant aha2 fand. Unter 100 verschiedenen Wachstumsbedingungen gegen&uuml;ber denjenigen, die die Membran potenzielle (hohe externe Kalium) oder den pH-Wert Farbverlauf (hohen externen pH-Wert) verursacht eine Verringerung der Wachstum von den aha2-Mutanten zu verringern Wildtyp. Trotz der normalen Darstellung der einzelnen Mutanten unter idealen Laborbedingungen Wachstum sind Embryonen mit homozygote doppelte Mutationen t&ouml;dlich, zeigen, dass, wie erwartet, dieses Protein unabdingbar f&uuml;r Pflanzen-Zelle-Funktion. Abschlie&szlig;end zeigen unsere Ergebnisse, dass die beiden Gene zusammen eine wesentliche Funktion ausf&uuml;hren und die Auswirkungen ihrer einzelnen Mutationen meist durch &uuml;berlappende Muster von Ausdruck und redundante Funktion sowie Entsch&auml;digung auf POSTTRANSLATIONELLE Ebene maskiert werden.

Molekulare Charakterisierung von mutant Arabidopsis-Pflanzen mit reduzierten Plasmamembran Proton Pumpe T&auml;tigkeit.

Mutanti di Arabidopsis contenente interruzioni gene in AHA1 e AHA2, i due pi&ugrave; altamente espresso isoforme della membrana del plasma di Arabidopsis H (+)-famiglia di ATPasi, sono stati isolati e caratterizzati. Piante contenenti mutazioni omozigoti perdita di funzione nel gene sia crebbero normalmente in condizioni di laboratorio. Transcriptome e misure di spettrometrihe di massa dimostrano che mancanza di letalit&agrave; nelle mutazioni di singolo gene non &egrave; associato con compensazione da aumenti nei livelli di RNA e delle proteine. Reazione selezionata monitoraggio utilizzando pesanti marcato con isotopo C-terminale triptico peptidi sintetici come standard a spillo con uno spettrometro di massa triplo quadrupolo rivelato aumento dei livelli di fosforilazione di un residuo di treonina normativo in due isoforme i mutanti. Meno protone secernenti attivit&agrave; utilizzando un dosaggio di pH extracellulare come una misura dell&#39;attivit&agrave; dell&#39;ATPasi in vivo nelle radici, &egrave; stato trovato nel mutante aha2. Tra 100 condizioni di crescita differenti, quelle che diminuiscono il potenziale di membrana (potassio esterno) o gradiente di pH (pH esterno alto) ha causato una riduzione nella crescita del mutante aha2 confrontato con wild type. Nonostante l&#39;aspetto normale della singole mutanti in condizioni di crescita ideale laboratorio, embrioni contenenti mutazioni omozigoti doppie sono letali, dimostrando che, come previsto, questa proteina &egrave; assolutamente essenziale per la funzione delle cellule vegetali. In conclusione, i nostri risultati dimostrano che i due geni insieme eseguono una funzione essenziale e che gli effetti delle loro singole mutazioni sono per lo pi&ugrave; mascherati da sovrapposizione pattern di espressione e la funzione ridondante nonch&eacute; di compensazione a livello di alberino-di traduzione.

Caratterizzazione molecolare di piante mutanti di Arabidopsis con membrana plasmatica ridotta attivit&agrave; di pompa protonica.

