Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins <em>in situ</em> with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Worcester Polytechnic Institute

Oligosaccharyl transf&#xE9;rase fait partie de la machinerie macromol&#xE9;culaire qui traite des prot&#xE9;ines naissantes dans le r&#xE9;ticulum endoplasmique. L&#x26;#39;enzyme est hautement conserv&#xE9;e, catalyse la premi&#xE8;re &#xE9;tape de la biosynth&#xE8;se des N-glycoprot&#xE9;ines li&#xE9;es et agit comme un &#xAB;gardien&#xBB; pour la voie de s&#xE9;cr&#xE9;tion. De plus en plus des prot&#xE9;ines associ&#xE9;es &#xE0; transf&#xE9;rase oligosaccharyl sont identifi&#xE9;s, les subtilit&#xE9;s de l&#x26;#39;enzyme et la relation avec d&#x26;#39;autres prot&#xE9;ines dans la lumi&#xE8;re du r&#xE9;ticulum endoplasmique commencent &#xE0; &#xEA;tre &#xE9;lucid&#xE9;.

Transf&#xE9;rase Oligosaccharyl: Gatekeeper pour la voie de s&#xE9;cr&#xE9;tion

Oligosaccharyltransferase: Gatekeeper zu den sekretorischen Weg.

Oligosaccharyl transferasi sono parte del macchinario macromolecolare che elabora le proteine nascenti nel reticolo endoplasmatico. L&#39;enzima &egrave; altamente conservata, catalizza la seguente il passo iniziale nella biosintesi di glicoproteine N-linked e agisce come un &#39;custode&#39; per la via secretiva. Come vengono identificate pi&ugrave; proteine associate oligosaccharyl trasferasi, la complessit&agrave; dell&#39;enzima e la relazione con altre proteine nel lume del reticolo endoplasmatico stanno iniziando ad essere svelati.

Oligosaccharyl transferasi: gatekeeper del percorso secretorio.

Oligosaccharyl &#x8F6C;&#x79FB;&#x9176;&#x662F;&#x673A;&#x68B0;&#x7684;&#x5927;&#x5206;&#x5B50;&#x5904;&#x7406;&#x65B0;&#x751F;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x5728;&#x5185;&#x8D28;&#x7F51;&#x4E2D;&#x7684;&#x4E00;&#x90E8;&#x5206;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x9176;&#x9AD8;&#x4FDD;&#x5B88;&#x3001; &#x50AC;&#x5316; N &#x94FE;&#x63A5;&#x7CD6;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x5408;&#x6210;&#x4E2D;&#x7684;&#x521D;&#x59CB;&#x6B65;&#x9AA4;&#x548C;&#x5145;&#x5F53;&#x5206;&#x6CCC;&#x9014;&#x5F84;&#x7684;&#x5B88;&#x95E8;&#x4EBA;&#x3002;&#x66F4;&#x591A;&#x76F8;&#x5173;&#x86CB;&#x767D;&#x7684; oligosaccharyl &#x8F6C;&#x79FB;&#x9176;&#x662F;&#x786E;&#x5B9A;&#x7684;&#x3001; &#x9519;&#x7EFC;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x9176;&#x53CA;&#x4E0E;&#x5176;&#x4ED6;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x5728;&#x5185;&#x8D28;&#x7F51;&#x8154;&#x7684;&#x5173;&#x7CFB;&#x5F00;&#x59CB;&#x88AB;&#x89E3;&#x5F00;&#x3002;

Oligosaccharyl &#x8F6C;&#x79FB;&#x9176;&#xFF1A; &#x5206;&#x6CCC;&#x9014;&#x5F84;&#x7684;&#x5B88;&#x95E8;&#x4EBA;&#x3002;

Oligosaccharyl transferase is part of the macromolecular machinery that processes nascent proteins in the endoplasmic reticulum. The enzyme is highly conserved, catalyzes the initial step in the biosynthesis of N-linked glycoproteins and acts as a 'gatekeeper' for the secretory pathway. As more proteins associated with oligosaccharyl transferase are identified, the intricacies of the enzyme and the relationship with other proteins in the lumen of the endoplasmic reticulum are starting to be unraveled.

Oligosaccharyl transferase: gatekeeper to the secretory pathway.

&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;Oligosaccharyl&#x306F;&#x3001;&#x5C0F;&#x80DE;&#x4F53;&#x5185;&#x3067;&#x65B0;&#x751F;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x51E6;&#x7406;&#x3059;&#x308B;&#x9AD8;&#x5206;&#x5B50;&#x6A5F;&#x68B0;&#x306E;&#x4E00;&#x90E8;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x9175;&#x7D20;&#x306F;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x306B;&#x4FDD;&#x5B58;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x5206;&#x6CCC;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E; &#x26;quot;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C8;&#x30AD;&#x30FC;&#x30D1;&#x30FC;&#x26;quot;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x306E;N-&#x7D50;&#x5408;&#x578B;&#x7CD6;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x884C;&#x70BA;&#x306E;&#x751F;&#x5408;&#x6210;&#x306E;&#x6700;&#x521D;&#x306E;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x306F;&#x3001;&#x89E6;&#x5A92;&#x3059;&#x308B;&#x3002; oligosaccharyl&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x304C;&#x540C;&#x5B9A;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3068;&#x3001;&#x9175;&#x7D20;&#x3068;&#x5C0F;&#x80DE;&#x4F53;&#x306E;&#x5185;&#x8154;&#x306B;&#x4ED6;&#x306E;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3068;&#x306E;&#x95A2;&#x4FC2;&#x306E;&#x8907;&#x96D1;&#x3055;&#x306F;&#x89E3;&#x660E;&#x3055;&#x308C;&#x59CB;&#x3081;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002;

Oligosaccharyl&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#xFF1A;&#x5206;&#x6CCC;&#x7D4C;&#x8DEF;&#x3078;&#x306E;&#x30B2;&#x30FC;&#x30C8;&#x30AD;&#x30FC;&#x30D1;&#x30FC;

Oligosaccharyl&#xACFC; &#xACE0;&#xBD84;&#xC790; &#xAE30;&#xACC4; endoplasmic &#xADF8;&#xBB3C;&#xC5D0; &#xCD08;&#xAE30; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC744; &#xCC98;&#xB9AC; &#xD558;&#xB294; &#xBD80;&#xBD84;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD6A8;&#xC18C; &#xACE0;&#xB3C4;&#xB85C; &#xBCF4;&#xC874; &#xD558; &#xACE0; N &#xC5F0;&#xACB0; &#xB41C; glycoproteins&#xC758; &#xC0DD; &#xD569;&#xC131;&#xC5D0;&#xC11C; &#xCD08;&#xAE30; &#xB2E8;&#xACC4; catalyzes &#xBD84; &#xD1B5;&#xB85C; &#xB300; &#xD55C; &#39;&#xAC8C;&#xC774;&#xD2B8; &#xD0A4;&#xD37C;&#39; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744;. Oligosaccharyl&#xACFC; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xB354; &#xB9CE;&#xC740; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC740; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xB41C; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC640; &#xB2E4;&#xB978; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC5D0; endoplasmic &#xADF8;&#xBB3C; &#xB8E8;&#xBA58;&#xACFC; &#xAD00;&#xACC4;&#xC758; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; raveled &#xC218; &#xC2DC;&#xC791; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Oligosaccharyl&#xACFC;: &#xBD84; &#xD1B5;&#xB85C;&#xC5D0; &#xAC8C;&#xC774;&#xD2B8; &#xD0A4;&#xD37C;.

Oligosaccharyl transferasa es parte de la maquinaria macromolecular que procesa las prote&#xED;nas nacientes en el ret&#xED;culo endopl&#xE1;smico. La enzima es altamente conservadas, cataliza el paso inicial en la bios&#xED;ntesis de glicoprote&#xED;nas N-ligadas y act&#xFA;a como un &#x26;quot;portero&#x26;quot; para la v&#xED;a secretora. A medida que m&#xE1;s prote&#xED;nas asociadas con oligosaccharyl transferasa se identifican, las complejidades de la enzima y la relaci&#xF3;n con otras prote&#xED;nas en el lumen del ret&#xED;culo endopl&#xE1;smico est&#xE1;n empezando a ser descifrado.

Transferasa Oligosaccharyl: Guardi&#xE1;n de la ruta secretora

Oligosaccharyl transferasi (OT) catalizza il primo passaggio impegnato nella proteina N-linked glicosilazione, un processo co-translational che si verifica nel lume del reticolo endoplasmatico. Complesso enzimatico del lievito Saccharomyces cerevisiae comprende nove proteine integrali di membrana, cinque dei quali sono essenziali per la catalisi. A causa delle sfide con il complesso enzima attivo di purificazione per studi biofisici dettagliati, uno studio sistematico di esprimere, isolare e caratterizzano i domini solubili di tre delle pi&ugrave; grande subunit&agrave; del complesso (Nlt1p, Wbp1p e Swp1p) &egrave; segnalato. Le proteine sono espresse utilizzando il sistema di espressione di baculovirus litico e i nuovi costrutti sono ben educati, monomerico in soluzione e glicosilata. Due delle proteine interagiscono tra loro come si &egrave; visto da gel filtrazione e Dicroismo circolare. Questo studio fornisce un quadro per studiare i ruoli di queste tre subunit&agrave; essenziali di OT eucariote complesso.

Espressione eterologa e caratterizzazione biofisica di subunit&agrave; trasferasi solubile oligosaccharyl.

&#xFF08;OT&#xFF09;Oligosaccharyl&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306F;N-&#x7D50;&#x5408;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30B0;&#x30EA;&#x30B3;&#x30B7;&#x30EB;&#x5316;&#x306E;&#x6700;&#x521D;&#x306E;&#x30B3;&#x30DF;&#x30C3;&#x30C8;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x306F;&#x3001;&#x5C0F;&#x80DE;&#x4F53;&#x5185;&#x8154;&#x3067;&#x767A;&#x751F;&#x3057;&#x305F;&#x5171;&#x540C;&#x7FFB;&#x8A33;&#x904E;&#x7A0B;&#x3092;&#x89E6;&#x5A92;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x9175;&#x6BCD;Saccharomyces cerevisiae&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306F;&#x3001;&#x89E6;&#x5A92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306B;&#x5FC5;&#x9808;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x305D;&#x306E;&#x3046;&#x3061;&#x306E;5&#x3064;&#x304C;9&#x5185;&#x5728;&#x6027;&#x819C;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3002;&#x8A73;&#x7D30;&#x306A;&#x751F;&#x7269;&#x7269;&#x7406;&#x5B66;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x6D3B;&#x6027;&#x9175;&#x7D20;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x3092;&#x7CBE;&#x88FD;&#x3057;&#x305F;&#x8AB2;&#x984C;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x8868;&#x73FE;&#x3057;&#x3001;&#x5206;&#x96E2;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x6700;&#x5927;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x3046;&#x3061;3&#x3064;&#xFF08;Nlt1p&#x3001;Wbp1p&#x3001;&#x3068;Swp1p&#xFF09;&#x306E;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3092;&#x7279;&#x5FB4;&#x4ED8;&#x3051;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x7CFB;&#x7D71;&#x7684;&#x306A;&#x7814;&#x7A76;&#x304C;&#x5831;&#x544A;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;&#x3001;&#x6EB6;&#x89E3;&#x6027;&#x30D0;&#x30AD;&#x30E5;&#x30ED;&#x30A6;&#x30A4;&#x30EB;&#x30B9;&#x767A;&#x73FE;&#x7CFB;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x767A;&#x73FE;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x69CB;&#x6587;&#x306F;&#x884C;&#x5100;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x6EB6;&#x6DB2;&#x4E2D;&#x3067;&#x5358;&#x91CF;&#x4F53;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30B0;&#x30EA;&#x30B3;&#x30B7;&#x30EB;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x30B2;&#x30EB;&#x308D;&#x904E;&#x6CD5;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5186;&#x504F;&#x5149;&#x4E8C;&#x8272;&#x6027;&#x304B;&#x3089;&#x898B;&#x305F;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x4E8C;&#x4EBA;&#x306F;&#x4E92;&#x3044;&#x306B;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x672C;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x771F;&#x6838;&#x751F;&#x7269;&#x306E;OT&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;3&#x3064;&#x306E;&#x5FC5;&#x9808;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x7814;&#x7A76;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30D5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30E0;&#x30EF;&#x30FC;&#x30AF;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x7570;&#x7A2E;&#x767A;&#x73FE;&#x3068;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;Oligosaccharyl&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x751F;&#x7269;&#x7279;&#x6027;

Oligosaccharyl&#xACFC; (OT) N &#xC5F0;&#xACB0; &#xB41C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; glycosylation, endoplasmic &#xADF8;&#xBB3C; &#xB8E8;&#xBA58;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD558;&#xB294; co-translational &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4; &#xCEE4;&#xBC0B;&#xB41C; &#xBA3C;&#xC800; catalyzes. &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xD6A8; &#xBAA8; Saccharomyces cerevisiae &#xD6A8;&#xC18C;&#xB294; 5 &#xCD09;&#xB9E4;&#xC5D0; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; 9 &#xC815;&#xC218; &#xB9C9; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xAD6C;&#xC131; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC790;&#xC138;&#xD55C; &#xC0DD;&#xBB3C; &#xB9AC; &#xC5F0;&#xAD6C;, &#xD45C;&#xD604;, &#xCCB4;&#xACC4;&#xC801;&#xC778; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xBD84;&#xB9AC; &#xBC0F; &#xD2B9;&#xC131;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBCF5;&#xD569; &#xD65C;&#xC131; &#xD6A8;&#xC18C; &#xC815;&#xD654;&#xC640; &#xACFC;&#xC81C; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; 3 &#xB2E8;&#xC9C0; (Nlt1p, Wbp1p, &#xBC0F; Swp1p)&#xC5D0;&#xC11C; &#xAC00;&#xC7A5; &#xD070; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; &#xC218;&#xC6A9; &#xC131; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xBCF4;&#xACE0; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8; &#xC6A9;&#xADE0;&#xC131; &#xC7A0;&#xC7AC; &#xC2DD; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xD45C;&#xD604; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBC0F; &#xC0C8; &#xAD6C;&#xBB38;&#xC740; &#xC791;&#xB3D9;, &#xC194;&#xB8E8;&#xC158;, &#xBC0F; &#xB2F9;&#xD654; monomeric &#xD558;. &#xC824; &#xC5EC;&#xACFC; &#xBC0F; &#xC6D0;&#xD615; &#x9EC4; &#xBCF8; &#xB450; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC11C;&#xB85C; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB294; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC9C4; &#xD575; OT&#xC758; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC138; &#xAC00;&#xC9C0; &#xD544;&#xC218;&#xC801;&#xC778; subunits&#xC758; &#xC5ED;&#xD560; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xD504;&#xB808;&#xC784; &#xC6CC;&#xD06C;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5;.

&#xBD84;&#xB9AC; &#xC2DD;&#xACFC; &#xC6A9; &#xD574; oligosaccharyl &#xC804;&#xC774; subunits&#xC758; &#xC0DD;&#xBB3C; &#xB9AC; &#xD2B9;&#xC131;&#xD654;.

Oligosaccharyl transferasa (OT) cataliza el primer paso comprometido en la glicosilaci&#xF3;n de prote&#xED;nas unida a N, un proceso de co-traduccional que se produce en el lumen del ret&#xED;culo endoplasm&#xE1;tico. La levadura Saccharomyces cerevisiae complejo enzim&#xE1;tico comprende nueve prote&#xED;nas integrales de membrana, cinco de los cuales son esenciales para la cat&#xE1;lisis. Debido a los problemas con la purificaci&#xF3;n del complejo enzim&#xE1;tico activo de detallados estudios biof&#xED;sicos, un estudio sistem&#xE1;tico para expresar, aislar y caracterizar los dominios solubles de tres de los m&#xE1;s grandes de las subunidades del complejo (Nlt1p, Wbp1p y Swp1p) se informa. Las prote&#xED;nas se expresan mediante el sistema de expresi&#xF3;n de baculovirus l&#xED;tica y las nuevas construcciones se comportan bien, monom&#xE9;rica en soluci&#xF3;n, y glucosilada. Dos de las prote&#xED;nas interact&#xFA;an entre s&#xED; como se ve por filtraci&#xF3;n en gel y dicro&#xED;smo circular. Este estudio proporciona un marco para estudiar las funciones de estos tres subunidades esenciales del complejo de OT eucariotas.

Expresi&#xF3;n heter&#xF3;loga y caracterizaci&#xF3;n biof&#xED;sica de las subunidades solubles transferasa Oligosaccharyl

Oligosaccharyl &#x8F6C;&#x79FB;&#x9176; (OT) &#x50AC;&#x5316; N &#x94FE;&#x63A5;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7CD6;&#x57FA;&#x5316;&#xFF0C;co-translational &#x8FDB;&#x7A0B;&#x51FA;&#x73B0;&#x5728;&#x5185;&#x8D28;&#x7F51;&#x8154;&#x4E2D;&#x72AF;&#x4E0B;&#x7684;&#x7B2C;&#x4E00;&#x6B65;&#x3002;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x9175;&#x6BCD;&#x917F;&#x9152;&#x9175;&#x6BCD;&#x9176;&#x7EC4;&#x6210;&#x4E5D;&#x4E2A;&#x79EF;&#x5206;&#x819C;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D; 5 &#x4E2A;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x50AC;&#x5316;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;&#x7531;&#x4E8E;&#x4E0E;&#x51C0;&#x5316;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x6D3B;&#x6027;&#x9176;&#x4E3A;&#x8BE6;&#x7EC6;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x7269;&#x7406;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x6709;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x8868;&#x793A;&#xFF0C;&#x9694;&#x79BB;&#x548C;&#x7279;&#x6709;&#x7684;&#x6311;&#x6218;&#x62A5;&#x9053;&#x7684;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027;&#x7684;&#x590D;&#x6742; &#xFF08;Nlt1p&#xFF0C;Wbp1p &#x548C; Swp1p&#xFF09; &#x4E2D;&#x7684;&#x6700;&#x5927;&#x4E9A;&#x57FA;&#x7684;&#x4E09;&#x4E2A;&#x57DF;&#x3002;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x8868;&#x793A;&#x4F7F;&#x7528;&#x6EB6;&#x6606;&#x866B;&#x6746;&#x72B6;&#x75C5;&#x6BD2;&#x8868;&#x8FBE;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x548C;&#x65B0;&#x7684;&#x6784;&#x9020;&#x662F;&#x4E56;&#x3001; &#x5355;&#x4F53;&#x4E2D;&#x7684;&#x89E3;&#x51B3;&#x529E;&#x6CD5;&#x548C;&#x7CD6;&#x5316;&#x3002;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x5F7C;&#x6B64;&#x4EA4;&#x4E92;&#x6240;&#x770B;&#x5230;&#x7684;&#x51DD;&#x80F6;&#x8FC7;&#x6EE4;&#x548C;&#x5706;&#x4E8C;&#x8272;&#x6027;&#x3002;&#x8FD9;&#x9879;&#x7814;&#x7A76;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x4E00;&#x4E2A;&#x6846;&#x67B6;&#xFF0C;&#x7814;&#x7A76;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x771F;&#x6838; OT &#x4E09;&#x4E2A;&#x57FA;&#x672C;&#x4E9A;&#x57FA;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#x3002;

&#x5F02;&#x6E90;&#x8868;&#x8FBE;&#x53CA;&#x53EF;&#x6EB6;&#x6027; oligosaccharyl &#x8F6C;&#x79FB;&#x9176;&#x4E9A;&#x57FA;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x7269;&#x7406;&#x8868;&#x5F81;&#x3002;

Oligosaccharyl transferase (OT) catalyzes the first committed step in N-linked protein glycosylation, a co-translational process that occurs in the lumen of the endoplasmic reticulum. The yeast Saccharomyces cerevisiae enzyme complex comprises nine integral membrane proteins, five of which are essential for catalysis. Due to the challenges with purifying the active enzyme complex for detailed biophysical studies, a systematic study to express, isolate, and characterize the soluble domains of three of the largest subunits in the complex (Nlt1p, Wbp1p, and Swp1p) is reported. The proteins are expressed using the lytic baculovirus expression system and the new constructs are well behaved, monomeric in solution, and glycosylated. Two of the proteins interact with each other as seen by gel filtration and circular dichroism. This study provides a framework to study the roles of these three essential subunits of the eukaryotic OT complex.

Heterologous expression and biophysical characterization of soluble oligosaccharyl transferase subunits.

Oligosaccharyl transf&#xE9;rase (AT) catalyse la premi&#xE8;re &#xE9;tape engag&#xE9;e dans la glycosylation N-li&#xE9; prot&#xE9;ine, un proc&#xE9;d&#xE9; de co-translation qui se produit dans la lumi&#xE8;re du r&#xE9;ticulum endoplasmique. Le complexe de levure Saccharomyces cerevisiae enzyme comprend neuf prot&#xE9;ines membranaires int&#xE9;grales, dont cinq qui sont essentiels pour la catalyse. En raison des d&#xE9;fis &#xE0; purifier le complexe enzyme active pour des &#xE9;tudes d&#xE9;taill&#xE9;es biophysiques, une &#xE9;tude syst&#xE9;matique d&#x26;#39;exprimer, d&#x26;#39;isoler et caract&#xE9;riser les domaines solubles de trois des plus grandes sous-unit&#xE9;s du complexe (Nlt1p, Wbp1p, et Swp1p) est signal&#xE9;. Les prot&#xE9;ines sont exprim&#xE9;es en utilisant le syst&#xE8;me baculovirus lytique expression et les nouvelles constructions sont bien comport&#xE9;s, monom&#xE8;re en solution, et glycosyl&#xE9;. Deux des prot&#xE9;ines interagissent les uns avec les autres comme on le voit par filtration sur gel et dichro&#xEF;sme circulaire. Cette &#xE9;tude fournit un cadre pour &#xE9;tudier les r&#xF4;les de ces trois sous-unit&#xE9;s essentielles du complexe eucaryote OT.

Expression h&#xE9;t&#xE9;rologue et la caract&#xE9;risation biophysique des solubles Oligosaccharyl Subunits transferase

Heterologe Expression und biophysikalische Charakterisierung von l&#xF6;slichen Oligosaccharyltransferase Untereinheiten.

Na + / K +-ATPase &#x662F;&#x65E0;&#x5904;&#x4E0D;&#x5728;&#x7684;&#x8D28;&#x819C;&#x79BB;&#x5B50;&#x6CF5;&#xFF0C;&#x5B83;&#x5229;&#x7528; ATP &#x6C34;&#x89E3;&#x8C03;&#x8282;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5185;&#x7684; Na + &#x548C; K + &#x6D53;&#x5EA6;&#x3002;&#x5B83;&#x662F;&#x7531;&#x81F3;&#x5C11;&#x4E24;&#x4E2A;&#x4E9A;&#x57FA;&#xFF0C;&#x4ECB;&#x5BFC; ATP &#x6C34;&#x89E3;&#x548C;&#x79BB;&#x5B50;&#x8FD0;&#x8F93;&#x5927;&#x578B;&#x50AC;&#x5316; alpha &#x4E9A;&#x548C;&#x6240;&#x9700;&#x7684;&#x9002;&#x5F53;&#x8D29;&#x5356;&#x7684;&#x5168;&#x9176;&#x8FD8;&#x80FD;&#x8F85;&#x52A9; &beta; &#x4E9A;&#x57FA;&#x7EC4;&#x6210;&#x3002;&#x867D;&#x7136; alpha &#x4E9A;&#x57FA;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x7684;&#x8FDB;&#x7A0B;&#x8FDB;&#x884C;&#x4E86;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x4E86;&#x89E3;&#x751A;&#x5C11; &beta; &#x4E9A;&#x5355;&#x4F4D;&#x53C2;&#x4E0E;&#x9176;&#x7684;&#x6784;&#x8C61;&#x53D8;&#x5316;&#x3002;&#x79BB;&#x5B50;&#x8FD0;&#x8F93;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x6F84;&#x6E05; &beta; &#x4E9A;&#x5355;&#x4F4D;&#x7684;&#x4F5C;&#x7528;&#xFF0C;&#x80DE;&#x5916;&#x6C28;&#x57FA;&#x9178;&#x8FD1;&#x7AEF;&#x5230;&#x7F8A; beta1 &#x4E9A;&#x57FA;&#x7684;&#x8DE8;&#x819C;&#x533A;&#x57DF;&#x5355;&#x72EC;&#x66F4;&#x6362;&#x4E3A;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#x4E2D;&#x3002;&#x8FD9;&#x4F7F;&#x5DEF;&#x57FA;&#x5177;&#x4F53;&#x8D34;&#x6807;&#x7684;&#x73AF;&#x5883;&#x654F;&#x611F;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x67D3;&#x6599; tetramethylrhodamine-6-&#x9A6C;&#x6765; (TMRM) &#x540E;&#x5728;&#x975E;&#x6D32;&#x722A;&#x87FE;&#x5375;&#x6BCD;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x7684;&#x8868;&#x8FBE;&#x3002;&#x7535;&#x538B;&#x94B3;&#x8367;&#x5149;&#x6CD5;&#x8C03;&#x67E5;&#x786E;&#x5B9A;&#x4E09;&#x4E2A;&#x8BB0;&#x8005;&#x804C;&#x4F4D;&#x4E0A; beta1 &#x4E9A;&#x57FA;&#x5BF9;&#x79BB;&#x5B50;&#x6761;&#x4EF6;&#x548C;/&#x6216;&#x819C;&#x7535;&#x4F4D;&#x7684;&#x53D8;&#x5316;&#x4E0E;&#x8367;&#x5149;&#x53D8;&#x5316;&#x4F5C;&#x51FA;&#x7B54;&#x590D;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x9996;&#x6B21;&#x8868;&#x660E;&#x5B9E;&#x65F6;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7684;&#x6784;&#x8C61;&#x7684;&#x91CD;&#x6392;&#x7684; Na + / K +-ATPase &#x901A;&#x8FC7;&#x8367;&#x5149;&#x6807;&#x8BB0;&#x7684; &beta; &#x4E9A;&#x57FA;&#x3002;&#x540C;&#x65F6;&#x5F55;&#x5236;&#x7684; presteady &#x72B6;&#x6001;&#x6216;&#x56FA;&#x5B9A;&#x7535;&#x6D41;&#x4E0E;&#x8367;&#x5149;&#x4FE1;&#x53F7;&#x542F;&#x7528;&#x5230; Na &#x7684;&#x67D0;&#x4E9B;&#x53CD;&#x5E94;&#x6B65;&#x9AA4;&#x7684; &beta; &#x4E9A;&#x5355;&#x4F4D;&#x89C2;&#x5BDF;&#x73AF;&#x5883;&#x53D8;&#x5316;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F8;&#x5173;&#x6027; + / K +-ATPase &#x5728;&#x8BE5;&#x5165;&#x4F4F;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x539F;&#x5219;&#x6784;&#x8C61;&#x56FD;&#x5BB6;&#x3001; E1P &#x548C; E2P &#x6D89;&#x53CA;&#x66F4;&#x6539;&#x7684;&#x3002;&#x4ECE;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x5728;&#x63D0;&#x4F9B;&#x8BC1;&#x636E;&#x8868;&#x660E; beta1 S62C &#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x53EF;&#x76F4;&#x63A5;&#x7528;&#x4E8E;&#x76D1;&#x6D4B;&#x9176;&#x7684;&#x6784;&#x8C61;&#x72B6;&#x6001;&#xFF0C;&#x867D;&#x7136; F64C &#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x63ED;&#x793A;&#x677E;&#x5F1B;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x7531;&#x94A0;&#x8FD0;&#x8F93;&#x6240;&#x89E6;&#x53D1;&#xFF0C;&#x4F46;&#x6F14;&#x53D8;&#x65F6;&#x95F4;&#x89C4;&#x6A21;&#x8981;&#x6162;&#x5F97;&#x591A;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x7535;&#x538B;&#x4F9D;&#x8D56;&#x6027;&#x548C;&#x89C2;&#x5BDF;&#x5230;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53; K65C &#x663E;&#x793A;&#x8FD9;&#x79CD;&#x5E26;&#x7535;&#x8D56;&#x6C28;&#x9178;&#x6B8B;&#x4F59;&#xFF0C;&#x5B88;&#x6052;&#x5728; beta1 &#x5F02;&#x6784;&#x4F53;&#xFF0C;&#x76F4;&#x63A5;&#x5F71;&#x54CD;&#x7684;&#x6709;&#x6548;&#x7684;&#x6F5C;&#x529B;&#xFF0C;&#x786E;&#x5B9A;&#x7535;&#x538B;&#x4F9D;&#x8D56;&#x6027;&#x7684;&#x80DE;&#x5916;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x548C;&#x91CA;&#x653E;&#x7684;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x53D8;&#x5316;&#x3002;

&Beta; &#x4E9A;&#x57FA;&#x7684; Na + / K +-ATPase &#x540E;&#x9762;&#x7684;&#x5168;&#x9176;&#x8FD8;&#x80FD;&#x6784;&#x8C61;&#x72B6;&#x6001;&#x3002;

The Na+/K+-ATPase is a ubiquitous plasma membrane ion pump that utilizes ATP hydrolysis to regulate the intracellular concentration of Na+ and K+. It is comprised of at least two subunits, a large catalytic alpha subunit that mediates ATP hydrolysis and ion transport, and an ancillary beta subunit that is required for proper trafficking of the holoenzyme. Although processes mediated by the alpha subunit have been extensively studied, little is known about the participation of the beta subunit in conformational changes of the enzyme. To elucidate the role of the beta subunit during ion transport, extracellular amino acids proximal to the transmembrane region of the sheep beta1 subunit were individually replaced for cysteines. This enabled sulfhydryl-specific labeling with the environmentally sensitive fluorescent dye tetramethylrhodamine-6-maleimide (TMRM) upon expression in Xenopus oocytes. Investigation by voltage-clamp fluorometry identified three reporter positions on the beta1 subunit that responded with fluorescence changes to alterations in ionic conditions and/or membrane potential. These experiments for the first time show real-time detection of conformational rearrangements of the Na+/K+-ATPase through a fluorophore-labeled beta subunit. Simultaneous recording of presteady-state or stationary currents together with fluorescence signals enabled correlation of the observed environmental changes of the beta subunit to certain reaction steps of the Na+/K+-ATPase, which involve changes in the occupancy of the two principle conformational states, E1P and E2P. From these experiments, evidence is provided that the beta1-S62C mutant can be directly used to monitor the conformational state of the enzyme, while the F64C mutant reveals a relaxation process that is triggered by sodium transport but evolves on a much slower time scale. Finally, shifts in voltage dependence and kinetics observed for mutant K65C show that this charged lysine residue, which is conserved in beta1 isoforms, directly influences the effective potential that determines voltage dependence of extracellular cation binding and release.

The beta subunit of the Na+/K+-ATPase follows the conformational state of the holoenzyme.

La Na + / K +-ATPase est une pompe &#xE0; membrane &#xE9;changeuse d&#x26;#39;ions du plasma omnipr&#xE9;sente qui utilise hydrolyse de l&#x26;#39;ATP pour r&#xE9;guler la concentration intracellulaire de Na + et K +. Il est compos&#xE9; d&#x26;#39;au moins deux sous-unit&#xE9;s, une sous-unit&#xE9; alpha grande catalytique qui m&#xE9;die l&#x26;#39;ATP et l&#x26;#39;hydrolyse de transport d&#x26;#39;ions, et une sous-unit&#xE9; b&#xEA;ta auxiliaire qui est n&#xE9;cessaire pour la traite correcte de l&#x26;#39;holoenzyme. Bien que les processus induits par la sous-unit&#xE9; alpha ont &#xE9;t&#xE9; largement &#xE9;tudi&#xE9;es, on sait peu au sujet de la participation de la sous-unit&#xE9; b&#xEA;ta de changements conformationnels de l&#x26;#39;enzyme. Pour &#xE9;lucider le r&#xF4;le de la sous-unit&#xE9; b&#xEA;ta pendant le transport d&#x26;#39;ions, acides amin&#xE9;s extracellulaires proximales &#xE0; la r&#xE9;gion transmembranaire de la sous-unit&#xE9; beta1 moutons ont &#xE9;t&#xE9; remplac&#xE9;s individuellement pour cyst&#xE9;ines. Ce qui a permis sulfhydryle-&#xE9;tiquetage sp&#xE9;cifique avec le colorant fluorescent sensible &#xE0; l&#x26;#39;environnement t&#xE9;tram&#xE9;thylrhodamine-6-mal&#xE9;imide (TMRM) lors de l&#x26;#39;expression dans des ovocytes de Xenopus. Enqu&#xEA;te men&#xE9;e par voltage-clamp fluorom&#xE9;trie identifi&#xE9; trois positions reporter sur la sous-unit&#xE9; beta1 qui ont r&#xE9;pondu &#xE0; des changements de fluorescence &#xE0; des modifications dans les conditions ioniques et / ou le potentiel de membrane. Ces exp&#xE9;riences pour la premi&#xE8;re fois montrent en temps r&#xE9;el de d&#xE9;tection des r&#xE9;arrangements de conformation de la Na + / K +-ATPase par un fluorophore marqu&#xE9; sous-unit&#xE9; b&#xEA;ta. L&#x26;#39;enregistrement simultan&#xE9; des courants presteady &#xE9;tatiques ou stationnaire ainsi que des signaux de fluorescence ont permis de corr&#xE9;lation des changements observ&#xE9;s de l&#x26;#39;environnement de la sous-unit&#xE9; b&#xEA;ta aux &#xE9;tapes de la r&#xE9;action de certains de la Na + / K +-ATPase, qui impliquent des changements dans l&#x26;#39;occupation des deux Etats principe de conformation, E1P et E2P. De ces exp&#xE9;riences, la preuve est apport&#xE9;e que le mutant beta1-S62C peut &#xEA;tre directement utilis&#xE9; pour surveiller l&#x26;#39;&#xE9;tat de conformation de l&#x26;#39;enzyme, tandis que le mutant F64C r&#xE9;v&#xE8;le un processus de relaxation qui est d&#xE9;clench&#xE9; par le transport du sodium, mais &#xE9;volue sur une &#xE9;chelle de temps beaucoup plus lent. Enfin, se d&#xE9;place en fonction de tension et cin&#xE9;tiques observ&#xE9;es pour le spectacle K65C mutant que ce r&#xE9;sidu charg&#xE9; lysine, qui est conserv&#xE9; dans beta1 isoformes, influe directement sur le potentiel effectif qui d&#xE9;termine la d&#xE9;pendance de tension de la liaison cation extracellulaire et la lib&#xE9;ration.

La sous-unit&#xE9; b&#xEA;ta de la Na + / K +-ATPase Suit l&#x26;#39;&#xE9;tat conformationnel de l&#x26;#39;holoenzyme

Die Beta-Untereinheit der Na + / K +-ATPase folgt die Konformation des Holoenzym.

Il Na + K +-ATPasi sono una pompa dello ione onnipresente plasma membrana che utilizza l&#39;idrolisi dell&#39;ATP per regolare la concentrazione intracellulare di Na + e K +. Esso &egrave; composto da almeno due subunit&agrave;, una grande subunit&agrave; catalitica alfa che media idrolisi dell&#39;ATP e il trasporto di ioni e una subunit&agrave; beta accessoria che &egrave; richiesto per traffico adeguato dell&#39;esonucleasica. Sebbene i processi mediati dalla subunit&agrave; alfa sono state ampiamente studiati, poco si sa circa la partecipazione della subunit&agrave; beta cambiamenti conformazionali dell&#39;enzima. Per chiarire il ruolo della subunit&agrave; beta durante il trasporto di ioni, amminoacidi extracellulari prossimale alla regione transmembrana della subunit&agrave; beta1 pecore vennero sostituiti individualmente per cisteine. Questo permesso contrassegno sulfidrilici specifico con la tintura fluorescente ambientalmente sensibili tetrametilrodamina-6-con (TMRM) su espressione in ovociti di Xenopus. Indagine di tensione-morsetto la fluorometria identificato tre posizioni reporter sulla subunit&agrave; beta1 che ha risposto con modifiche di fluorescenza ad alterazioni in condizioni ioniche e/o potenziale di membrana. Questi esperimenti per la prima volta mostrano il rilevamento in tempo reale di riarrangiamenti conformazionali del Na + K +-ATPasi attraverso una subunit&agrave; beta fluoroforo. Registrazione simultanea delle correnti presteady-stato o stazionarie insieme a fluorescenza segnali abilitato correlazione dei cambiamenti ambientali osservati della subunit&agrave; beta di alcuni passaggi della reazione del Na + K +-ATPasi, che comportano modifiche nell&#39;occupazione degli Stati conformazionali due principio, E1P ed E2P. Da questi esperimenti, prove sono a condizione che il mutante beta1-S62C pu&ograve; essere direttamente utilizzato per monitorare lo stato conformazionale dell&#39;enzima, mentre il mutante F64C rivela un processo di rilassamento che viene attivato da trasporto di sodio, ma si evolve su una scala di tempo molto pi&ugrave; lenta. Infine, si sposta in dipendenza di tensione e cinetica osservato per mutant K65C mostrano che questo residuo di lisina carica, che &egrave; conservato in beta1 isoforme, influenza direttamente il potenziale efficacia che determina la dipendenza di tensione dell&#39;associazione catione extracellulare e rilascio.

La subunit&agrave; beta del Na + K +-ATPasi segue lo stato conformazionale dell&#39;esonucleasica.

&#x306E;Na + / K +-ATPase&#x306F;Na +&#x3068;K +&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;ATP&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x3092;&#x5229;&#x7528;&#x3057;&#x305F;&#x30E6;&#x30D3;&#x30AD;&#x30BF;&#x30B9;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x306E;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x30DD;&#x30F3;&#x30D7;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x305D;&#x308C;&#x306F;&#x3001;&#x5C11;&#x306A;&#x304F;&#x3068;&#x3082;2&#x3064;&#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x4EF2;&#x4ECB;&#x3059;&#x308B;ATP&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x3068;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x8F38;&#x9001;&#x3001;&#x30DB;&#x30ED;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x9069;&#x5207;&#x306A;&#x58F2;&#x8CB7;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x5FC5;&#x8981;&#x3068;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x88DC;&#x52A9;&#x7684;&#x306A;&#x3B2;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x5927;&#x304D;&#x306A;&#x89E6;&#x5A92;&#x3B1;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3067;&#x69CB;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002; &#x3B1;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5A92;&#x4ECB;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306F;&#x5E83;&#x7BC4;&#x56F2;&#x306B;&#x7814;&#x7A76;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x304C;&#x3001;&#x307B;&#x3068;&#x3093;&#x3069;&#x306F;&#x3001;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x5909;&#x5316;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x3B2;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3078;&#x306E;&#x53C2;&#x52A0;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x306F;&#x307B;&#x3068;&#x3093;&#x3069;&#x77E5;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x306A;&#x3044;&#x3002;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x8F38;&#x9001;&#x4E2D;&#x306E;&#x3B2;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x89E3;&#x660E;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x7F8A;beta1&#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x819C;&#x8CAB;&#x901A;&#x9818;&#x57DF;&#x306B;&#x8FD1;&#x4F4D;&#x7D30;&#x80DE;&#x5916;&#x306E;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE;&#x9178;&#x306F;&#x3001;&#x500B;&#x5225;&#x306E;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x7F6E;&#x304D;&#x63DB;&#x3048;&#x3089;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x74B0;&#x5883;&#x306B;&#x654F;&#x611F;&#x306A;&#x86CD;&#x5149;&#x67D3;&#x6599;&#x30A2;&#x30D5;&#x30EA;&#x30AB;&#x30C4;&#x30E1;&#x30AC;&#x30A8;&#x30EB;&#x5375;&#x6BCD;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x767A;&#x73FE;&#x6642;&#x306B;&#x30C6;&#x30C8;&#x30E9;&#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;-6  - &#x30DE;&#x30EC;&#x30A4;&#x30DF;&#x30C9;&#xFF08;TMRM&#xFF09;&#x3067;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x5BFE;&#x5FDC;&#x30B9;&#x30EB;&#x30D5;&#x30D2;&#x30C9;&#x30EA;&#x30EB;&#x56FA;&#x6709;&#x306E;&#x30E9;&#x30D9;&#x30EB;&#x3002;&#x96FB;&#x5727;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x86CD;&#x5149;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x8ABF;&#x67FB;&#x306F;&#x3001;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x72B6;&#x614B;&#x304A;&#x3088;&#x3073;/&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x819C;&#x96FB;&#x4F4D;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x3078;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x306B;&#x5BFE;&#x5FDC;&#x3057;beta1&#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x4E0A;&#x306E;3&#x3064;&#x306E;&#x30EC;&#x30DD;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x306E;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x3092;&#x540C;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x86CD;&#x5149;&#x6A19;&#x8B58;&#x3B2;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x4ECB;&#x3057;&#x3066;&#x306E;Na + / K +-ATPase&#x306E;&#x7ACB;&#x4F53;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x518D;&#x7DE8;&#x6210;&#x306E;&#x521D;&#x3081;&#x3066;&#x306E;&#x30B7;&#x30E7;&#x30FC;&#x306E;&#x30EA;&#x30A2;&#x30EB;&#x30BF;&#x30A4;&#x30E0;&#x691C;&#x51FA;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x3002;&#x86CD;&#x5149;&#x30B7;&#x30B0;&#x30CA;&#x30EB;&#x3068;&#x5171;&#x306B;presteady&#x72B6;&#x614B;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x9759;&#x6B62;&#x96FB;&#x6D41;&#x306E;&#x540C;&#x6642;&#x8A18;&#x9332;&#x306B;&#x306F;&#x3001;2&#x3064;&#x306E;&#x539F;&#x7406;&#x69CB;&#x9020;&#x72B6;&#x614B;&#x3001;E1P&#x306E;&#x5360;&#x6709;&#x7387;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x3092;&#x4F34;&#x3046;&#x306E;Na + / K +-ATP&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x3001;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x53CD;&#x5FDC;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x306B;&#x3B2;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x89B3;&#x6E2C;&#x74B0;&#x5883;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x306E;&#x76F8;&#x95A2;&#x3092;&#x6709;&#x52B9;&#x306B;&#x3057;&#x3066;&#x3068;E2P&#x3002; F64C&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x306F;&#x30CA;&#x30C8;&#x30EA;&#x30A6;&#x30E0;&#x8F38;&#x9001;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5F15;&#x304D;&#x8D77;&#x3053;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x304C;&#x306F;&#x308B;&#x304B;&#x306B;&#x9045;&#x3044;&#x6642;&#x9593;&#x30B9;&#x30B1;&#x30FC;&#x30EB;&#x3067;&#x9032;&#x5316;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x7DE9;&#x548C;&#x904E;&#x7A0B;&#x3092;&#x660E;&#x3089;&#x304B;&#x306B;&#x3057;&#x306A;&#x304C;&#x3089;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x304B;&#x3089;&#x3001;&#x8A3C;&#x62E0;&#x306F;&#x3001;&#x3B2;1-S62C&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x3092;&#x76F4;&#x63A5;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x72B6;&#x614B;&#x3092;&#x76E3;&#x8996;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;&#x96FB;&#x5727;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x3068;beta1&#x306E;&#x30A2;&#x30A4;&#x30BD;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30E0;&#x306B;&#x4FDD;&#x5B58;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x306E;&#x5145;&#x96FB;&#x30EA;&#x30B8;&#x30F3;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306F;&#x3001;&#x76F4;&#x63A5;&#x7D30;&#x80DE;&#x5916;&#x967D;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x7D50;&#x5408;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x653E;&#x51FA;&#x306E;&#x96FB;&#x5727;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x3092;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x6709;&#x52B9;&#x30DD;&#x30C6;&#x30F3;&#x30B7;&#x30E3;&#x30EB;&#x306B;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x4E0E;&#x3048;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;K65C&#x30B7;&#x30E7;&#x30FC;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x8A8D;&#x3081;&#x3089;&#x308C;&#x52D5;&#x614B;&#x306B;&#x30B7;&#x30D5;&#x30C8;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x306E;Na + / K&#x306E;&#x3B2;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306F;+-ATP&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x30DB;&#x30ED;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30DB;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x72B6;&#x614B;&#x306B;&#x5F93;&#x3044;&#x307E;&#x3059;