&#x30B7;&#x30ED;&#x30A4;&#x30CC;&#x30CA;&#x30BA;&#x30CA;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x4F53; AHA1 &#x3068; AHA2 &#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x6DF7;&#x4E71;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3001;2 &#x3064;&#x306E;&#x6700;&#x3082;&#x9AD8;&#x3044;&#x30A2;&#x30A4;&#x30BD; &#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0; &#x30B7;&#x30ED;&#x30A4;&#x30CC;&#x30CA;&#x30BA;&#x30CA;&#x5F62;&#x8CEA;&#x819C; H &#x306E; (+) &#x3092;&#x8868;&#x660E;-ATPase &#x5BB6;&#x65CF;&#x5206;&#x96E2;&#x3057;&#x3001;&#x7279;&#x5FB4;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3069;&#x3061;&#x3089;&#x304B;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x30DB;&#x30E2;&#x63A5;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x55AA;&#x5931;&#x5909;&#x7570;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x690D;&#x7269;&#x306F;&#x901A;&#x5E38;&#x5B9F;&#x9A13;&#x5BA4;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x3067;&#x80B2;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30E0;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x8CEA;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x5358;&#x4E00;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x3067;&#x81F4;&#x6B7B;&#x6027;&#x306E;&#x6B20;&#x5982;&#x304C; RNA &#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x88DC;&#x511F;&#x3068;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x30B9;&#x30D1;&#x30A4;&#x30AF;&#x6A19;&#x6E96;&#x30C8;&#x30EA;&#x30D7;&#x30EB;&#x56DB;&#x91CD;&#x6975;&#x8CEA;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x8A08;&#x306B;&#x30EA;&#x30F3;&#x9178;&#x5316;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x30A2;&#x30A4;&#x30BD; &#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306E;&#x898F;&#x5236;&#x30B9;&#x30EC;&#x30AA;&#x30CB;&#x30F3;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x91CD;&#x3044;&#x540C;&#x4F4D;&#x4F53;&#x6A19;&#x8B58; C &#x30BF;&#x30FC;&#x30DF;&#x30CA;&#x30EB; &#x30C8;&#x30EA;&#x30D7;&#x30B7;&#x30F3; &#x30DA;&#x30D7;&#x30C1;&#x30C9;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F;&#x53CD;&#x5FDC;&#x3092;&#x76E3;&#x8996;&#x3092;&#x9078;&#x629E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6839;&#x306E; in vivo &#x306E; ATPase &#x6D3B;&#x6027;&#x306E;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x7D30;&#x80DE;&#x5916; pH &#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x30A2;&#x30AF;&#x30C6;&#x30A3;&#x30D3;&#x30C6;&#x30A3;&#x3092;&#x5206;&#x6CCC;&#x3059;&#x308B;&#x5C11;&#x306A;&#x3044;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30F3; aha2 &#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x304C;&#x898B;&#x3064;&#x304B;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3067;&#x3057;&#x305F;&#x3002;100 &#x306E;&#x7570;&#x306A;&#x3063;&#x305F;&#x6210;&#x9577;&#x6761;&#x4EF6;&#x306E;&#x4E2D;&#x3067;&#x305D;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x819C;&#x96FB;&#x4F4D; (&#x5916;&#x90E8;&#x9AD8;&#x30AB;&#x30EA;&#x30A6;&#x30E0;&#xFF09; &#x307E;&#x305F;&#x306F; aha2 &#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306E;&#x6210;&#x9577;&#x306B;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3092;&#x5F15;&#x304D;&#x8D77;&#x3053;&#x3057;&#x305F; pH &#x52FE;&#x914D; &#xFF08;&#x5916;&#x90E8;&#x9AD8; pH&#xFF09; &#x6E1B;&#x5C11;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x3066;&#x304F;&#x3060;&#x3055;&#x3044;&#x3002;&#x7406;&#x60F3;&#x7684;&#x306A;&#x6210;&#x9577;&#x6761;&#x4EF6;&#x306E;&#x4E0B;&#x3067;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306E;&#x901A;&#x5E38;&#x306E;&#x5916;&#x89B3;&#x306B;&#x3082;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x3001;&#x30DB;&#x30E2;&#x63A5;&#x5408;&#x4E8C;&#x91CD;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x80DA;&#x81F4;&#x6B7B;&#x3001;&#x4E88;&#x60F3;&#x901A;&#x308A;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x304C;&#x690D;&#x7269;&#x7D30;&#x80DE;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306B;&#x4E0D;&#x53EF;&#x6B20;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x7D50;&#x8AD6;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F; 2 &#x3064;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x304C;&#x4E00;&#x7DD2;&#x306B;&#x4E0D;&#x53EF;&#x6B20;&#x306A;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x5B9F;&#x884C;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3068;&#x3001;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x52B9;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x307B;&#x3068;&#x3093;&#x3069;&#x7FFB;&#x8A33;&#x5F8C;&#x4FEE;&#x98FE;&#x306E;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x88DC;&#x6B63;&#x3068;&#x540C;&#x69D8;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x8868;&#x73FE;&#x3068;&#x5197;&#x9577;&#x95A2;&#x6570;&#x306E;&#x91CD;&#x306A;&#x308A;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x30DE;&#x30B9;&#x30AF;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x524A;&#x6E1B;&#x306E;&#x539F;&#x5F62;&#x8CEA;&#x819C;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30F3; &#x30DD;&#x30F3;&#x30D7;&#x6D3B;&#x6027;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x30B7;&#x30ED;&#x30A4;&#x30CC;&#x30CA;&#x30BA;&#x30CA;&#x690D;&#x7269;&#x306E;&#x5206;&#x5B50;&#x89E3;&#x6790;