Na + K +-Atpase&#xB294; ATP &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; Na +&#xC640; K +&#xC758; &#xC138;&#xD3EC;&#xB0B4; &#xB18D;&#xB3C4; &#xADDC;&#xC81C;&#xB97C; &#xD65C;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC720;&#xBE44; &#xCFFC;&#xD130; &#xC2A4; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778; &#xC774;&#xC628; &#xD38C;&#xD504;. &#xADF8;&#xAC83;&#xC740; &#xC801;&#xC5B4;&#xB3C4; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;, ATP &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xBC0F; &#xC774;&#xC628; &#xC218;&#xC1A1;&#xC744; &#xC911;&#xC7AC; &#xD558;&#xB294; &#xD070; &#xCD09;&#xB9E4; &#xC54C;&#xD30C; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xC640;&#xB294; holoenzyme&#xC758; &#xC801;&#xC808; &#xD55C; &#xC778;&#xC2E0; &#xB9E4;&#xB9E4;&#xC5D0; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; &#xBD80;&#xC218;&#xC801;&#xC778; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xB294; &#xAD6C;&#xC131; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC54C;&#xD30C; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC911;&#xC7AC; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xB97C; &#xAD11;&#xBC94;&#xC704; &#xD558; &#xAC8C; &#xACF5;&#xBD80; &#xD588;&#xB2E4;, &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC791;&#xC740; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xBCC0;&#xD654;&#xC5D0; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xC758; &#xCC38;&#xC5EC;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC54C;&#xB824;&#xC838; &#xC788;&#xB2E4;. &#xC774;&#xC628; &#xC218;&#xC1A1; &#xC911; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xBA85;&#xB8CC; &#xD558; &#xC591; beta1 &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; &#xB9C9; &#xD6A1;&#xB2E8; &#xC601;&#xC5ED;&#xC5D0; &#xC778;&#xC811; &#xC138;&#xD3EC; &#xC678; &#xC544;&#xBBF8;&#xB178;&#xC0B0;&#xC740; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD14C;&#xC778;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAC1C;&#xBCC4;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xAD50;&#xCCB4; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC774; sulfhydryl &#xD2B9;&#xC815; &#xB77C;&#xBCA8;&#xC740; &#xD658;&#xACBD;&#xC5D0; &#xBBFC;&#xAC10;&#xD55C; &#xD615;&#xAD11; &#xC5FC;&#xB8CC; tetramethylrhodamine-6-maleimide (TMRM) Xenopus oocytes&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2DD;&#xC73C;&#xB85C; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC804;&#xC555; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504; fluorometry&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC870;&#xC0AC; &#xC751;&#xB2F5; &#xD615;&#xAD11; &#xBCC0;&#xD654; &#xC774;&#xC628; &#xC870;&#xAC74; &#xBC0F;/&#xB610;&#xB294; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778;&#xC73C;&#xB85C; &#xBCC0;&#xACBD; &#xD558;&#xB294; beta1 &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xC5D0; &#xC138; &#xAE30;&#xC790; &#xC704;&#xCE58; &#xD655;&#xC778;. &#xCC98;&#xC74C;&#xC73C;&#xB85C; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC1FC;&#xB294; Na&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xC7AC;&#xBC30;&#xC5F4;&#xC758; &#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04; &#xD0D0;&#xC9C0; + K +-ATPase fluorophore &#xD45C;&#xC2DC; &#xB41C; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574;. &#xB3D9;&#xC2DC; &#xB179;&#xC74C; &#xD615;&#xAD11; &#xD568;&#xAED8; presteady &#xC0C1;&#xD0DC;&#xB098; &#xACE0;&#xC815; &#xC804;&#xB958; &#xC2E0;&#xD638;&#xB294; Na&#xC758; &#xD2B9;&#xC815; &#xBC18;&#xC751; &#xB2E8;&#xACC4;&#xB85C; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xC758; &#xAD00;&#xCE21; &#xD658;&#xACBD; &#xBCC0;&#xD654;&#xC758; &#xC0C1;&#xAD00; &#xAD00;&#xACC4;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; + K +-ATPase, E1P &#xBC0F; e2p&#xC758; &#xB450; &#xC6D0;&#xB9AC; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xC0C1;&#xD0DC; &#xC778;&#xC5D0; &#xBCC0;&#xACBD; &#xC0AC;&#xD56D;&#xC744; &#xD3EC;&#xD568; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC99D;&#xAC70;&#xAC00; beta1 S62C &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; F64C &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBC1D;&#xD600; &#xB098;&#xD2B8;&#xB968; &#xC804;&#xC1A1;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD2B8;&#xB9AC;&#xAC70;&#xB418;&#xB294; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xD6E8;&#xC52C; &#xB354; &#xB290;&#xB9B0; &#xC2DC;&#xAC04; &#xADDC;&#xBAA8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC9C4;&#xD654; &#xD558;&#xB294; &#xC774;&#xC644; &#xACFC;&#xC815; &#xB3D9;&#xC548; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xB97C; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xD558; &#xC9C1;&#xC811; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB420; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC804;&#xC555; &#xC758;&#xC874; &#xBC0F; &#xC18D;&#xB3C4; &#xB860; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; K65C &#xBCF4;&#xC5EC; beta1 isoforms&#xC5D0; &#xBCF4;&#xC874;&#xC740; &#xCDA9;&#xC804;&#xB41C; lysine &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC774; &#xC9C1;&#xC811; &#xC138;&#xD3EC; &#xC678; &#xC591;&#xC774;&#xC628; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; &#xBC0F; &#xCD9C;&#xC2DC;&#xC758; &#xC804;&#xC555; &#xC758;&#xC874;&#xC131;&#xC744; &#xACB0;&#xC815; &#xD558;&#xB294; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801;&#xC778; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xC601;&#xD5A5;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAD00;&#xCC30;&#xC5D0; &#xC774;&#xB3D9; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xB098;&#xC758; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; + K +-Atpase&#xB294; holoenzyme&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xB97C; &#xB2E4;&#xC74C;&#xACFC; &#xAC19;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

El Na + / K +-ATPasa es una membrana de plasma en todas partes de la bomba de iones que utiliza la hidr&#xF3;lisis de ATP para regular la concentraci&#xF3;n intracelular de Na + y K +. Se compone de al menos dos subunidades, una subunidad alfa gran catal&#xED;tico que media la hidr&#xF3;lisis de ATP y el transporte de iones, y una subunidad beta auxiliar que se requiere para el tr&#xE1;fico adecuado de la holoenzima. Aunque los procesos mediados por la subunidad alfa han sido ampliamente estudiados, se sabe poco acerca de la participaci&#xF3;n de la subunidad beta en los cambios conformacionales de la enzima. Para elucidar la funci&#xF3;n de la subunidad beta durante el transporte de iones, amino&#xE1;cidos extracelulares proximal a la regi&#xF3;n transmembrana de la oveja subunidad beta 1 se sustituye de forma individual para ciste&#xED;nas. Esto permiti&#xF3; sulfhidrilo espec&#xED;fico etiquetado con el colorante fluorescente sensible al medio ambiente tetrametilrodamina-6-maleimida (TMRM) sobre la expresi&#xF3;n en oocitos de Xenopus. Investigaci&#xF3;n por fluorometr&#xED;a fijaci&#xF3;n de voltaje identificado tres posiciones reportero en la subunidad beta 1 que respondieron con cambios de fluorescencia a alteraciones de las condiciones i&#xF3;nicas y / o potencial de la membrana. Estos experimentos para el primer show en tiempo real la detecci&#xF3;n en tiempo de reordenamientos conformacionales de la Na + / K +-ATPasa a trav&#xE9;s de un fluor&#xF3;foro marcado subunidad beta. La grabaci&#xF3;n simult&#xE1;nea de las corrientes presteady estatales o estacionario, junto con las se&#xF1;ales de fluorescencia permiti&#xF3; la correlaci&#xF3;n de los cambios observados ambientales de la subunidad beta de etapas de reacci&#xF3;n ciertos sectores de la Na + / K +-ATPasa, que implican cambios en la ocupaci&#xF3;n de los estados del principio de dos conformacional, E1P y E2P. A partir de estos experimentos, se demuestra que el mutante beta 1-S62C se pueden usar directamente para controlar el estado conformacional de la enzima, mientras que el mutante F64C revela un proceso de relajaci&#xF3;n que se activa por el transporte de sodio, sino que evoluciona en una escala de tiempo mucho m&#xE1;s lento. Finalmente, los cambios en dependencia del voltaje y la cin&#xE9;tica observados para mostrar mutante K65C que este residuo cargado lisina, que se conserva en beta1 isoformas, influye directamente en el potencial efectivo que determina la dependencia de voltaje de la uni&#xF3;n cati&#xF3;n extracelular y la liberaci&#xF3;n.

La subunidad beta de la Na + / K +-ATPasa Sigue el estado conformacional de la holoenzima

La Na + / K +-ATPase maintient l&#x26;#39;&#xE9;tat physiologique de Na + et K + gradients travers la membrane plasmique dans la plupart des cellules animales. L&#x26;#39;unit&#xE9; fonctionnelle de la pompe &#xE0; ions est constitu&#xE9;e de deux sous-unit&#xE9;s dont obligatoires du sous-unit&#xE9; alpha, qui m&#xE9;die hydrolyse de l&#x26;#39;ATP et de la translocation d&#x26;#39;ions, ainsi que le b&#xEA;ta-sous-unit&#xE9;, qui agit comme un chaperon pour favoriser l&#x26;#39;insertion correcte de membrane et le trafic dans le plasma Membrane. Pour &#xE9;tudier la dynamique de conformation entre l&#x26;#39;alpha-et b&#xEA;ta-sous-unit&#xE9;s de la Na + / K +-ATPase au cours du transport d&#x26;#39;ions, nous avons utilis&#xE9; Fluorescence Resonance Energy Transfer, dans des conditions de serrage de tension sur les ovocytes de Xenopus laevis, de faire la diff&#xE9;rence entre les deux mod&#xE8;les qui ont &#xE9;t&#xE9; propos&#xE9;es pour l&#x26;#39;orientation relative de l&#x26;#39;alpha et b&#xEA;ta-sous-unit&#xE9;s. Ces essais ont &#xE9;t&#xE9; effectu&#xE9;es en mesurant la constante de temps de destruction irr&#xE9;versible avec donneur fluorophore fluoresc&#xE9;ine-5-mal&#xE9;imide que le fluorophore donneur et en pr&#xE9;sence ou en l&#x26;#39;absence de t&#xE9;tram&#xE9;thylrhodamine-6-mal&#xE9;imide que l&#x26;#39;&#xE9;tiquetage fluorophore accepteur suivant la M3-M4 ou M5- M6 boucle de la sous-unit&#xE9; alpha et le b&#xEA;ta-sous-unit&#xE9;. Nous avons &#xE9;galement utilis&#xE9; Fluorescence Resonance Energy Transfer pour enqu&#xEA;ter sur le mouvement relatif entre les deux sous-unit&#xE9;s que les navettes de la pompe d&#x26;#39;ions entre les deux principaux &#xE9;tats conformationnels (E1 et E2) tels que d&#xE9;crits par le r&#xE9;gime Albers-Post. Les r&#xE9;sultats de cette &#xE9;tude ont identifi&#xE9; un mod&#xE8;le pour l&#x26;#39;orientation de la sous-unit&#xE9; b&#xEA;ta par rapport &#xE0; la sous-unit&#xE9; alpha et sugg&#xE8;rent que l&#x26;#39;alpha-et b&#xEA;ta-sous-unit&#xE9;s mouvement vers l&#x26;#39;autre lors de l&#x26;#39;E2 &#xE0; E1 transition conformationnelle.

Mesures fluorom&#xE9;triques de distances intermol&#xE9;culaires entre l&#x26;#39;alpha-et b&#xEA;ta-sous-unit&#xE9;s de la Na + / K +-ATPase

Der Na + / K +-ATPase beh&auml;lt die physiologischen Gradienten f&uuml;r Na + und K + &uuml;ber die Plasmamembran in die meisten tierischen Zellen. Die funktionale Einheit der Ion-Pumpe besteht aus zwei obligatorischen Untereinheiten, einschlie&szlig;lich der Alpha-Untereinheit, die vermittelt, ATP-Hydrolyse und Ion Translokation, sowie die Beta-Untereinheit, fungiert als eine Anstandsdame, reibungslose Membran einf&uuml;gen zu f&ouml;rdern und den Handel in der Plasmamembran. Untersuchen der Konformations&auml;nderungen Dynamik zwischen den Alpha - und Beta-Untereinheiten der Na + / K +-ATPase w&auml;hrend Ionentransport, wir haben Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer, unter Spannung Klemme Bedingungen auf Xenopus Laevis Eizellen, verwendet, um zwischen beiden Modellen zu unterscheiden, die f&uuml;r die relative Orientierung von Alpha und Beta-Untereinheiten vorgeschlagen wurden. Diese Experimente wurden durchgef&uuml;hrt, durch die Messung der Zeitkonstante der irreversiblen Spender Fluorophor Zerst&ouml;rung mit Fluoreszein-5-Maleimide als die Spender-Fluorophor und in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Tetramethylrhodamine-6-Maleimide als der Akzeptor Fluorophor nach Beschriftung auf die M3-M4 oder M5-M6-Schleife der Alpha-Untereinheit und der Beta-Untereinheit. Wir haben auch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer benutzt, um die relative Bewegung zwischen den zwei Untereinheiten als die Ionen-Pumpe-Shuttles zwischen den beiden wichtigsten Konformations&auml;nderungen Staaten (E1 und E2) zu untersuchen, wie durch das Albers-Post-Schema beschrieben. Die Ergebnisse dieser Studie haben ein Modell f&uuml;r die Ausrichtung der Beta-Untereinheit in Bezug auf die Alpha-Untereinheit und schlagen vor, da&szlig; die Alpha - und Beta-Untereinheiten auf einander w&auml;hrend der E2 E1 Konformations&auml;nderungen &Uuml;bergang bewegen.

Fluorometrische Messungen der intermolekulare Abst&auml;nde zwischen den Alpha - und Beta-Untereinheiten der Na + / K +-ATPase.

Na + / K +-ATPase &#x4FDD;&#x6301;&#x751F;&#x7406;&#x7684; Na + &#x548C; K + &#x6E10;&#x53D8;&#x8DE8;&#x819C;&#x6700;&#x52A8;&#x7269;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D;&#x3002;&#x79BB;&#x5B50;&#x6CF5;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x5355;&#x4F4D;&#x662F;&#x7531;&#x4E24;&#x4E2A;&#x5F3A;&#x5236;&#x6027;&#x4E9A;&#x5355;&#x4F4D;&#x5305;&#x62EC; alpha &#x4E9A;&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x4ECB;&#x5BFC; ATP &#x6C34;&#x89E3;&#x548C;&#x79BB;&#x5B50;&#x6613;&#x4F4D;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA; &beta;-&#x4E9A;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4F34;&#x4FA3;&#xFF0C;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x9002;&#x5F53;&#x7684;&#x819C;&#x63D2;&#x5165;&#x548C;&#x8D29;&#x8FD0;&#x7B49;&#x79BB;&#x5B50;&#x819C;&#x7EC4;&#x6210;&#x3002;&#x8981;&#x68C0;&#x67E5;&#x7684;&#x6784;&#x8C61;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x4E9A;&#x4E4B;&#x95F4; &alpha;-&#x548C; &beta;-&#x57FA; Na + / K +-ATPase &#x79BB;&#x5B50;&#x8FD0;&#x8F93;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x7684;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x4F7F;&#x7528;&#x8367;&#x5149;&#x5171;&#x632F;&#x80FD;&#x91CF;&#x8F6C;&#x79FB;&#xFF0C;&#x6839;&#x636E;&#x7535;&#x538B;&#x5939;&#x6761;&#x4EF6;&#x5BF9;&#x975E;&#x6D32;&#x722A;&#x87FE;&#x5375;&#x6BCD;&#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;&#x76F8;&#x5BF9;&#x65B9;&#x5411;&#x7684; &alpha;-&#x548C; &beta;-&#x4E9A;&#x5DF2;&#x63D0;&#x8BAE;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x6A21;&#x578B;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x533A;&#x522B;&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x6D4B;&#x91CF;&#x4E0D;&#x53EF;&#x9006;&#x8F6C;&#x6350;&#x52A9;&#x8367;&#x5149;&#x5177;&#x6709;&#x6BC1;&#x706D;&#x6027;&#x8367;&#x5149;&#x7D20; 5-&#x9A6C;&#x6765;&#x9170;&#x4E9A;&#x80FA;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x6350;&#x52A9;&#x8367;&#x5149;&#x548C;&#x65F6;&#x95F4;&#x5E38;&#x6570;&#x4E2D;&#x5B58;&#x5728; tetramethylrhodamine-6-&#x9A6C;&#x6765;&#x9170;&#x4E9A;&#x80FA;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x540E;&#x8D34;&#x6807;&#x7684; &alpha;-&#x4E9A;&#x57FA;&#x548C; &beta;-&#x4E9A;&#x57FA; M3 M4 &#x6216; M5 M6 &#x73AF;&#x8DEF;&#x4E0A;&#x7684;&#x53D7;&#x4F53;&#x8367;&#x5149;&#x8FDB;&#x884C;&#x4E86;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x8BD5;&#x9A8C;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x4E5F;&#x7528;&#x8367;&#x5149;&#x5171;&#x632F;&#x80FD;&#x91CF;&#x8F6C;&#x79FB;&#x6765;&#x5F62;&#x5BB9;&#x7684;&#x535A;&#x65AF;&#x90AE;&#x653F;&#x8BA1;&#x5212;&#x8C03;&#x67E5;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4E24;&#x56FD;&#x95F4;&#x7684;&#x4E3B;&#x8981;&#x6784;&#x8C61; (E1 &#x548C; E2) &#x79BB;&#x5B50;&#x6CF5;&#x822A;&#x5929;&#x98DE;&#x673A;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x4E9A;&#x5355;&#x4F4D;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F8;&#x5BF9;&#x8FD0;&#x52A8;&#x3002;&#x4ECE;&#x8FD9;&#x9879;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x5DF2;&#x786E;&#x5B9A;&#x6A21;&#x578B;&#x7684; &beta;-&#x4E9A;&#x57FA;&#x4E0E; &alpha;-&#x4E9A;&#x57FA;&#x65B9;&#x5411;&#x548C;&#x5EFA;&#x8BAE; &alpha; &#x548C; &beta; &#x4E9A;&#x671D;&#x7740;&#x5BF9;&#x65B9;&#x671F;&#x95F4; E2 &#x5230; E1 &#x6784;&#x8C61;&#x7684;&#x8F6C;&#x53D8;&#x3002;

&#x8367;&#x5149;&#x6D4B;&#x91CF;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x95F4;&#x8DDD;&#x79BB;&#x4E9A;&#x4E4B;&#x95F4; &alpha;-&#x548C; &beta;-&#x57FA; Na + / K +-ATPase&#x3002;

The Na+/K+-ATPase maintains the physiological Na+ and K+ gradients across the plasma membrane in most animal cells. The functional unit of the ion pump is comprised of two mandatory subunits including the alpha-subunit, which mediates ATP hydrolysis and ion translocation, as well as the beta-subunit, which acts as a chaperone to promote proper membrane insertion and trafficking in the plasma membrane. To examine the conformational dynamics between the alpha- and beta-subunits of the Na+/K+-ATPase during ion transport, we have used fluorescence resonance energy transfer, under voltage clamp conditions on Xenopus laevis oocytes, to differentiate between two models that have been proposed for the relative orientation of the alpha- and beta-subunits. These experiments were performed by measuring the time constant of irreversible donor fluorophore destruction with fluorescein-5-maleimide as the donor fluorophore and in the presence or absence of tetramethylrhodamine-6-maleimide as the acceptor fluorophore following labeling on the M3-M4 or M5-M6 loop of the alpha-subunit and the beta-subunit. We have also used fluorescence resonance energy transfer to investigate the relative movement between the two subunits as the ion pump shuttles between the two main conformational states (E1 and E2) as described by the Albers-Post scheme. The results from this study have identified a model for the orientation of the beta-subunit in relation to the alpha-subunit and suggest that the alpha- and beta-subunits move toward each other during the E2 to E1 conformational transition.

Fluorometric measurements of intermolecular distances between the alpha- and beta-subunits of the Na+/K+-ATPase.

Il Na + K +-ATPasi mantiene i gradienti fisiologici di Na + e K + attraverso la membrana del plasma nelle cellule pi&ugrave; animali. L&#39;unit&agrave; funzionale della pompa dello ione &egrave; composta da due subunit&agrave; obbligatorie tra cui la subunit&agrave; alfa, che media l&#39;idrolisi dell&#39;ATP e traslocazione di ioni, come pure la subunit&agrave; beta, che agisce come un chaperone per promuovere l&#39;inserimento corretto della membrana e il traffico nella membrana del plasma. Esaminare le dinamiche conformazionali fra subunit&agrave; alfa e beta del Na + K +-ATPasi durante il trasporto di ioni, abbiamo usato fluorescenza resonance energy transfer, in condizioni di tensione pinza su ovociti di Xenopus laevis, per differenziare i due modelli che sono stati proposti per l&#39;orientamento relativo di subunit&agrave; alfa e beta. Questi esperimenti sono stati eseguiti da misurare la costante di tempo della distruzione di donatore irreversibile fluoroforo con fluorescina-5-con il fluoroforo donatore e nella presenza o assenza di tetrametilrodamina-6-con come il fluoroforo accettore seguente etichettatura sul loop M3-M4 o M5-M6 la subunit&agrave; alfa e la subunit&agrave; beta. Abbiamo anche usato il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza per indagare il movimento relativo tra le due subunit&agrave; come le navette di pompa ionica tra i due stati conformazionali principale (E1 ed E2) come descritto dallo schema di Albers-Post. I risultati di questo studio hanno identificato un modello per l&#39;orientamento della subunit&agrave; beta-rispetto la subunit&agrave; alfa e suggeriscono che la subunit&agrave; alfa e beta spostare verso l&#39;altro durante l&#39;E2 E1 transizione conformazionale.

Fluorometriche misurazioni delle distanze intermolecolari tra subunit&agrave; alfa e beta del Na + K +-ATPasi.

&#x306E;Na + / K +-ATP&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306F;&#x3001;&#x307B;&#x3068;&#x3093;&#x3069;&#x306E;&#x52D5;&#x7269;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x30D7;&#x30E9;&#x30BA;&#x30DE;&#x819C;&#x3092;&#x6A2A;&#x5207;&#x3063;&#x3066;&#x751F;&#x7406;&#x7684;Na +&#x3068;K +&#x306E;&#x52FE;&#x914D;&#x3092;&#x7DAD;&#x6301;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x30DD;&#x30F3;&#x30D7;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x5358;&#x4F4D;&#x306F;&#x3001;&#x8840;&#x6F3F;&#x4E2D;&#x306B;&#x9069;&#x5207;&#x306A;&#x819C;&#x3092;&#x633F;&#x5165;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x3001;&#x4EBA;&#x8EAB;&#x58F2;&#x8CB7;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3059;&#x308B;&#x30B7;&#x30E3;&#x30DA;&#x30ED;&#x30F3;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3059;&#x308B;ATP&#x52A0;&#x6C34;&#x5206;&#x89E3;&#x3068;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x8EE2;&#x5EA7;&#x3092;&#x4EF2;&#x4ECB;&#x3059;&#x308B;&#x3B1;-&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3001;&#x4E26;&#x3073;&#x306B;&#x3B2;-&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x542B;&#x3080;2&#x3064;&#x306E;&#x5FC5;&#x9808;&#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x69CB;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x819C;&#x3002; &#x3B1;-&#x304A;&#x3088;&#x3073;Na + / K +-ATPase&#x306E;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x8F38;&#x9001;&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x304C;&#x63D0;&#x6848;&#x3055;&#x308C;&#x305F;2&#x3064;&#x306E;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x3092;&#x533A;&#x5225;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x30A2;&#x30D5;&#x30EA;&#x30AB;&#x30C4;&#x30E1;&#x30AC;&#x30A8;&#x30EB;&#x5375;&#x6BCD;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x96FB;&#x5727;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x5171;&#x9CF4;&#x30A8;&#x30CD;&#x30EB;&#x30AE;&#x30FC;&#x79FB;&#x52D5;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x306E;&#x3B2;-&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x9593;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x3092;&#x8ABF;&#x3079;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001; &#x3B1;-&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x3B2;-&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x76F8;&#x5BFE;&#x7684;&#x306A;&#x5411;&#x304D;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x306F;&#x3001;&#x30C9;&#x30CA;&#x30FC;&#x86CD;&#x5149;&#x56E3;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x30D5;&#x30EB;&#x30AA;&#x30EC;&#x30BB;&#x30A4;&#x30F3;-5  - &#x30DE;&#x30EC;&#x30A4;&#x30DF;&#x30C9;&#x3068;&#x4E0D;&#x53EF;&#x9006;&#x7684;&#x306A;&#x30C9;&#x30CA;&#x30FC;&#x30D5;&#x30EB;&#x30AA;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A9;&#x30A2;&#x306E;&#x7834;&#x58CA;&#x306E;&#x6642;&#x5B9A;&#x6570;&#x3092;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x30C6;&#x30C8;&#x30E9;&#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C0;&#x30DF;&#x30F3;-6-&#x30DE;&#x30EC;&#x30A4;&#x30DF;&#x30C9;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x4E0B;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x975E;&#x5B58;&#x5728;&#x4E0B;&#x3067;&#x884C;&#x308F;&#x308C;&#x305F;M3-M4&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x4E0A;&#x306E;&#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30D7;&#x30BF;&#x30FC;&#x30D5;&#x30EB;&#x30AA;&#x30ED;&#x30D5;&#x30A9;&#x30A2;&#x306F;&#x3001;&#x6B21;&#x306E;&#x30E9;&#x30D9;&#x30EB;&#x3068;&#x3057;&#x3066;M5- &#x3B1;-&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3068;&#x3B2;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;M6&#x30EB;&#x30FC;&#x30D7;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D0;&#x30FC;&#x30B9;&#x30DD;&#x30B9;&#x30C8;&#x65B9;&#x5F0F;&#x3067;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x305F;2&#x3064;&#x306E;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x72B6;&#x614B;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x30DD;&#x30F3;&#x30D7;&#x306E;&#x30B7;&#x30E3;&#x30C8;&#x30EB;&#x30D0;&#x30B9;&#xFF08;E1&#x3068;E2&#xFF09;&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x4E8C;&#x3064;&#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x9593;&#x306E;&#x76F8;&#x5BFE;&#x904B;&#x52D5;&#x3092;&#x8ABF;&#x67FB;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x86CD;&#x5149;&#x5171;&#x9CF4;&#x30A8;&#x30CD;&#x30EB;&#x30AE;&#x30FC;&#x79FB;&#x52D5;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x304B;&#x3089;&#x3001;&#x3B1;-&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3068;&#x306E;&#x95A2;&#x4FC2;&#x3067;&#x3001;&#x3B2;-&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x5411;&#x304D;&#x306E;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x3092;&#x8B58;&#x5225;&#x3057;&#x3001;E1&#x30B3;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3078;&#x306E;&#x79FB;&#x884C;E2&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x304A;&#x4E92;&#x3044;&#x306B;&#x5411;&#x304B;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x3B1;-&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x3B2;-&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x79FB;&#x52D5;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x3B1;-&#x304A;&#x3088;&#x3073;Na + / K +-ATPase&#x306E;&#x3B2;-&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x9593;&#x306E;&#x5206;&#x5B50;&#x9593;&#x8DDD;&#x96E2;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x6E2C;&#x5B9A;

Na + K +-ATPase &#xB300;&#xBD80;&#xBD84;&#xC758; &#xB3D9;&#xBB3C; &#xC138;&#xD3EC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6D0;&#xD615;&#xC9C8; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xAC78;&#xCCD0; &#xC0DD;&#xB9AC; Na +&#xC640; K + &#xADF8;&#xB77C;&#xB514;&#xC5B8;&#xD2B8;&#xB97C; &#xC720;&#xC9C0; &#xD55C;&#xB2E4;. &#xC774;&#xC628; &#xD38C;&#xD504;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5; &#xB2E8;&#xC704;&#xB294; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xD544;&#xC218; &#xD558;&#xC704; &#xB2E8;&#xC704; &#xC18C;&#xB294; &#xC54C;&#xD30C;-&#xB2E8;&#xC704;, ATP &#xAC00;&#xC218;&#xBD84;&#xD574; &#xBC0F; &#xC774;&#xC628; &#xC804; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xC18C;&#xB97C; &#xBCA0;&#xD0C0;-&#xB2E8;&#xC704;, &#xC801;&#xC808; &#xD55C; &#xB9C9; &#xC0BD;&#xC785; &#xD64D;&#xBCF4; &#xBCF4;&#xD638;&#xC790;&#xB85C; &#xC5ED;&#xD560; &#xD558;&#xB294; &#xC911;&#xC7AC; &#xD558;&#xB294; &#xB4F1; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xB9C9;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC778;&#xC2E0; &#xB9E4;&#xB9E4;&#xC758; &#xAD6C;&#xC131; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC0AC;&#xC774; &#xC54C;&#xD30C;-&#xBC0F; &#xBCA0;&#xD0C0;-subunits&#xB294; Na&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xC5ED;&#xD559; &#xAC80;&#xC0AC; + K +-ATPase &#xC774;&#xC628; &#xC804;&#xC1A1; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC54C;&#xD30C;-&#xBC0F; &#xBCA0;&#xD0C0;-subunits &#xC0C1;&#xB300;&#xC801; &#xBC29;&#xD5A5;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC81C;&#xC548; &#xB41C; &#xB450; &#xBAA8;&#xB378; &#xAC04;&#xC758; &#xCC28;&#xBCC4;&#xD654; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xD615;&#xAD11; &#xACF5;&#xBA85; &#xC5D0;&#xB108;&#xC9C0; &#xC804;&#xB2EC; Xenopus laevis oocytes&#xC5D0;&#xC11C; &#xC804;&#xC555; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504; &#xC870;&#xAC74; &#xD558;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0AC;&#xC6A9;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC740; &#xB2E4;&#xC74C;&#xACFC; &#xAC19;&#xC740; &#xC54C;&#xD30C; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xC640; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; M3 M4 &#xB610;&#xB294; M5 M6 &#xB8E8;&#xD504;&#xC5D0; &#xB77C;&#xBCA8; &#xC218;&#xB77D;&#xC790; fluorophore&#xB85C; tetramethylrhodamine-6-maleimide&#xC758; &#xC720;&#xBB34;&#xC5D0; &#xB3CC;&#xC774;&#xD0AC; &#xC218; &#xC5C6;&#xB294; &#xAE30;&#xC99D;&#xC790; fluorophore &#xD30C;&#xAD34; fluorescein-5-maleimide&#xC640; &#xAE30;&#xC99D;&#xC790; fluorophore&#xC640;&#xC758; &#xC2DC;&#xAC04; &#xC0C1;&#xC218;&#xB97C; &#xCE21;&#xC815; &#xD558; &#xC5EC; &#xC218;&#xD589; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C; Albers &#xAC8C;&#xC2DC;&#xBB3C; &#xCCB4;&#xACC4;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC124;&#xBA85; &#xB41C; &#xB300;&#xB85C; &#xB450; &#xAC00;&#xC9C0; &#xC8FC;&#xC694; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xC0C1;&#xD0DC; (E1 &#xBC0F; E2) &#xAC04;&#xC758; &#xC774;&#xC628; &#xD38C;&#xD504; &#xC154;&#xD2C0;&#xC73C;&#xB85C; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xC0C1;&#xB300; &#xC6B4;&#xB3D9; &#xC870;&#xC0AC;&#xB97C; &#xD615;&#xAD11; &#xACF5;&#xBA85; &#xC5D0;&#xB108;&#xC9C0; &#xC804;&#xB2EC; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294;. &#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACB0;&#xACFC; &#xC54C;&#xD30C; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xC5D0; &#xAD00;&#xD558;&#xC5EC; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; &#xBC29;&#xD5A5;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBAA8;&#xB378;&#xC744; &#xD655;&#xC778; &#xD558; &#xACE0;&#xB294; &#xC54C;&#xD30C; &#xBC0F; &#xBCA0;&#xD0C0; subunits &#xC774;&#xB3D9; &#xC11C;&#xB85C; e 2 &#xC911; E1 &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xC804;&#xD658; &#xD558;&#xB294; &#xAC83;&#xC774; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Intermolecular &#xAC70;&#xB9AC; &#xC0AC;&#xC774;&#xB294; &#xC54C;&#xD30C;-&#xBC0F; &#xBCA0;&#xD0C0;-subunits&#xB294; Na&#xC758; fluorometric &#xCE21;&#xC815; + K +-ATPase.

El Na + / K +-ATPasa mantiene la fisiol&#xF3;gica de Na + y K + gradientes a trav&#xE9;s de la membrana plasm&#xE1;tica de las c&#xE9;lulas de la mayor&#xED;a de los animales. La unidad funcional de la bomba de iones est&#xE1; compuesta de dos subunidades obligatorios incluyendo la subunidad alfa, que media la hidr&#xF3;lisis de ATP y la translocaci&#xF3;n de iones, as&#xED; como la subunidad beta, que act&#xFA;a como una chaperona para promover la inserci&#xF3;n membrana adecuada y el tr&#xE1;fico en el plasma membrana. Para examinar la din&#xE1;mica de conformaci&#xF3;n entre el alfa-y beta-subunidades de la Na + / K +-ATPasa durante el transporte de iones, hemos utilizado la transferencia de energ&#xED;a de resonancia fluorescente, en condiciones de fijaci&#xF3;n de voltaje en ovocitos de Xenopus laevis, para diferenciar entre dos modelos que se han propuesto para la orientaci&#xF3;n relativa de la alfa-y subunidades beta. Estos experimentos se realizaron mediante la medici&#xF3;n de la constante de tiempo de destrucci&#xF3;n irreversible fluor&#xF3;foro donante con fluoresce&#xED;na-5-maleimida como el fluor&#xF3;foro donante y en presencia o ausencia de tetrametilrodamina-6-maleimida como el etiquetado fluor&#xF3;foro aceptor siguiendo en el M3-M4 o M5- M6 bucle de la subunidad alfa y la subunidad beta. Tambi&#xE9;n hemos utilizado la transferencia de energ&#xED;a de resonancia fluorescente para investigar el movimiento relativo entre las dos subunidades como los transbordadores de la bomba de iones entre los dos estados conformacionales principales (E1 y E2) como se describe en el esquema de Albers-Post. Los resultados de este estudio se han identificado un modelo para la orientaci&#xF3;n de la subunidad beta en relaci&#xF3;n con la subunidad alfa y sugieren que el alfa-beta y subunidades de movimiento hacia la otra durante la transici&#xF3;n conformacional E2 a E1.

Las mediciones fluorom&#xE9;tricos de distancias intermoleculares entre el alfa-y beta-subunidades de la Na + / K +-ATPasa

Na + K +-ATPase &#xCEE4;&#xD50C; &#xB18D;&#xB3C4; &#xAE30;&#xC628; &#xBCC0;&#xD654;&#xB3C4; &#xB300;&#xD558;&#xC5EC; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xB9C9;&#xC5D0; &#xAC78;&#xCCD0; ATP &#xC804;&#xC1A1; Na +&#xC640; K + &#xD654;&#xD559; &#xC5D0;&#xB108;&#xC9C0;. &#xC774;&#xC628; &#xD38C;&#xD504; &#xB450; &#xD544;&#xC218; subunits&#xC758; &#xAD6C;&#xC131;: &#xC8FC;&#xC694; &#xCD09;&#xB9E4; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xB294; &#xC54C;&#xD30C; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xC640; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778;&#xC744;&#xC758; &#xC801;&#xC808; &#xD55C; &#xC778;&#xC2E0; &#xB9E4;&#xB9E4;&#xC5D0; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;. &#xC77C;&#xBD80; &#xC870;&#xC9C1;&#xC5D0;&#xC11C;&#xB294; &#xC774;&#xC628; &#xD38C;&#xD504;&#xB294; &#xC120;&#xD0DD;&#xC801;&#xC778; &#xC138; &#xBC88;&#xC9F8; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;, &#xD38C;&#xD504; &#xD65C;&#xB3D9; &#xBCC0;&#xC870; &#xAC10;&#xB9C8; &#xD3EC;&#xD568; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774;&#xC628; &#xC218;&#xC1A1; &#xBC0F; &#xC54C;&#xD30C; &#xBC0F; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xD558;&#xC704; &#xB2E8;&#xC704; &#xC704;&#xCE58; &#xC911; &#xAC10;&#xB9C8; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xC5ED;&#xD559; &#xAC80;&#xC0AC;, &#xD615;&#xAD11; &#xACF5;&#xBA85; &#xC5D0;&#xB108;&#xC9C0; &#xC804;&#xB2EC; &#xC804;&#xC555; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504; &#xC870;&#xAC74; &#xD558;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0AC;&#xC6A9;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC99D;&#xAC70;&#xAC00; &#xAC10;&#xB9C8; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xB294; &#xC138;&#xD3EC; &#xC678; &#xB9C9; &#xD6A1;&#xB2E8; &#xC778;&#xD130;&#xD398;&#xC774;&#xC2A4;&#xC5D0; &#xC54C;&#xD30C; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; M2-M6-M9 &#xC8FC;&#xBA38;&#xB2C8;&#xC5D0; &#xC778;&#xC811; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Albers &#xAC8C;&#xC2DC;&#xBB3C; &#xCCB4;&#xACC4;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC124;&#xBA85; &#xD558;&#xB294; &#xB300;&#xB85C; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xB610;&#xD55C; &#xD615;&#xAD11; &#xACF5;&#xBA85; &#xC5D0;&#xB108;&#xC9C0; &#xC804;&#xB2EC; &#xC0AC;&#xC774; &#xB450; &#xAC00;&#xC9C0; &#xC8FC;&#xC694; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xC0C1;&#xD0DC;, E1 &#xBC0F; E2, &#xC774;&#xC628; &#xD38C;&#xD504; &#xC154;&#xD2C0; &#xC0C1;&#xB300; &#xC6B4;&#xB3D9;&#xC758; &#xC138; &#xAC00;&#xC9C0; &#xD558;&#xC704; &#xB2E8;&#xC704; &#xC870;&#xC0AC;&#xB97C; &#xC774;&#xC6A9; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACB0;&#xACFC; &#xC54C;&#xD30C;&#xC640; &#xAC10;&#xB9C8; subunits &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xAC70;&#xB9AC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0C1;&#xB300; &#xBCC0;&#xACBD; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; E2 E1 &#xC804;&#xD658; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xBCA0;&#xD0C0;&#xC640; &#xAC10;&#xB9C8; subunits &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xAC70;&#xB9AC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0C1;&#xB300; &#xBCC0;&#xACBD; &#xAC83;&#xC774; &#xC88B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C; &#xADF8; K +&#xC758; &#xAC10;&#xC18C;&#xB97C; &#xC720;&#xB3C4; &#xB77C;&#xBCA8; fluorophores&#xC640; &#xD2B9;&#xC815; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC5D0; &#xAC10;&#xB9C8; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; &#xAD00;&#xCC30;-&#xACE0;&#xC815; &#xC804;&#xB958;&#xB97C; &#xC720;&#xBC1C; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xACB0;&#xACFC; K + &#xD38C;&#xD504;&#xB97C; &#xC5B5;&#xC81C; &#xD558;&#xB294; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xD38C;&#xD504;&#xC758; &#xBC18;&#xC751; &#xC0AC;&#xC774;&#xD074;&#xC758; &#xBD84;&#xAE30;&#xC758; &#xC12D; &#xB3D9; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xBC30;&#xC5F4;&#xACFC; Na&#xC758; &#xAC10;&#xB9C8; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xC5ED;&#xD559; + K +-ATPase.