Arabidopsis &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC911;&#xB2E8; aha1&#xC640; aha2&#xC5D0; &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C;, &#xAC00;&#xC7A5; &#xB192;&#xC740; &#xD45C;&#xD604; isoforms Arabidopsis &#xC6D0;&#xD615;&#xC9C8; &#xB9C9; H&#xC758; (+)-ATPase &#xAC00;&#xC871;, &#xC808;&#xC5F0; &#xBC0F; &#xD2B9;&#xC9D5;. &#xC2DD;&#xBB3C; homozygous &#xC190;&#xC2E4;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC758; &#xBCC0;&#xC774; &#xC5B4;&#xB290; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC5D0; &#xD3EC;&#xD568; &#xB41C; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC2E4; &#xC870;&#xAC74;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC815;&#xC0C1;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC131;&#xC7A5; &#xD588;&#xB2E4;. Transcriptome &#xBC0F; &#xB300;&#xB7C9; spectrometric &#xCE21;&#xC815; &#xB2E8;&#xC77C; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xBCC0;&#xC774;&#xC5D0; &#xCE58; &#xC0AC; &#xC728;&#xC758; &#xBD80;&#xC871; RNA &#xB610;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC218;&#xC900;&#xC758; &#xC99D;&#xAC00; &#xC758;&#xD574; &#xBCF4;&#xC0C1;&#xC640; &#xC5F0;&#xACB0; &#xB418;&#xC5B4; &#xC788;&#xB294;&#xC9C0; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xBC18;&#xC751; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xD2B8;&#xB9AC;&#xD50C; quadrupole &#xC9C8;&#xB7C9; &#xBD84;&#xC11D;&#xAE30;&#xC640; &#xC544;&#xAD70;&#xB41C; &#xD45C;&#xC900; &#xACF5;&#xAC1C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC5D0; &#xB450; isoforms&#xC5D0; &#xADDC;&#xC81C; &#xD2B8;&#xB808;&#xC624;&#xB2CC; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC758; &#xC778; &#xC0B0;&#xD654;&#xC758; &#xC218;&#xC900;&#xC774; &#xD5A5;&#xC0C1;&#xB41C; &#xD569;&#xC131; &#xBB34;&#xAC70;&#xC6B4; &#xB3D9;&#xC704; &#xC6D0;&#xC18C; &#xBD84;&#xB958; C &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; &#xD3A9; &#xD2F0; tryptic &#xB4DC;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC120;&#xD0DD; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC138;&#xD3EC; &#xC678; &#xC0B0;&#xB3C4; &#xBD84;&#xC11D; &#xACB0;&#xACFC; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xBFCC;&#xB9AC;&#xC5D0; in vivo ATPase &#xD65C;&#xB3D9;&#xC758; &#xC218;&#xB2E8;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC740;&#xB2C9; &#xD65C;&#xB3D9; &#xC801;&#xC740; &#xC591;&#xC131;&#xC790; aha2 &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xCCB4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC1C;&#xACAC; &#xB410;&#xB2E4;. 100 &#xB2E4;&#xB978; &#xC131;&#xC7A5; &#xC870;&#xAC74; &#xC911;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; (&#xB192;&#xC740; &#xC678;&#xBD80; &#xCE7C;&#xB968;) &#xB610;&#xB294; pH &#xADF8;&#xB77C;&#xB370;&#xC774;&#xC158; (&#xB192;&#xC740; &#xC678;&#xBD80; &#xC804;&#xD654;) aha2 &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xC131;&#xC7A5; &#xAC10;&#xC18C; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xAC10;&#xC18C;&#xB294; &#xC57C;&#xC0DD; &#xD0C0;&#xC785;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574;. &#xC774;&#xC0C1;&#xC801;&#xC778; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC2E4; &#xC131;&#xC7A5; &#xC870;&#xAC74; &#xD558;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB2E8;&#xC77C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC758; &#xC815;&#xC0C1;&#xC801;&#xC778; &#xBAA8;&#xC2B5;&#xC5D0;&#xB3C4; &#xBD88;&#xAD6C; &#xD558; &#xACE0; &#xBC30;&#xC544; &#xB354;&#xBE14; homozygous &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xD3EC;&#xD568; &#xD558;&#xB294; &#xCE58;&#xBA85;&#xC801;&#xC778;, &#xC608;&#xC0C1; &#xB300;&#xB85C;,&#xC774; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC774; &#xC808;&#xB300;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC2DD;&#xBB3C; &#xC138;&#xD3EC; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778;, &#xC785;&#xC99D;. &#xACB0;&#xB860;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xB450; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xAC00; &#xD568;&#xAED8; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xC218;&#xD589; &#xD558; &#xACE0; &#xB2E8;&#xC77C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xB4E4;&#xC758; &#xD6A8;&#xACFC; &#xB2E2; &#xC218;&#xC900;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCF4;&#xC0C1; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xD45C;&#xD604;&#xACFC; &#xC911;&#xBCF5; &#xD568;&#xC218; &#xD328;&#xD134;&#xC744; &#xACB9;&#xCCD0;&#xC11C; &#xB9C8;&#xC2A4;&#xD06C; &#xB300;&#xBD80;&#xBD84; &#xC785;&#xC99D;.

&#xAC10;&#xC18C; &#xB41C; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xC591;&#xC131;&#xC790; &#xD38C;&#xD504; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xAC00;&#xC9C4; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; Arabidopsis &#xC2DD;&#xBB3C;&#xC758; &#xBD84;&#xC790; &#xD2B9;&#xC131; &#xBD84;&#xC11D;.

Rachel B. Nelson

Department of Chemistry

Wellesley College

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Rachel B. Nelson

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Department of Chemistry

Wellesley College

Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Department of Chemistry