El Na + / K +-ATPasa a las parejas la energ&#xED;a qu&#xED;mica del ATP para el transporte de Na + y K + a trav&#xE9;s de la membrana plasm&#xE1;tica en contra de un gradiente de concentraci&#xF3;n. La bomba de iones est&#xE1; compuesta de dos subunidades obligatorios: la subunidad alfa, que es la subunidad catal&#xED;tica importante, y la subunidad beta, que se requiere para el tr&#xE1;fico adecuada del complejo a la membrana plasm&#xE1;tica. En algunos tejidos, la bomba de iones tambi&#xE9;n contiene una subunidad opcional tercera gamma, que modula la actividad de la bomba. Para examinar la din&#xE1;mica de conformaci&#xF3;n de la subunidad gamma durante el transporte de iones y su posici&#xF3;n en relaci&#xF3;n con el alfa y la subunidad beta, hemos utilizado la transferencia de energ&#xED;a de resonancia fluorescente bajo condiciones de tensi&#xF3;n de la abrazadera. A partir de estos experimentos, se demuestra que la subunidad gamma se encuentra adyacente a la cavidad M2-M6-M9 de la subunidad alfa en la interfase de transmembrana-extracelular. Tambi&#xE9;n hemos utilizado la transferencia de energ&#xED;a de resonancia fluorescente para investigar el movimiento relativo de las tres subunidades como los transbordadores de la bomba de iones entre los dos principales estados conformacionales, E1 y E2, seg&#xFA;n lo descrito por el r&#xE9;gimen de Albers-Post. Los resultados de este estudio sugieren que no hay cambio relativo en la distancia entre las subunidades alfa y gamma, pero hay un cambio relativo en la distancia entre las subunidades beta y gamma durante la transici&#xF3;n E2 a E1. Tambi&#xE9;n se observ&#xF3; que el etiquetado la subunidad gamma en residuos espec&#xED;ficos con fluor&#xF3;foros induce una disminuci&#xF3;n de K +-corriente inducida estacionaria. Este resultado podr&#xED;a ser debido a una perturbaci&#xF3;n en la rama de K + del ciclo de reacci&#xF3;n de la bomba, lo que representa una nueva forma de inhibir la bomba.

Disposici&#xF3;n estructural y din&#xE1;mica de conformaci&#xF3;n de la subunidad gamma de la Na + / K +-ATPasa

Na + / K +-ATPase &#x592B;&#x5987; ATP &#x5BF9;&#x8FD0;&#x8F93; Na + &#x548C; K + &#x8DE8;&#x819C;&#x5BF9;&#x6D53;&#x5EA6;&#x68AF;&#x5EA6;&#x7684;&#x5316;&#x5B66;&#x80FD;&#x91CF;&#x3002;&#x79BB;&#x5B50;&#x6CF5;&#x5F3A;&#x5236;&#x6027;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x4E9A;&#x5355;&#x4F4D;&#x7EC4;&#x6210;&#xFF1A; alpha &#x4E9A;&#x5355;&#x4F4D;&#xFF0C;&#x5373;&#x4E3B;&#x8981;&#x50AC;&#x5316;&#x4E9A;&#x5355;&#x4F4D;&#x548C; &beta; &#x4E9A;&#x57FA;&#xFF0C;&#x6240;&#x9700;&#x7684;&#x9002;&#x5F53;&#x8D29;&#x5356;&#x5230;&#x7EC6;&#x80DE;&#x8D28;&#x819C;&#x7684;&#x60C5;&#x7ED3;&#x3002;&#x5728;&#x4E00;&#x4E9B;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x4E2D;&#x79BB;&#x5B50;&#x6CF5;&#x8FD8;&#x5305;&#x542B;&#x53EF;&#x9009;&#x7B2C;&#x4E09;&#x4E2A;&#x4E9A;&#x5355;&#x4F4D;&#xFF0C;&#x8C03;&#x8282;&#x6CF5;&#x6D3B;&#x6027;&#x7684;&#x5C04;&#x7EBF;&#x3002;&#x4E3A;&#x79BB;&#x5B50;&#x8FD0;&#x8F93;&#x548C; &alpha; &#x548C; &beta; &#x4E9A;&#x57FA;&#x7684;&#x76F8;&#x5BF9;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x671F;&#x95F4;&#x7814;&#x7A76; &gamma; &#x4E9A;&#x57FA;&#x6784;&#x8C61;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x4F7F;&#x7528;&#x4E86;&#x8367;&#x5149;&#x5171;&#x632F;&#x80FD;&#x91CF;&#x8F6C;&#x79FB;&#x7535;&#x538B;&#x94B3;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x3002;&#x4ECE;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x4E2D;&#xFF0C;&#x5728;&#x63D0;&#x4F9B;&#x8BC1;&#x636E;&#x8868;&#x660E; &gamma; &#x4E9A;&#x57FA;&#x4F4D;&#x4E8E;&#x6BD7;&#x90BB;&#x7684;&#x8DE8;&#x819C;&#x80DE;&#x5916;&#x754C;&#x9762;&#x7684; alpha &#x4E9A;&#x5355;&#x4F4D; M2-M6-M9 &#x53E3;&#x888B;&#x91CC;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x4E5F;&#x7528;&#x8367;&#x5149;&#x5171;&#x632F;&#x80FD;&#x91CF;&#x8F6C;&#x79FB;&#x6765;&#x8C03;&#x67E5;&#x4E09;&#x4E2A;&#x4E9A;&#x57FA;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x79BB;&#x5B50;&#x6CF5;&#x822A;&#x5929;&#x98DE;&#x673A; E1 &#x548C; E2 &#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x4E3B;&#x8981;&#x6784;&#x8C61;&#x56FD;&#x5BB6;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F8;&#x5BF9;&#x8FD0;&#x52A8;&#x6240;&#x5F62;&#x5BB9;&#x7684;&#x535A;&#x65AF;&#x90AE;&#x653F;&#x8BA1;&#x5212;&#x3002;&#x4ECE;&#x8FD9;&#x9879;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x6CA1;&#x6709;&#x5728; &alpha;-&#x548C; &gamma; &#x4E9A;&#x57FA;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x8DDD;&#x79BB;&#x7684;&#x76F8;&#x5BF9;&#x53D8;&#x5316;&#xFF0C;&#x4F46;&#x6709; E2 E1 &#x8FC7;&#x6E21;&#x671F;&#x95F4;&#x7684; &beta; &#x548C; &gamma; &#x4E9A;&#x57FA;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x8DDD;&#x79BB;&#x76F8;&#x5BF9;&#x53D8;&#x5316;&#x3002;&#x4E5F;&#x6709;&#x4EBA;&#x8BA4;&#x4E3A;&#x8D34;&#x6807; &gamma; &#x4E9A;&#x57FA;&#x5728;&#x5177;&#x4F53;&#x6B8B;&#x7559;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x51CF;&#x5C11; K +-&#x56FA;&#x5B9A;&#x611F;&#x5E94;&#x7535;&#x6D41;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E00;&#x7ED3;&#x679C;&#x53EF;&#x80FD;&#x662F;&#x6CF5;&#x7684;&#x7531;&#x4E8E; K + &#x5206;&#x652F;&#xFF0C;&#x4EE3;&#x8868;&#x65B0;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#x6765;&#x6291;&#x5236;&#x6CF5;&#x7684;&#x53CD;&#x5E94;&#x5468;&#x671F;&#x4E2D;&#x7684;&#x6444;&#x52A8;&#x3002;

&#x7ED3;&#x6784;&#x5B89;&#x6392;&#x548C;&#x6784;&#x8C61;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x7684; &gamma; &#x4E9A;&#x57FA;&#x7684; Na + / K +-ATPase&#x3002;

The Na+/K+-ATPase couples the chemical energy in ATP to transport Na+ and K+ across the plasma membrane against a concentration gradient. The ion pump is composed of two mandatory subunits: the alpha subunit, which is the major catalytic subunit, and the beta subunit, which is required for proper trafficking of the complex to the plasma membrane. In some tissues, the ion pump also contains an optional third subunit, gamma, which modulates the pump activity. To examine the conformational dynamics of the gamma subunit during ion transport and its position in relation to the alpha and the beta subunits, we have used fluorescence resonance energy transfer under voltage clamp conditions. From these experiments, evidence is provided that the gamma subunit is located adjacent to the M2-M6-M9 pocket of the alpha subunit at the transmembrane-extracellular interface. We have also used fluorescence resonance energy transfer to investigate the relative movement of the three subunits as the ion pump shuttles between the two main conformational states, E1 and E2, as described by the Albers-Post scheme. The results from this study suggest that there is no relative change in distance between the alpha and gamma subunits but there is a relative change in distance between the beta and gamma subunits during the E2 to E1 transition. It was also observed that labeling the gamma subunit at specific residues with fluorophores induces a decrease in K+-induced stationary current. This result could be due to a perturbation in the K+ branch of the reaction cycle of the pump, representing a new way to inhibit the pump.

Structural arrangement and conformational dynamics of the gamma subunit of the Na+/K+-ATPase.

La Na + / K +-ATPase couples l&#x26;#39;&#xE9;nergie chimique de l&#x26;#39;ATP pour le transport de Na + et K + &#xE0; travers la membrane plasmique contre un gradient de concentration. La pompe &#xE0; ions est compos&#xE9; de deux sous-unit&#xE9;s obligatoires: la sous-unit&#xE9; alpha, qui est la sous-unit&#xE9; majeure catalytique, et la sous-unit&#xE9; b&#xEA;ta, qui est n&#xE9;cessaire pour la traite correct du complexe &#xE0; la membrane plasmique. Dans certains tissus, la pompe &#xE0; ions contient &#xE9;galement une troisi&#xE8;me sous-unit&#xE9; optionnelle, le gamma, qui module l&#x26;#39;activit&#xE9; de la pompe. Afin d&#x26;#39;examiner la dynamique conformationnelle de la sous-unit&#xE9; gamma pendant le transport des ions et sa position par rapport &#xE0; l&#x26;#39;alpha et les sous-unit&#xE9;s b&#xEA;ta, nous avons utilis&#xE9; Fluorescence Resonance Energy Transfer dans des conditions de serrage de tension. De ces exp&#xE9;riences, la preuve est apport&#xE9;e que la sous-unit&#xE9; gamma est situ&#xE9; &#xE0; c&#xF4;t&#xE9; de la poche M2-M6-M9 de la sous-unit&#xE9; alpha &#xE0; l&#x26;#39;interface transmembranaire-extracellulaire. Nous avons &#xE9;galement utilis&#xE9; Fluorescence Resonance Energy Transfer pour enqu&#xEA;ter sur le mouvement relatif des trois sous-unit&#xE9;s que les navettes de la pompe d&#x26;#39;ions entre les deux principaux &#xE9;tats conformationnels, E1 et E2, tels que d&#xE9;crits par le r&#xE9;gime Albers-Post. Les r&#xE9;sultats de cette &#xE9;tude sugg&#xE8;rent qu&#x26;#39;il n&#x26;#39;ya pas de changement par rapport &#xE0; la distance entre le sous-unit&#xE9;s alpha et gamma, mais il ya un changement par rapport &#xE0; la distance entre le sous-unit&#xE9;s b&#xEA;ta et gamma lors de l&#x26;#39;E2 &#xE0; E1 de transition. Il a &#xE9;galement &#xE9;t&#xE9; observ&#xE9; que l&#x26;#39;&#xE9;tiquetage de la sous-unit&#xE9; gamma au niveau des r&#xE9;sidus sp&#xE9;cifiques avec des fluorophores induit une diminution de K +-courant induit fixe. Ce r&#xE9;sultat pourrait &#xEA;tre d&#xFB; &#xE0; une perturbation dans la branche K + du cycle de la r&#xE9;action de la pompe, ce qui repr&#xE9;sente une nouvelle fa&#xE7;on d&#x26;#39;inhiber la pompe.

Agencement structurel et dynamique conformationnelle de la sous-unit&#xE9; gamma de la Na + / K +-ATPase

Der Na + / K +-ATPase Paare die chemische Energie in ATP zu transportieren Na + und K + &uuml;ber die Plasmamembran gegen einen Konzentrationsgradienten. Die Ion-Pumpe besteht aus zwei obligatorischen Untereinheiten: die alpha-Untereinheit, die die wichtigsten katalytische Untereinheit ist, und die Beta-Untereinheit, die f&uuml;r die ordnungsgem&auml;&szlig;e Handel des Komplexes an der Plasmamembran erforderlich ist. In manchen Geweben enth&auml;lt die Ion-Pumpe auch eine optionale dritte Untereinheit, Gamma, die die Pumpe-Aktivit&auml;t moduliert. Um die Konformations&auml;nderungen Dynamik der Gamma-Untereinheit w&auml;hrend Ionentransport und seine Position in Bezug auf die Alpha- und Beta-Untereinheiten zu untersuchen, haben wir die Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer unter Spannung Klemme Bedingungen verwendet. Diesen Experimenten ist Beweis vorausgesetzt, dass die Gamma-Untereinheit liegt neben der M2-M6-M9-Tasche von der alpha-Untereinheit an die Transmembran-extrazellul&auml;ren Schnittstelle. Wir haben Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer auch verwendet, um die relative Bewegung der drei Untereinheiten als die Ionen-Pumpe-Shuttles zwischen den beiden wichtigsten Konformations&auml;nderungen Staaten, E1 und E2, zu untersuchen, wie durch das Albers-Post-Schema beschrieben. Die Ergebnisse dieser Studie zufolge gibt es keine relative &Auml;nderung in der Distanz zwischen der Alpha und Gamma Untereinheiten, aber es gibt eine relative &Auml;nderung der Abstand zwischen der Beta- und Gamma-Untereinheiten w&auml;hrend der E2 E1-&Uuml;bergang. Es wurde auch beobachtet, dass Kennzeichnung der Gamma-Untereinheit an bestimmte R&uuml;ckst&auml;nde mit Fluorophore eine Abnahme der K induziert +-induzierte station&auml;re Str&ouml;mung. Dieses Ergebnis k&ouml;nnte durch eine St&ouml;rung in der K +-Zweig des Kreislaufs Reaktion der Pumpe, die einen neuen Weg um die Pumpe zu hemmen.

Strukturelle Anordnung und Konformations&auml;nderungen Dynamik der Gamma-Untereinheit der Na + / K +-ATPase.

Il Na + K +-ATPasi coppie l&#39;energia chimica in ATP per trasporto Na + e K + attraverso la membrana plasmatica contro un gradiente di concentrazione. La pompa dello ione &egrave; composta da due subunit&agrave; obbligatoria: la subunit&agrave; alfa, che &egrave; la subunit&agrave; catalitica pi&ugrave; importante, e la subunit&agrave; beta, che &egrave; richiesta per traffico adeguato del complesso alla membrana del plasma. In alcuni tessuti, la pompa dello ione contiene anche una subunit&agrave; terzo opzionale, gamma, che modula l&#39;attivit&agrave; di pompa. Per esaminare le dinamiche conformazionali della subunit&agrave; gamma durante il trasporto di ioni e la sua posizione in relazione l&#39;alfa e la subunit&agrave; beta, abbiamo usato fluorescenza resonance energy transfer in condizioni di tensione pinza. Da questi esperimenti, prove sono che purch&eacute; la subunit&agrave; gamma &egrave; situata adiacente alla tasca M2-M6-M9 della subunit&agrave; alfa dell&#39;interfaccia del transmembrane extracellulare. Abbiamo usato anche il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza per indagare il movimento relativo delle tre subunit&agrave; come le navette di pompa ionica tra i due principali Stati conformazionali, E1 ed E2, come descritto dallo schema di Albers-Post. I risultati di questo studio suggeriscono che non non c&#39;&egrave; nessun cambiamento relativo a distanza tra la subunit&agrave; alfa e gamma, ma c&#39;&egrave; un relativo cambiamento nella distanza tra le subunit&agrave; beta e gamma durante la transizione E1 E2. &Egrave; stato anche osservato che etichettare la subunit&agrave; gamma a specifici residui con fluorofori induce una diminuzione della K +-induced corrente stazionaria. Questo risultato potrebbe essere a causa di una perturbazione nel ramo K + il ciclo di reazione della pompa, che rappresenta un nuovo modo per inibire la pompa.

Arrangiamento strutturale e conformazionale dinamica della subunit&agrave; gamma del Na + K +-ATPasi.

ATP&#x306E;&#x5316;&#x5B66;&#x30A8;&#x30CD;&#x30EB;&#x30AE;&#x30FC;+-ATP&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x30AB;&#x30C3;&#x30D7;&#x30EB;&#x306E;Na + / K&#x306F;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x52FE;&#x914D;&#x306B;&#x9006;&#x3089;&#x3063;&#x3066;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x3092;&#x8D8A;&#x3048;&#x3066;Na +&#x3068;K +&#x3092;&#x8F38;&#x9001;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x306B;&#x8907;&#x5408;&#x4F53;&#x306E;&#x9069;&#x5207;&#x306A;&#x58F2;&#x8CB7;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x5FC5;&#x8981;&#x3068;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x89E6;&#x5A92;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3B1;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x3B2;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#xFF1A;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x30DD;&#x30F3;&#x30D7;&#x306F;&#x3001;2&#x3064;&#x306E;&#x5FC5;&#x9808;&#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x69CB;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x7D44;&#x7E54;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x30DD;&#x30F3;&#x30D7;&#x306F;&#x3001;&#x30DD;&#x30F3;&#x30D7;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3059;&#x308B;&#x30AA;&#x30D7;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x4E09;&#x756A;&#x76EE;&#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3001;&#x3B3;&#x304C;&#x542B;&#x307E;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002; &#x3B1;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x3B2;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3068;&#x306E;&#x95A2;&#x4FC2;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x8F38;&#x9001;&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x4F4D;&#x7F6E;&#x306E;&#x9593;&#x306B;&#x3B3;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x30C0;&#x30A4;&#x30CA;&#x30DF;&#x30AF;&#x30B9;&#x3092;&#x8ABF;&#x3079;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x96FB;&#x5727;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x3067;&#x306E;&#x86CD;&#x5149;&#x5171;&#x9CF4;&#x30A8;&#x30CD;&#x30EB;&#x30AE;&#x30FC;&#x79FB;&#x52D5;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x304B;&#x3089;&#x3001;&#x8A3C;&#x62E0;&#x306F;&#x3B3;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306F;&#x819C;&#x8CAB;&#x901A;&#x7D30;&#x80DE;&#x754C;&#x9762;&#x3067;&#x306E;&#x3B1;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;M2-M6-M9&#x306E;&#x30DD;&#x30B1;&#x30C3;&#x30C8;&#x306B;&#x96A3;&#x63A5;&#x3057;&#x3066;&#x914D;&#x7F6E;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x30A2;&#x30EB;&#x30D0;&#x30FC;&#x30B9;&#x30DD;&#x30B9;&#x30C8;&#x65B9;&#x5F0F;&#x3067;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x305F;2&#x3064;&#x306E;&#x4E3B;&#x8981;&#x306A;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x306E;&#x72B6;&#x614B;&#x3001;E1&#x3068;E2&#x3068;&#x306E;&#x9593;&#x306E;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x30DD;&#x30F3;&#x30D7;&#x306E;&#x30B7;&#x30E3;&#x30C8;&#x30EB;&#x30D0;&#x30B9;&#x3068;&#x3057;&#x3066;3&#x3064;&#x306E;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x76F8;&#x5BFE;&#x7684;&#x306A;&#x79FB;&#x52D5;&#x3092;&#x8ABF;&#x67FB;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x86CD;&#x5149;&#x5171;&#x9CF4;&#x30A8;&#x30CD;&#x30EB;&#x30AE;&#x30FC;&#x79FB;&#x52D5;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x304B;&#x3089;&#x3001;&#x3B1;&#x3068;&#x3B3;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x9593;&#x306E;&#x8DDD;&#x96E2;&#x306B;&#x306F;&#x76F8;&#x5BFE;&#x7684;&#x306A;&#x5909;&#x5316;&#x306F;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x5506;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x304C;&#x3001;E1&#x3078;&#x306E;&#x9077;&#x79FB;&#x6642;&#x306B;E2&#x3B2;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x3B3;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x9593;&#x306E;&#x8DDD;&#x96E2;&#x306E;&#x76F8;&#x5BFE;&#x7684;&#x306A;&#x5909;&#x5316;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x4F53;&#x306E;&#x7279;&#x5B9A;&#x306E;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x30AC;&#x30F3;&#x30DE;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x30E9;&#x30D9;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x3059;&#x308B;K +&#x8A98;&#x767A;&#x5B9A;&#x5E38;&#x96FB;&#x6D41;&#x306E;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3092;&#x8A98;&#x5C0E;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x89B3;&#x5BDF;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x30DD;&#x30F3;&#x30D7;&#x3092;&#x963B;&#x5BB3;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x8868;&#x3059;&#x30DD;&#x30F3;&#x30D7;&#x306E;&#x53CD;&#x5FDC;&#x30B5;&#x30A4;&#x30AF;&#x30EB;&#x306E;K +&#x5206;&#x5C90;&#x306E;&#x6442;&#x52D5;&#x306E;&#x539F;&#x56E0;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x53EF;&#x80FD;&#x6027;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x306E;Na + / K +-ATPase&#x306E;&#x3B3;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x69CB;&#x9020;&#x7684;&#x914D;&#x7F6E;&#x3068;&#x69CB;&#x9020;&#x52D5;&#x529B;&#x5B66;

&Beta;-&#x4E9A;&#x57FA;&#x7684;&#x94A0;&#x3001; &#x94BE;&#x817A;&#x548C; H&#x3001; K-ATPase &#x5728;&#x6210;&#x719F;&#x548C;&#x7B49;&#x79BB;&#x5B50;&#x819C;&#x50AC;&#x5316; &alpha;-&#x4E9A;&#x5355;&#x4F4D;&#x9488;&#x5BF9;&#x5177;&#x6709;&#x91CD;&#x8981;&#x529F;&#x80FD;&#xFF0C;&#x4F46;&#x4E5F;&#x5BF9;&#x8C03;&#x8282; holoenzymes &#x7684;&#x8FD0;&#x8F93;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x9879;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x663E;&#x793A;&#x7684; Na&#x3001; K-&#x548C;&#x80C3; H&#xFF0C;&#x8DE8;&#x819C;&#x57DF;&#x4E2D;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x4FDD;&#x5B88;&#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#x8272;&#x6C28;&#x9178;&#x66FF;&#x4EE3; K-ATPase &beta;-&#x4E9A;&#x57FA;&#x5BFC;&#x81F4;&#x5F88;&#x5927;&#x7684;&#x53D8;&#x5316;&#xFF0C;&#x5BF9; E1P &#x56FD;&#x5BB6;&#x7535;&#x538B;&#x4F9D;&#x8D56;&#x6027; E1P/E2P &#x5206;&#x5E03;&#x7684;&#x63A8;&#x65AD; presteady &#x72B6;&#x6001;&#x7535;&#x6D41;&#x548C;&#x7535;&#x538B;&#x94B3;&#x8367;&#x5149;&#x6D4B;&#x91CF;&#x7684; tetramethylrhodamine 6 &#x9A6C;&#x6765;&#x9170;&#x4E9A;&#x80FA;&#x6807;&#x7684;&#x6709;&#x4E09;&#x3002;&#x6784;&#x8C61;&#x5E73;&#x8861;&#x7684;&#x53D8;&#x5316;&#x76F8;&#x4F34;&#x968F;&#x7684;&#x80DE;&#x5916; K + &#x9002;&#x5EA6;&#x7684;&#x94A0;&#x3001; &#x94BE;&#x817A; beta-(Y39W,Y43W) &#x7A81;&#x53D8;&#xFF0C;&#x4F46;&#x5F88;&#x591A;&#x76F8;&#x5E94;&#x7684; H&#x3001; K-ATPase beta-(Y44W,Y48W) &#x53D8;&#x91CF;&#x65B9;&#x9762;&#x66F4;&#x4E3A;&#x660E;&#x663E;&#xFF0C;&#x660E;&#x663E;&#x4EB2;&#x7F18;&#x5173;&#x7CFB;&#x663E;&#x8457;&#x4E0B;&#x8DCC;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#x5728; Na&#x3001; K-ATPase beta-(Y39W,Y43W) &#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x79CD;&#xFF0C;&#x663E;&#x7136;&#x901F;&#x7387;&#x5E38;&#x6570;&#x4E3A;&#x53CD;&#x5411;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7684;&#x80DE;&#x5916; Na + &#x548C;&#x540E;&#x9762;&#x7684; E2P E1P &#x8F6C;&#x6362;&#xFF0C;&#x786E;&#x5B9A;&#x4ECE;&#x77AC;&#x6001;&#x7535;&#x6D41;&#x7684;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#xFF0C;&#x5927;&#x5927;&#x52A0;&#x901F;&#x4E86;&#xFF0C;&#x5BFC;&#x81F4;&#x589E;&#x5F3A; Na + &#x7ADE;&#x4E89;&#x80DE;&#x5916; K + &#x5728;&#x7528;&#x4E8E;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x5C24;&#x5176;&#x662F;&#x6781;&#x5176;&#x4E0D;&#x5229;&#x7684;&#x6F5C;&#x529B;&#x3002;&#x7C7B;&#x63A8;&#x7684; H&#x3001; K-ATPase beta-(Y44W,Y48W) &#x7A81;&#x53D8;&#xFF0C;&#x52A0;&#x901F;&#x4E86;&#x53CD;&#x5411;&#x7684;&#x80DE;&#x5916;&#x8D28;&#x5B50;&#x548C;&#x540E;&#x9762;&#x7684; E2P E1P &#x8F6C;&#x6362;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x548C; H + &#x5206;&#x6CCC;&#x662F;&#x5F3A;&#x70C8;&#x53D7;&#x635F;&#x3002;Na&#x3001; K &#x548C; H&#x3001; K-ATPase alpha &#x4E9A;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x8DDD;&#x79BB;&#x5230; beta &#x916A;&#x6C28;&#x9178;&#xFF0C;&#x5BFC;&#x81F4;&#x7C7B;&#x4F3C; E1 &#x8F6E;&#x73ED;&#xFF0C;&#x6307;&#x793A;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x53C2;&#x4E0E;&#x7A33;&#x5B9A; E2 M7 &#x6BB5;&#x4E2D;&#x6B8B;&#x7559;&#x91CF;&#x7684;&#x663E;&#x8457;&#x8272;&#x6C28;&#x9178;&#x66FF;&#x6362;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x8DE8;&#x819C;&#x533A;&#x57DF;&#x7684; &alpha;-&#x548C; &beta;-&#x4E9A;&#x7684; P2C &#x578B;&#x4E09;&#x5185;&#x9009;&#x5B9A;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x65BD;&#x52A0; E2 &#x7A33;&#x5B9A;&#x6548;&#x5E94;&#xFF0C;&#x5373;&#x4E3A;&#x6709;&#x6548; H + &#x62BD;&#x7684; H&#x3001; K-ATPase &#x4F53;&#x5185;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x7279;&#x522B;&#x91CD;&#x8981;&#x7684;&#x610F;&#x4E49;&#x3002;

Na&#x3001; K &#x548C; H&#x3001; K-ATPase &#x7279;&#x5B9A;&#x7684; &alpha; &beta; &#x4E9A;&#x4EA4;&#x4E92; E2 &#x72B6;&#x6001;&#x7A33;&#x5B9A;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x610F;&#x4E49;&#x3002;

The beta-subunits of Na,K-ATPase and H,K-ATPase have important functions in maturation and plasma membrane targeting of the catalytic alpha-subunit but also modulate the transport activity of the holoenzymes. In this study, we show that tryptophan replacement of two highly conserved tyrosines in the transmembrane domain of both Na,K- and gastric H,K-ATPase beta-subunits resulted in considerable shifts of the voltage-dependent E1P/E2P distributions toward the E1P state as inferred from presteady-state current and voltage clamp fluorometric measurements of tetramethylrhodamine-6-maleimide-labeled ATPases. The shifts in conformational equilibria were accompanied by significant decreases in the apparent affinities for extracellular K+ that were moderate for the Na,K-ATPase beta-(Y39W,Y43W) mutation but much more pronounced for the corresponding H,K-ATPase beta-(Y44W,Y48W) variant. Moreover in the Na,K-ATPase beta-(Y39W,Y43W) mutant, the apparent rate constant for reverse binding of extracellular Na+ and the subsequent E2P-E1P conversion, as determined from transient current kinetics, was significantly accelerated, resulting in enhanced Na+ competition for extracellular K+ binding especially at extremely negative potentials. Analogously the reverse binding of extracellular protons and subsequent E2P-E1P conversion was accelerated by the H,K-ATPase beta-(Y44W,Y48W) mutation, and H+ secretion was strongly impaired. Remarkably tryptophan replacements of residues in the M7 segment of Na,K- and H,K-ATPase alpha-subunits, which are at interacting distance to the beta-tyrosines, resulted in similar E1 shifts, indicating their participation in stabilization of E2. Thus, interactions between selected residues within the transmembrane regions of alpha- and beta-subunits of P2C-type ATPases exert an E2-stabilizing effect, which is of particular importance for efficient H+ pumping by H,K-ATPase under in vivo conditions.

Functional significance of E2 state stabilization by specific alpha/beta-subunit interactions of Na,K- and H,K-ATPase.

Les sous-unit&#xE9;s b&#xE9;ta-de Na, K-ATPase et H, K-ATPase ont des fonctions importantes dans la maturation et la membrane plasmique de ciblage de l&#x26;#39;alpha-sous-unit&#xE9; catalytique, mais aussi de moduler l&#x26;#39;activit&#xE9; de transport des holoenzymes. Dans cette &#xE9;tude, nous montrons que le remplacement de deux tyrosines tryptophane hautement conserv&#xE9;es dans le domaine transmembranaire de deux Na, K et H gastrique, K-ATPase b&#xEA;ta-sous-unit&#xE9;s a entra&#xEE;n&#xE9; des changements consid&#xE9;rables des distributions E1P/E2P voltage-d&#xE9;pendants &#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;gard de la E1P Etat comme d&#xE9;duit de presteady &#xE9;tatiques mesures avec la pince de courant et tension fluorom&#xE9;triques des ATPases t&#xE9;tram&#xE9;thylrhodamine-6-mal&#xE9;imide-&#xE9;tiquet&#xE9;s. Les changements dans les &#xE9;quilibres conformationnels ont &#xE9;t&#xE9; accompagn&#xE9;es par des baisses importantes dans les affinit&#xE9;s apparentes pour K + extracellulaire qui &#xE9;taient mod&#xE9;r&#xE9;s pour la Na, K-ATPase b&#xEA;ta-(Y39W, Y43W) mutation, mais beaucoup plus prononc&#xE9;e pour le correspondant H, K-ATPase b&#xEA;ta-( Y44W, Y48W) variante. En outre, dans la Na, K-ATPase b&#xEA;ta-(Y39W, Y43W) mutant, la constante de vitesse apparente pour la liaison inverse de Na + extracellulaire et la subs&#xE9;quente E2P-E1P de conversion, tel que d&#xE9;termin&#xE9; &#xE0; partir transitoires cin&#xE9;tique actuels, a &#xE9;t&#xE9; consid&#xE9;rablement acc&#xE9;l&#xE9;r&#xE9;, ce qui entra&#xEE;ne accrue de Na + la concurrence pour K + extracellulaire liant en particulier &#xE0; des potentiels tr&#xE8;s n&#xE9;gatifs. De mani&#xE8;re analogue la liaison inverse de protons extracellulaires et la suite E2P-E1P de conversion a &#xE9;t&#xE9; acc&#xE9;l&#xE9;r&#xE9;e par le H, K-ATPase b&#xEA;ta-(Y44W, Y48W) mutation, et la s&#xE9;cr&#xE9;tion de H + a &#xE9;t&#xE9; fortement compromise. Remarquablement remplacements de r&#xE9;sidus tryptophane dans le segment M7 de Na, K et H, K-ATPase sous-unit&#xE9;s alpha, qui sont &#xE0; l&#x26;#39;interaction &#xE0; distance &#xE0; la b&#xEA;ta-tyrosines, a abouti &#xE0; des changements similaires E1, indiquant leur participation &#xE0; la stabilisation de l&#x26;#39;E2. Ainsi, les interactions entre les r&#xE9;sidus s&#xE9;lectionn&#xE9;s dans les r&#xE9;gions transmembranaires d&#x26;#39;alpha-et b&#xEA;ta-sous-unit&#xE9;s de P2C-ATPases de type exercer un effet stabilisateur E2-, qui est d&#x26;#39;une importance particuli&#xE8;re pour l&#x26;#39;efficacit&#xE9; de pompage H + par H, K-ATPase dans des conditions in vivo.

Signification fonctionnelle de stabilisation Etat E2 par Alpha sp&#xE9;cifiques / sous-unit&#xE9; b&#xEA;ta Interactions de Na, K et H, K-ATPase

Die Beta-Untereinheiten des Na, K-ATPase und H, K-ATPase haben wichtige Funktionen in der Reifung und Plasmamembran von der katalytischen Alpha-Untereinheit aber auch modulieren der Bef&ouml;rderungst&auml;tigkeit von der Holoenzymes. In dieser Studie zeigen wir, dass Tryptophan der Ersatz von zwei stark konservierten Tyrosines in das Transmembranegebiet Na, K - sowohl Magen H, K-ATPase Beta-Untereinheiten in erhebliche Verschiebungen der Spannung-abh&auml;ngigen E1P/E2P Distributionen gegen&uuml;ber den E1P Zustand gef&uuml;hrt, wie aus Presteady-Staat Strom- und Spannungsmessungen Klemme fluorometrischen von Tetramethylrhodamine-6-Maleimide-beschrifteten ATPasen hergeleitet. Die Verschiebungen Konformations&auml;nderungen Gleichgewichte wurden begleitet von wesentlichen Minderungen der offensichtlichen Affinit&auml;ten f&uuml;r extrazellul&auml;re K +, die moderate f&uuml;r die Na-K-ATPase beta-(Y39W,Y43W) Mutation, aber viel ausgepr&auml;gter f&uuml;r die entsprechenden H, K-ATPase beta-(Y44W,Y48W) Variante waren. Au&szlig;erdem in der Na, K-ATPase beta-(Y39W,Y43W) Mutant, die scheinbare bewerten f&uuml;r umgekehrte Bindung des extrazellul&auml;ren Na + und die anschlie&szlig;ende E2P-E1P-Konvertierung, konstant, wie von Transienten aktuelle Kinetics bestimmt, wurde erheblich beschleunigt, die in erweiterten Na + Wettbewerb extrazellul&auml;re K +-Bindung vor allem bei extrem negative Potentiale. Analog wurde das umgekehrte binden extrazellul&auml;re Protonen und sp&auml;tere E2P-E1P Umwandlung von H, K-ATPase beta-(Y44W,Y48W) Mutation, beschleunigt und H +-Sekretion war stark beeintr&auml;chtigt. Bemerkenswert Tryptophan Ersetzungen von R&uuml;ckst&auml;nden im Segment M7 von Na, K und H, K-ATPase Alpha-Untereinheiten, die in interagierenden Abstand zu den Beta-Tyrosines, ergab &auml;hnliche E1 Schichten, ihre Beteiligung an der Stabilisierung des E2 Angabe sind. Wechselwirkungen zwischen ausgew&auml;hlten R&uuml;ckst&auml;nde innerhalb der Transmembran-Regionen von Alpha - und Beta-Untereinheiten des P2C-Typ-ATPasen &uuml;ben somit eine E2-stabilisierende Wirkung, die von besonderer Bedeutung f&uuml;r effiziente H + Pumpen von H, K-ATPase unter in-vivo-Bedingungen ist.

Funktionelle Bedeutung der E2 staatliche Stabilisierung von spezifischen Alpha/Beta-Untereinheit Wechselwirkungen von Na, K, H, K-ATPase.

La subunit&agrave; beta di Na, K-ATPasi e H, K-ATPasi hanno importanti funzioni nella maturazione e la membrana plasmatica targeting della Alfa-subunit&agrave; catalitica ma anche modulano l&#39;attivit&agrave; di trasporto della holoenzymes. In questo studio, mostriamo che la sostituzione di due tirosine altamente conservate nel dominio transmembrana di Na, K - e H gastrico, triptofano subunit&agrave; beta K-ATPasi ha provocato notevoli spostamenti delle distribuzioni E1P/E2P voltaggio-dipendenti verso lo stato E1P come dedotto da presteady corrente e tensione pinza fluorometriche misurazioni della ATPasi tetrametilrodamina-6-con-etichettati. I turni in equilibri conformazionali sono stati accompagnati da significative diminuzioni nelle affinit&agrave; apparente per K + extracellulare che erano moderate per Na, mutazione beta-(Y39W,Y43W) K-ATPasi, ma molto pi&ugrave; pronunciata per il corrispondente H, variante di beta-(Y44W,Y48W) K-ATPasi. Inoltre in Na, mutante beta-(Y39W,Y43W) K-ATPasi, l&#39;apparente tasso costante per l&#39;associazione inversa di Na + extracellulare e la successiva conversione E2P-E1P, come determinato da cinetica corrente transitoria, &egrave; stata significativamente accelerata, con conseguente maggiore Na + concorso per extracellulare K + associazione soprattutto a potenziali estremamente negativi. Analogamente l&#39;associazione inversa di protoni extracellulari e la successiva conversione E2P-E1P &egrave; stata accelerata dall&#39;H, mutazione di K-ATPasi beta-(Y44W,Y48W), e H + secrezione era fortemente compromessa. Notevolmente sostituzioni di triptofano dei residui nel segmento M7 di Na, K e H, K-ATPasi alfa subunit&agrave;, che sono a distanza interagente per la beta-tirosine, portato a simili turni E1, indicando la loro partecipazione nella stabilizzazione di E2. Cos&igrave;, le interazioni tra residui selezionati all&#39;interno delle regioni transmembrane di alfa e beta-subunit&agrave; di P2C-tipo ATPasi esercitano un effetto stabilizzante sulla E2, che &egrave; di particolare importanza per efficiente H + pompaggio di H, K-ATPasi nelle condizioni in vivo.

Significato funzionale della stabilizzazione di stato E2 da interazioni specifiche alfa/beta-subunit&agrave; di Na, K e H, K-ATPasi.

&#x306E;Na&#x3001;K-ATPase&#x304A;&#x3088;&#x3073;H&#x306E;&#x3B2;-&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306F;&#x3001;K-ATPase&#x306F;&#x3001;&#x3B1;-&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x89E6;&#x5A92;&#x306E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x6210;&#x719F;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x819C;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3060;&#x3051;&#x3067;&#x306A;&#x304F;&#x3001;holoenzymes&#x306E;&#x8F38;&#x9001;&#x6D3B;&#x6027;&#x3092;&#x8ABF;&#x7BC0;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3067;&#x306F;&#x7814;&#x7A76;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;Na&#x3001;K-&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x80C3;H&#x3001;K-ATPase&#x306E;&#x3B2;&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x306E;&#x819C;&#x8CAB;&#x901A;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x5185;&#x306E;2&#x3064;&#x306E;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x306B;&#x4FDD;&#x5B58;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x306E;&#x305D;&#x306E;&#x30C8;&#x30EA;&#x30D7;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A1;&#x30F3;&#x4EA4;&#x63DB;&#x304C;E1P&#x306B;&#x5411;&#x304B;&#x3063;&#x3066;&#x96FB;&#x4F4D;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;E1P/E2P&#x5206;&#x5E03;&#x306E;&#x304B;&#x306A;&#x308A;&#x306E;&#x30B7;&#x30D5;&#x30C8;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x30C6;&#x30C8;&#x30E9;&#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;-6  - &#x30DE;&#x30EC;&#x30A4;&#x30DF;&#x30C9;&#x6A19;&#x8B58;ATP&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;presteady&#x72B6;&#x614B;&#x306E;&#x96FB;&#x6D41;&#x3068;&#x96FB;&#x5727;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x86CD;&#x5149;&#x6E2C;&#x5B9A;&#x304B;&#x3089;&#x63A8;&#x5B9A;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x72B6;&#x614B;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x5E73;&#x8861;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x306F;&#x3001;Na&#x3001;K-ATPase&#x306E;&#x3B2;-&#xFF08;Y39W&#x3001;Y43W&#xFF09;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x7A4F;&#x5065;&#x6D3E;&#x304C;&#x3001;&#x5BFE;&#x5FDC;&#x3059;&#x308B;H&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x306F;&#x308B;&#x304B;&#x306B;&#x9855;&#x8457;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x7D30;&#x80DE;&#x5916;&#x306E;K +&#x306E;&#x898B;&#x304B;&#x3051;&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x304C;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x6E1B;&#x5C11;&#x3057;&#x3001;K-ATPase&#x306E;&#x3B2;-&#xFF08;&#x3092;&#x4F34;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x305F;Y44W&#x3001;Y48W&#xFF09;&#x30D0;&#x30EA;&#x30A2;&#x30F3;&#x30C8;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x306F;Na&#x3001;K-ATPase&#x306E;&#x3B2;-&#xFF08;Y39W&#x3001;Y43W&#xFF09;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x3067;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x5916;&#x306E;Na&#x306E;&#x9006;&#x7D50;&#x5408;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x4E00;&#x5B9A;&#x306E;&#x898B;&#x304B;&#x3051;&#x306E;&#x901F;&#x5EA6;+&#x3068;&#x305D;&#x306E;&#x5F8C;&#x306E;E2P-E1P&#x5909;&#x63DB;&#x306F;&#x3001;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x904E;&#x6E21;&#x96FB;&#x6D41;&#x53CD;&#x5FDC;&#x901F;&#x5EA6;&#x304B;&#x3089;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3055;&#x308C;&#x3001;&#x5927;&#x5E45;&#x306B;&#x5F37;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30CA;&#x305D;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x3001;&#x52A0;&#x901F;&#x3055;&#x308C;&#x305F;+&#x7D30;&#x80DE;&#x5916;K +&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x7AF6;&#x4E89;&#x3001;&#x7279;&#x306B;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x8CA0;&#x306E;&#x96FB;&#x4F4D;&#x306B;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x540C;&#x69D8;&#x306B;&#x7D30;&#x80DE;&#x5916;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30F3;&#x3068;&#x3001;&#x5F8C;&#x7D9A;&#x306E;E2P-E1P&#x5909;&#x63DB;&#x306E;&#x9006;&#x7D50;&#x5408;&#x306F;&#x3001;H&#x3001;K-ATPase&#x306E;&#x3B2;-&#xFF08;Y44W&#x3001;Y48W&#xFF09;&#x5909;&#x7570;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x52A0;&#x901F;&#x3055;&#x308C;&#x3001;H +&#x5206;&#x6CCC;&#x304C;&#x5F37;&#x304F;&#x969C;&#x5BB3;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3002;&#x8457;&#x3057;&#x304F;&#x30C8;&#x30EA;&#x30D7;&#x30C8;&#x30D5;&#x30A1;&#x30F3;Na&#x306E;M7&#x30BB;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x5185;&#x306E;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306E;&#x7F6E;&#x63DB;&#x200B;&#x200B;&#x3001;K&#x3068;H&#x3001;&#x3B2;-&#x30C1;&#x30ED;&#x30B7;&#x30F3;&#x307E;&#x3067;&#x306E;&#x8DDD;&#x96E2;&#x3092;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306B;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;K-ATP&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x3B1;-&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306F;&#x3001;E2&#x306E;&#x5B89;&#x5B9A;&#x5316;&#x3078;&#x306E;&#x53C2;&#x52A0;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x3001;&#x985E;&#x4F3C;&#x3057;&#x305F;E1&#x306E;&#x30B7;&#x30D5;&#x30C8;&#x3092;&#x3082;&#x305F;&#x3089;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;P2C&#x578B;ATP&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x3B1;-&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x3B2;-&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x819C;&#x8CAB;&#x901A;&#x9818;&#x57DF;&#x5185;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x6B8B;&#x57FA;&#x9593;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x304C;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;H&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x7279;&#x306B;&#x91CD;&#x8981;&#x3067;&#x3042;&#x308B;E2-&#x5B89;&#x5B9A;&#x5316;&#x52B9;&#x679C;&#x3001;+&#x751F;&#x4F53;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x3067;&#x306E;&#x4E0B;&#x3067;H&#x3001;K-ATP&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30DD;&#x30F3;&#x30D4;&#x30F3;&#x30B0;&#x3092;&#x767A;&#x63EE;&#x3059;&#x308B;&#x3002;

&#x306E;Na&#x3001;K&#x3068;H&#x3001;K-ATP&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x3B1;/&#x3B2;-&#x30B5;&#x30D6;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x76F8;&#x4E92;&#x4F5C;&#x7528;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;E2&#x72B6;&#x614B;&#x306E;&#x5B89;&#x5B9A;&#x5316;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x7684;&#x610F;&#x7FA9;

Na, K ATPase H, K Atpase&#xC758; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xD558;&#xC704; &#xB2E8;&#xC704; &#xC131;&#xC219; &#xBC0F; &#xD50C;&#xB77C;&#xC988;&#xB9C8; &#xBA64;&#xBE0C;&#xB808;&#xC778;&#xC758; &#xCD09;&#xB9E4; &#xC54C;&#xD30C; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xB97C; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744;&#xAC00;&#xC9C0;&#xACE0; &#xC788;&#xC9C0;&#xB9CC;&#xB294; holoenzymes&#xC758; &#xC804;&#xC1A1; &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xC870;&#xC808;. &#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; K ATPase &#xBCA0;&#xD0C0; &#xD558;&#xC704; &#xB2E8;&#xC704; presteady &#xC0C1;&#xD0DC; &#xC804;&#xB958; &#xBC0F; &#xC804;&#xC555; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504; tetramethylrhodamine 6 maleimide &#xB808;&#xC774;&#xBE14; Atpases&#xC758; fluorometric &#xCE21;&#xC815;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC720;&#xCD94;&#xB85C; E1P &#xC0C1;&#xD0DC;&#xB97C; &#xD5A5;&#xD574; &#xC804;&#xC555; &#xC885;&#xC18D; E1P/E2P &#xBC30;&#xD3EC;&#xD310;&#xC758; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; &#xBCC0;&#xD654; &#xADC0;&#xCC29;&#xB418; &#xB450; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xBCF4;&#xC874;&#xB41C; tyrosines Na, K-&#xC640; &#xC704; H&#xC758; &#xB9C9; &#xD6A1;&#xB2E8; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC758; &#xD2B8;&#xB9BD;&#xD1A0;&#xD310; &#xAD50;&#xCCB4;&#xB97C; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xD3C9;&#xD615;&#xC5D0; &#xBCC0;&#xD654; &#xD588;&#xB2E4; Na, K ATPase beta-(Y39W,Y43W) &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xD6E8;&#xC52C; &#xB354; &#xD574;&#xB2F9; H K ATPase beta-(Y44W,Y48W) &#xBCC0;&#xC885;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBC1C;&#xC74C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC801;&#xB2F9; &#xD55C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC678; K +&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBA85;&#xBC31;&#xD55C; affinities &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; &#xAC10;&#xC18C;&#xC5D0; &#xD568;&#xAED8; &#xD588;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C; Na, K ATPase beta-(Y39W,Y43W) &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774;&#xC5D0; &#xBA85;&#xBC31;&#xD55C; &#xACFC;&#xB3C4; &#xC804;&#xB958; &#xC18D;&#xB3C4; &#xB860;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACB0;&#xC815; &#xB41C; &#xC138;&#xD3EC; &#xC678; Na + &#xBC0F; &#xD6C4;&#xC18D; E2P-E1P &#xBCC0;&#xD658;&#xC758; &#xC5ED;&#xBC29;&#xD5A5; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC744; &#xC704;&#xD574; &#xC77C;&#xC815; &#xC18D;&#xB3C4;, &#xAC00;&#xC18D; &#xD06C;&#xAC8C;&#xB294; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xBD80;&#xC815;&#xC801;&#xC778; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xB825;&#xC5D0; &#xD2B9;&#xD788; &#xC138;&#xD3EC; &#xC678; K + &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; Na + &#xACBD;&#xC7C1;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC;&#xB85C;. &#xC138;&#xD3EC; &#xC678; &#xC591;&#xC790;&#xC640; &#xD6C4;&#xC18D; E2P-E1P &#xBCC0;&#xD658;&#xC758; &#xC5ED;&#xBC29;&#xD5A5; &#xBC14;&#xC778;&#xB529; H K ATPase beta-(Y44W,Y48W) &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xC758;&#xD574; &#xAC00;&#xC18D; &#xD588;&#xB2E4; &#xBE44;&#xC2B7;&#xD558;&#xAC8C; &#xD558; &#xACE0; H + &#xBD84; &#xBE44;&#xB294; &#xAC15;&#xB825; &#xD558; &#xAC8C; &#xC7A5;&#xC560;&#xC778;. Na, K &#xBC0F; H, K ATPase &#xC54C;&#xD30C;-&#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;, &#xBCA0;&#xD0C0;-tyrosines, &#xAD50;&#xB300;, E1 &#xBE44;&#xC2B7;&#xD55C; &#xACB0;&#xACFC;&#xB97C; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xAC70;&#xB9AC;&#xC5D0;&#xB294; e 2&#xC758; &#xC548;&#xC815;&#xD654;&#xC5D0; &#xCC38;&#xC5EC;&#xB97C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; &#xC788;&#xB294; M7 &#xC138;&#xADF8;&#xBA3C;&#xD2B8;&#xC5D0; &#xC788;&#xB294; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC758; &#xB208;&#xC5D0; &#xB744;&#xAC8C; &#xD2B8;&#xB9BD;&#xD1A0;&#xD310; &#xAD50;&#xCCB4;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;,&#xC758; &#xC54C;&#xD30C;-&#xBC0F; &#xBCA0;&#xD0C0;-subunits P2C &#xD615; Atpases&#xC758; &#xB9C9; &#xD6A1;&#xB2E8; &#xC601;&#xC5ED; &#xB0B4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC120;&#xD0DD;&#xD55C; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C; &#xAC04;&#xC758; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9;&#xC740; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; H + &#xD38C;&#xD551; H, in vivo &#xC870;&#xAC74; &#xD558;&#xC5D0;&#xC11C; K Atpase&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD2B9;&#xC815; &#xC911;&#xC694; E2 &#xC548;&#xC815;&#xD654; &#xD6A8;&#xACFC; &#xBC1C;&#xD718; &#xD55C;&#xB2E4;.

Na, K-&#xC640; H, K Atpase&#xC758; &#xD2B9;&#xC815; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704; &#xC54C;&#xD30C;/&#xBCA0;&#xD0C0; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; e 2 &#xC0C1;&#xD0DC; &#xC548;&#xC815;&#xD654;&#xC758; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC801; &#xC911;&#xC694;&#xC131;.

Las subunidades beta de Na, K-ATPasa y H, K-ATPasa tienen funciones importantes en la maduraci&#xF3;n y la membrana plasm&#xE1;tica de la focalizaci&#xF3;n catal&#xED;tico de la subunidad alfa, sino tambi&#xE9;n modular la actividad de transporte de los holoenzimas. En este estudio, mostramos que el reemplazo de tript&#xF3;fano de dos tirosinas altamente conservadas en el dominio de transmembrana de ambos Na, K-g&#xE1;strica y H, K-ATPasa subunidades beta-dio lugar a cambios importantes de las distribuciones E1P/E2P dependientes de voltaje hacia el E1P Estado seg&#xFA;n se infiere de presteady estatales medidas con la pinza de corriente y tensi&#xF3;n fluorom&#xE9;tricos de ATPasas tetrametilrodamina-6-maleimida-etiquetados. Los cambios en los equilibrios conformacionales fueron acompa&#xF1;ados por disminuciones significativas en las afinidades aparentes de K + extracelular que eran moderados para el Na, K-ATPasa beta-(Y39W, Y43W) mutaci&#xF3;n, pero mucho m&#xE1;s pronunciado para el correspondiente H, K-ATPasa beta-( Y44W, Y48W) variante. Adem&#xE1;s, en el Na, K-ATPasa beta-(Y39W, Y43W) mutante, la tasa aparente constante de uni&#xF3;n inversa de Na + extracelular y la posterior conversi&#xF3;n E2P-E1P, como se determina a partir de transitorios cin&#xE9;tica actuales, se aceler&#xF3; significativamente, lo que resulta en una mayor Na + la competencia de K + extracelular limitativas especialmente a potenciales muy negativos. An&#xE1;logamente el enlace inverso de protones extracelulares y posterior conversi&#xF3;n E2P-E1P se aceler&#xF3; con la H, K-ATPasa beta-mutaci&#xF3;n (Y44W, Y48W), y la secreci&#xF3;n de H + fue afectada fuertemente. Sorprendentemente reemplazos tript&#xF3;fano de residuos en el segmento de M7 de Na, K y H, K-ATPasa subunidades alfa, que son a interactuar distancia a la beta-tirosinas, dio lugar a cambios similares E1, indicando su participaci&#xF3;n en la estabilizaci&#xF3;n de E2. Por lo tanto, las interacciones entre los residuos seleccionados dentro de las regiones transmembrana de alfa y beta subunidades de P2C tipo ATPasas ejercer un efecto estabilizador E2, que es de importancia especial para un eficaz H + bombeo por H, K-ATPasa en condiciones in vivo.

Importancia funcional de Estabilizaci&#xF3;n de Estado E2 espec&#xED;ficos alfa / beta-subunidad Interacciones de Na, K y H, K-ATPasa

&#xC774; &#xB17C;&#xBB38; &#xC694;&#xC57D; &#xC870;&#xC0AC; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xC5ED;&#xD559;&#xACFC; Na (+)&#xC758; &#xAD6C;&#xC870; &#xBC30;&#xCE58; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xCD5C;&#xADFC; &#xC791;&#xD488; /K (+)-ATPase &#xC804;&#xC555; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504; fluorometry&#xB85C; &#xCD5C;&#xADFC; &#xC0DD;&#xD654;&#xD559;, &#xC0DD;&#xBB3C; &#xB9AC;, &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xACB0;&#xACFC; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB2E4;&#xB978; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC2E4;&#xC5D0;&#xC11C;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; fluorophore &#xD615;&#xAD11; &#xAC15;&#xB3C4;&#xC5D0; &#xBCC0;&#xD654;&#xB97C; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xD558; &#xC5EC; &#xC774;&#xC628; &#xD38C;&#xD504;&#xC758; &#xBD80;&#xBD84; &#xBC18;&#xC751; &#xC870;&#xC0AC; electrophysiological &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC640; &#xC54C;&#xD30C;, &#xBCA0;&#xD0C0; &#xBC0F; &#xAC10;&#xB9C8; &#xB610;&#xB294; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xC5D0; &#xB77C;&#xBCA8;&#xC744; &#xACB0;&#xD569;&#xC5D0; &#xCD08;&#xC810;&#xC744; &#xB9DE;&#xCDB0; &#xC654;&#xB2E4; &#xC804;&#xC555; &#xD384;&#xC2A4; &#xB610;&#xB294; &#xC194;&#xB8E8;&#xC158; exchange &#xB2E4;&#xC74C;. &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC;&#xB85C; &#xC6B0;&#xB9AC; tetramethylrhodamine-6-maleimide&#xC640; &#xB2E4;&#xC74C; &#xB77C;&#xBCA8;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xAE30;&#xC790; &#xADF8;&#xB8F9;&#xC73C;&#xB85C;&#xB294; holoenzyme &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xB97C; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xD558;&#xB824;&#xBA74; &#xBCA0;&#xD0C0; &#xC18C; &#xB2E8;&#xC704;&#xC5D0; &#xC794;&#xB958;&#xBB3C;&#xC744; &#xD655;&#xC778;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC54C;&#xD30C;, &#xBCA0;&#xD0C0; &#xBC0F; &#xAC10;&#xB9C8; subunits &#xC0AC;&#xC774; &#xAC70;&#xB9AC; &#xC81C;&#xC57D;&#xC758; &#xC724;&#xACFD;&#xC744; &#xADF8;&#xB9AC; &#xB2E4; &#xC774;&#xC628; &#xC804;&#xC1A1; &#xD558;&#xB294; &#xB3D9;&#xC548; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC758; &#xC0C1;&#xB300;&#xC801; &#xC6C0;&#xC9C1;&#xC784;&#xC744; &#xAC80;&#xC0AC;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB2E4;. &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC774; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xC0C1;&#xB2F9;&#xD55C; &#xBC1C;&#xC804; Na (+)&#xC758; &#xBD84;&#xC790; &#xBA54;&#xCEE4;&#xB2C8;&#xC998;&#xC744; &#xC774;&#xD574; &#xD588;&#xB2E4; &#xB418;&#xC5C8;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; /K (+)-ATPase. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xB294; &#xB2E4;&#xB978; &#xADF8;&#xB8F9;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC;&#xC640; &#xBE44;&#xAD50; &#xD558; &#xACE0; &#xBBF8;&#xB798;&#xC758; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xBC29;&#xD5A5; &#xC81C;&#xC2DC;.

&#xC804;&#xC555; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504; fluorometry: &#xD615;&#xAD11; &#xBC0F; Na (+)&#xC758; &#xAD6C;&#xC870; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xAC80;&#xC0AC; &#xD558;&#xB294; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC;&#xB97C; electrophysiological &#xACB0;&#xD569; /K (+)-ATPase.

&#x672C;&#x767D;&#x76AE;&#x4E66;&#x603B;&#x7ED3;&#x4E86;&#x6211;&#x4EEC;&#x6700;&#x8FD1;&#x7684;&#x5DE5;&#x4F5C;&#xFF0C;&#x8C03;&#x67E5;&#x7684;&#x6784;&#x8C61;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x548C;&#x7ED3;&#x6784;&#x5B89;&#x6392;&#x7684; (+) Na /K (+)-ATPase &#x4ECE;&#x5176;&#x4ED6;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#x4F7F;&#x7528;&#x7535;&#x538B;&#x94B3;&#x8367;&#x5149;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x6700;&#x65B0;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x5316;&#x5B66;&#x3001; &#x751F;&#x7269;&#x7269;&#x7406;&#x548C;&#x7ED3;&#x6784;&#x7ED3;&#x679C;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x91CD;&#x70B9;&#x7ED3;&#x5408;&#x7535;&#x751F;&#x7406;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x8C03;&#x67E5;&#x90E8;&#x5206;&#x53CD;&#x5E94;&#x7684;&#x79BB;&#x5B50;&#x6CF5;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x5F3A;&#x5EA6;&#x53D8;&#x5316;&#x76D1;&#x6D4B;&#x4E0E; &alpha;&#x3001; &beta; &#x548C;/&#x6216; &gamma; &#x4E9A;&#x57FA;&#x7AD9;&#x70B9;&#x7279;&#x5B9A;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x6807;&#x8BB0;&#x540E;&#x7535;&#x538B;&#x8109;&#x51B2;&#x548C; &#xFF08;&#x6216;&#xFF09; &#x4EA4;&#x6362;&#x89E3;&#x51B3;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x7531;&#x4E8E;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5DF2;&#x7ECF;&#x80FD;&#x591F;&#x786E;&#x5B9A;&#x4E00;&#x4E2A; &beta; &#x4E9A;&#x57FA;&#xFF0C;tetramethylrhodamine-6-&#x9A6C;&#x6765;&#x9170;&#x4E9A;&#x80FA;&#x7684;&#x4EE5;&#x4E0B;&#x6807;&#x8BB0;&#x53EF;&#x7528;&#x4E8E;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4E00;&#x4E2A;&#x8BB0;&#x8005;&#x7EC4;&#x76D1;&#x6D4B;&#x7684;&#x5168;&#x9176;&#x8FD8;&#x80FD;&#x6784;&#x8C61;&#x72B6;&#x6001;&#x4E0A;&#x7684;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x4E00;&#x76F4;&#x80FD;&#x591F;&#x5212;&#x5B9A; &alpha;&#x3001; &beta; &#x548C; &gamma; &#x4E9A;&#x57FA;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x8DDD;&#x79BB;&#x9650;&#x5236;&#xFF0C;&#x79BB;&#x5B50;&#x8FD0;&#x8F93;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x4E2D;&#x68C0;&#x67E5;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684;&#x76F8;&#x5BF9;&#x8FD0;&#x52A8;&#x3002;&#x540C;&#x65F6;&#x8FD9;&#x9879;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x5BF9;&#x91CD;&#x5927;&#x8FDB;&#x5C55;&#x5DF2;&#x5728;&#x7406;&#x89E3; Na (+) &#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x673A;&#x5236; /K (+)-ATPase&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x5C06;&#x4E0E;&#x6765;&#x81EA;&#x5176;&#x4ED6;&#x7EC4;&#x7684;&#x7ED3;&#x679C;&#x8FDB;&#x884C;&#x6BD4;&#x8F83;&#xFF0C;&#x5E76;&#x4F1A;&#x5EFA;&#x8BAE;&#x672A;&#x6765;&#x7684;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x65B9;&#x5411;&#x3002;

&#x7535;&#x538B;&#x94B3;&#x8367;&#x5149;&#xFF1A; &#x8367;&#x5149;&#x7ED3;&#x5408;&#x7535;&#x751F;&#x7406;&#x65B9;&#x6CD5;&#x68C0;&#x67E5;&#x7ED3;&#x6784;&#x4E0E;&#x529F;&#x80FD;&#x7684; (+) Na /K (+)-ATPase&#x3002;

This paper summarizes our recent work investigating the conformational dynamics and structural arrangement of the Na(+)/K(+)-ATPase using voltage clamp fluorometry as well as the latest biochemical, biophysical and structural results from other laboratories. Our research has been focused on combining site-specific fluorophore labeling on the alpha, beta and/or gamma subunit with electrophysiological studies to investigate partial reactions of the ion pump by monitoring changes in fluorescence intensity following voltage pulses and/or solution exchange. As a consequence of these studies, we have been able to identify a residue on the beta subunit, which following labeling with tetramethylrhodamine-6-maleimide can be used as a reporter group to monitor the conformational state of the holoenzyme. Furthermore, we have been able to delineate distance constraints between the alpha, beta and gamma subunits and to examine the relative movements of these proteins during ion transport. Concurrent to this research, significant advancements have been made in understanding the molecular mechanism of the Na(+)/K(+)-ATPase. Thus, our research will be compared with the results from other groups and future experimental directions will be proposed.

Voltage clamp fluorometry: combining fluorescence and electrophysiological methods to examine the structure-function of the Na(+)/K(+)-ATPase.

Le pr&#xE9;sent document r&#xE9;sume les travaux r&#xE9;cents de l&#x26;#39;enqu&#xEA;te la dynamique conformationnelle et agencement structurel de la Na (+) / K (+)-ATPase en utilisant fluorom&#xE9;trie pince de tension ainsi que les derniers r&#xE9;sultats biochimiques, biophysiques et structurelles d&#x26;#39;autres laboratoires. Notre recherche a port&#xE9; sur la combinaison de l&#x26;#39;&#xE9;tiquetage fluorophore site sp&#xE9;cifique sur l&#x26;#39;alpha, b&#xEA;ta et / ou gamma sous-unit&#xE9; des &#xE9;tudes &#xE9;lectrophysiologiques pour &#xE9;tudier des r&#xE9;actions partielles de la pompe &#xE0; ions en surveillant les changements dans l&#x26;#39;intensit&#xE9; de fluorescence apr&#xE8;s des impulsions de tension et / ou d&#x26;#39;&#xE9;change solution. En cons&#xE9;quence de ces &#xE9;tudes, nous avons &#xE9;t&#xE9; en mesure d&#x26;#39;identifier un r&#xE9;sidu sur la sous-unit&#xE9; b&#xEA;ta, ce qui l&#x26;#39;&#xE9;tiquetage suivant avec t&#xE9;tram&#xE9;thylrhodamine-6-mal&#xE9;imide peut &#xEA;tre utilis&#xE9; comme un groupe rapporteur pour surveiller l&#x26;#39;&#xE9;tat de conformation de l&#x26;#39;holoenzyme. En outre, nous avons &#xE9;t&#xE9; en mesure de d&#xE9;limiter les contraintes de distance entre les sous-unit&#xE9;s alpha, b&#xEA;ta et gamma et d&#x26;#39;examiner les mouvements relatifs de ces prot&#xE9;ines au cours du transport d&#x26;#39;ions. Parall&#xE8;lement &#xE0; cette recherche, des progr&#xE8;s significatifs ont &#xE9;t&#xE9; accomplis dans la compr&#xE9;hension du m&#xE9;canisme mol&#xE9;culaire de la Na (+) / K (+)-ATPase. Ainsi, nos recherches seront compar&#xE9;s avec les r&#xE9;sultats des autres groupes et les futures orientations exp&#xE9;rimentales seront propos&#xE9;es.

Fluorom&#xE9;trie Clamp Tension: la combinaison de m&#xE9;thodes de fluorescence et d&#x26;#39;&#xE9;lectrophysiologie pour &#xE9;tudier la structure-fonction de la Na (+) / K (+)-ATPase

Diese Ver&ouml;ffentlichung fasst unsere j&uuml;ngsten Arbeit untersucht die Konformations&auml;nderungen Dynamik und strukturelle Anordnung der Na (+) / k (+)-ATPase mit Spannung Klemme Fluorometrie sowie die neuesten strukturellen, biochemischen und biophysikalischen Ergebnisse aus anderen Labors. Unsere Forschung konzentriert sich darauf, standortspezifische Fluorophor Beschriftung auf die Alpha, Beta oder Gamma-Untereinheit mit elektrophysiologische Untersuchungen zur teilweise Reaktionen der Ion-Pumpe durch die &Uuml;berwachung von &Auml;nderungen in der Intensit&auml;t der Fluoreszenz nach Spannungsimpulse und/oder L&ouml;sung Exchange. Als Folge dieser Studien konnten wir einen R&uuml;ckstand in der Beta-Untereinheit, zu identifizieren, welche folgende Kennzeichnung mit Tetramethylrhodamine-6-Maleimide als Reporter Gruppe zum &Uuml;berwachen des Zustands Konformations&auml;nderungen der Erfahrung verwendet werden kann. Dar&uuml;ber hinaus konnten Entfernungsbeschr&auml;nkungen zwischen die Alpha-, Beta- und Gamma-Untereinheiten abzugrenzen und die relativen Bewegungen dieser Proteine w&auml;hrend der Ionentransport pr&uuml;fen wir. Gleichzeitig zu dieser Forschung wurden bedeutende Verbesserungen in Verst&auml;ndnis der molekularen Mechanismen der Na (+) / k (+)-ATPase. So unsere Forschung werden verglichen mit den Ergebnissen aus anderen Gruppen und experimentelle Zukunftsperspektiven vorgeschlagen werden.

Spannung Klemme Fluorometrie: Kombination von Fluoreszenz und elektrophysiologischen Methoden zur Pr&uuml;fung der Struktur-Funktion der Na (+) / k (+)-ATPase.

Questo documento riassume il nostro recente lavoro indaga le dinamiche conformazionali e arrangiamento strutturale del Na (+) / k (+)-ATPasi utilizzando la fluorometria morsetto di tensione, nonch&eacute; i pi&ugrave; recenti risultati biochimici, biofisici e strutturali da altri laboratori. La nostra ricerca &egrave; stata focalizzata su combinando fluoroforo site-specific di etichettatura sulla subunit&agrave; alfa, beta o gamma con studi elettrofisiologici di indagare le reazioni parziali della pompa dello ione monitorando i cambiamenti nell&#39;intensit&agrave; di fluorescenza seguendo impulsi di tensione e/o cambio di soluzione. Come conseguenza di questi studi, siamo stati in grado di identificare un residuo sulla subunit&agrave; beta, che seguente etichettatura con tetrametilrodamina-6-con pu&ograve; essere utilizzato come un gruppo di reporter per monitorare lo stato conformazionale dell&#39;esonucleasica. Inoltre, siamo stati in grado di delineare i vincoli di distanza tra la subunit&agrave; alfa, beta e gamma e per esaminare i movimenti relativi di queste proteine durante il trasporto di ioni. Simultanee a questa ricerca, sono stati fatti progressi significativi nella comprensione del meccanismo molecolare del Na (+) / k (+)-ATPasi. Cos&igrave;, la nostra ricerca sar&agrave; confrontata con i risultati di altri gruppi e future direzioni sperimentali saranno proposte.

La fluorometria morsetto tensione: combinando metodi elettrofisiologici per esaminare la struttura-funzione del Na (+) e fluorescenza/k (+)-ATPasi.

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Este documento resume el trabajo reciente de la investigaci&#xF3;n de la din&#xE1;mica de conformaci&#xF3;n y la disposici&#xF3;n estructural de la Na (+) / K (+)-ATPasa con fluorometr&#xED;a fijaci&#xF3;n de voltaje, as&#xED; como los &#xFA;ltimos resultados bioqu&#xED;micos, biof&#xED;sicos y estructurales de otros laboratorios. Nuestra investigaci&#xF3;n se ha centrado en la combinaci&#xF3;n espec&#xED;fica del sitio de etiquetado fluor&#xF3;foro en el alfa, beta y / o gamma subunidad con estudios electrofisiol&#xF3;gicos para investigar las reacciones parciales de la bomba de iones mediante el control de cambios en la intensidad de la fluorescencia despu&#xE9;s de pulsos de voltaje y / o canje soluci&#xF3;n. Como consecuencia de estos estudios, hemos sido capaces de identificar un residuo en la subunidad beta, que etiquetado siguiente con tetrametilrodamina-6-maleimida se puede utilizar como un grupo informador para supervisar el estado conformacional de la holoenzima. Adem&#xE1;s, hemos sido capaces de delinear restricciones de distancia entre las subunidades alfa, beta y gamma y para examinar los movimientos relativos de estas prote&#xED;nas durante el transporte de iones. Paralelamente a esta investigaci&#xF3;n, los avances se han realizado importantes en la comprensi&#xF3;n del mecanismo molecular de la Na (+) / K (+)-ATPasa. Por lo tanto, nuestra investigaci&#xF3;n se compararon con los resultados de otros grupos y futuras direcciones experimentales propuestos se.

Fluorometr&#xED;a fijaci&#xF3;n de tensi&#xF3;n: La combinaci&#xF3;n de los m&#xE9;todos de fluorescencia y electrofisiol&#xF3;gicos para examinar la estructura-funci&#xF3;n de la Na (+) / K (+)-ATPasa

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Voltage clamp fluorometry was used to monitor conformational changes associated with electrogenic partial reactions of the Na(+),K(+)-ATPase after changes in the concentration of internal sodium (Na(+)(i)) or external potassium (K(+)(o)). To probe the effects of the Na(+)(i) concentration on the Na(+) branch of the Na(+),K(+)-ATPase, oocytes were depleted of Na(+)(i) and then loaded with external sodium (Na(+)(o)) using the amiloride-sensitive epithelial sodium channel. The K(+) branch of the Na(+),K(+)-ATPase was studied by exposing the oocytes to different K(+)(o) concentrations in the presence and absence of Na(+)(o) to obtain additional information on the apparent affinity for K(+)(o). Our results demonstrate that lowering the concentration of Na(+)(i) or increasing the amount of K(+)(o) in the external solution shifts the equilibrium toward E(1)/E(1)P. Furthermore, the K(+)(o)-induced relocation toward E(1) occurs at a much lower K(+)(o) concentration when Na(+)(o) is absent, indicating a higher apparent affinity. Finally, voltage-dependent steps associated with the K(+) branch or the Na(+) branch of the Na(+),K(+)-ATPase are affected by the K(+)(o) concentration or the Na(+)(i) concentration, respectively.

Ligand-dependent effects on the conformational equilibrium of the Na+,K+-ATPase as monitored by voltage clamp fluorometry.

Fluorom&#xE9;trie verrouillage de tension a &#xE9;t&#xE9; utilis&#xE9; pour surveiller des changements conformationnels associ&#xE9;s &#xE0; &#xE9;lectrog&#xE8;nes r&#xE9;actions partielles de la Na (+), K (+)-ATPase apr&#xE8;s des changements dans la concentration de sodium interne (Na (+) (i)) ou de potassium externe (K ( +) (o)). Pour sonder les effets de la concentration de Na (+) (i) sur le Na (+) branche de la Na (+), K (+)-ATPase, les ovocytes ont &#xE9;t&#xE9; appauvrie en Na (+) (i), puis charg&#xE9; de de sodium externe (Na (+) (o)) en utilisant le canal de l&#x26;#39;amiloride sensible &#xE0; sodium &#xE9;pith&#xE9;lial. Le K (+) branche du Na (+), K (+)-ATPase est &#xE9;tudi&#xE9;e en exposant les ovocytes &#xE0; diff&#xE9;rents K (+) (o) des concentrations en pr&#xE9;sence et en absence de Na (+) (o) pour obtenir des informations suppl&#xE9;mentaires sur l&#x26;#39;affinit&#xE9; apparente pour le K (+) (o). Nos r&#xE9;sultats d&#xE9;montrent que l&#x26;#39;abaissement de la concentration de Na (+) (i) ou en augmentant la quantit&#xE9; de K (+) (o) dans la solution externe d&#xE9;place l&#x26;#39;&#xE9;quilibre vers E (1) / E (1) P. En outre, le d&#xE9;placement K (+) (o)-induite vers E (1) se produit &#xE0; une beaucoup plus faible K (+) (o) la concentration en Na (+) (o) est absent, ce qui indique une plus forte affinit&#xE9; apparente. Enfin, d&#xE9;pendant de la tension associ&#xE9;e &#xE0; la &#xE9;tapes K (+) ou branche du Na (+) branche du Na (+), K (+)-ATPase sont affect&#xE9;s par l&#x26;#39;K (+) (o) la concentration de Na ou de la ( +) (i) la concentration, respectivement.

Ligand-d&#xE9;pendants Effets sur l&#x26;#39;&#xE9;quilibre conformationnel de la Na +, K +-ATPase Comme suivie par fluorom&#xE9;trie Clamp Tension

Spannung Klemme Fluorometrie wurde zur &Uuml;berwachung der Konformationsver&auml;nderungen zugeordnete elektrizit&auml;tserzeugende teilweise Reaktionen der Na (+), K (+)-ATPase nach &Auml;nderungen in der Konzentration des internen Natrium (Na(+)(i)) oder externe Kalium (K(+)(o)). Untersuchung der Auswirkungen der Na(+)(i) Konzentration auf dem Na(+) Zweig der Na (+), K (+)-ATPase, Eizellen waren Na(+)(i) ausgelaugt und dann geladen mit externen Natrium (Na(+)(o)) mit der Amilorids-Sensitive epitheliale Natriumkanal. Der K(+)-Zweig der Na (+), K (+)-ATPase wurde untersucht, indem man die Eizellen zu verschiedenen K(+)(o)-Konzentrationen in der Anwesenheit und Abwesenheit von Na(+)(o) zus&auml;tzliche Informationen &uuml;ber die scheinbare Affinit&auml;t f&uuml;r K(+)(o) zu erhalten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Senkung der Konzentration der Na(+)(i) oder die Aufstockung der K(+)(o) in die externe L&ouml;sung verschiebt sich das Gleichgewicht in Richtung E (1) / e (1) s. Dar&uuml;ber hinaus die K(+) (o)-induzierte Verlagerung in Richtung E(1) tritt bei einer viel niedrigeren Konzentration der K(+)(o), wenn Na(+)(o) fehlt, der angibt, einer h&ouml;heren scheinbaren Affinit&auml;t. Schlie&szlig;lich Spannung-abh&auml;ngigen Schritte der K(+)-Zweig oder den Na(+) Zweig der Na (+), K (+) zugeordnet-ATPase bzw. von der Konzentration der K(+)(o) oder der Na(+)(i)-Konzentration, betroffen sind.

Ligand-abh&auml;ngige Effekte auf das Konformations&auml;nderungen Gleichgewicht des Na +, K +-ATPase durch Spannung Klemme Fluorometrie &uuml;berwacht.

Tensione pinza la fluorometria &egrave; stata utilizzata per monitorare i cambiamenti conformazionali associati elettrogeniche reazioni parziali del Na (+), K (+)-ATPasi dopo le modifiche della concentrazione del sodio interna (Na(+)(i)) o potassio esterno (K(+)(o)). Per sondare gli effetti della concentrazione Na(+)(i) sul ramo Na(+) del Na (+), K (+)-ATPasi, ovociti erano esauriti di Na(+)(i) e poi caricati con sodio esterna (Na(+)(o)) utilizzando il canale del sodio epiteliali amiloride-sensibili. Il ramo K(+) del Na (+), K (+)-ATPasi &egrave; stata studiata esponendo gli ovociti a differenti concentrazioni di K(+)(o) in presenza e in assenza di Na(+)(o) per ottenere ulteriori informazioni sull&#39;apparente affinit&agrave; per K(+)(o). I nostri risultati dimostrano che abbassando la concentrazione di Na(+)(i) o aumentando la quantit&agrave; di K(+)(o) nella soluzione esterna sposta l&#39;equilibrio verso /E E (1) (1) pag. Inoltre, il K(+) (o)-indotta delocalizzazione verso volontarie si verifica in una concentrazione molto bassa di K(+)(o), quando Na(+)(o) &egrave; assente, che indica una maggiore affinit&agrave; apparente. Infine, passi di voltaggio-dipendenti associati con il ramo K(+) o il ramo di Na(+) del Na (+), K (+)-ATPasi sono influenzati dalla concentrazione di K(+)(o) o la concentrazione di Na(+)(i), rispettivamente.

Ligando-dipendente effetti sull&#39;equilibrio conformazionale del Na +, K +-ATPasi come monitorato dalla fluorometria morsetto di tensione.

&#x96FB;&#x5727;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x86CD;&#x5149;&#x306F;&#x3001;&#x5185;&#x90E8;&#x306E;&#x30CA;&#x30C8;&#x30EA;&#x30A6;&#x30E0;&#xFF08;Na&#xFF08;+&#xFF09;&#xFF08;I&#xFF09;&#xFF09;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x5916;&#x90E8;&#x306E;&#x30AB;&#x30EA;&#x30A6;&#x30E0;&#xFF08;K&#xFF08;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x306E;&#x5909;&#x5316;&#x306E;&#x5F8C;&#x306B;K&#xFF08;+&#xFF09;-ATP&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306F;&#x3001;Na&#xFF08;+&#xFF09;&#x306E;&#x8D77;&#x96FB;&#x90E8;&#x5206;&#x7684;&#x306A;&#x53CD;&#x5FDC;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x305F;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x5909;&#x5316;&#x3092;&#x76E3;&#x8996;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3057;&#x305F;+&#xFF09;&#xFF08;O&#xFF09;&#xFF09;&#x3002;&#x306E;Na&#xFF08;+&#xFF09;&#x306E;Na&#xFF08;+&#xFF09;&#x3001;K&#xFF08;+&#xFF09;-ATPase&#x306E;&#x30D6;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C1;&#x4E0A;&#x306E;Na&#xFF08;+&#xFF09;&#xFF08;i&#xFF09;&#x306E;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x306E;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x8ABF;&#x3079;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x5375;&#x6BCD;&#x7D30;&#x80DE;&#x306F;&#x3001;Na&#xFF08;+&#xFF09;&#xFF08;i&#xFF09;&#x306E;&#x67AF;&#x6E07;&#x3057;&#x305F;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C9;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30A2;&#x30DF;&#x30ED;&#x30EA;&#x30C9;&#x611F;&#x53D7;&#x6027;&#x4E0A;&#x76AE;&#x30CA;&#x30C8;&#x30EA;&#x30A6;&#x30E0;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x5916;&#x90E8;&#x30CA;&#x30C8;&#x30EA;&#x30A6;&#x30E0;&#xFF08;Na&#xFF08;+&#xFF09;&#xFF08;O&#xFF09;&#xFF09;&#x3002;&#x306E;Na&#xFF08;+&#xFF09;&#x306E;K&#xFF08;+&#xFF09;&#x30D6;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C1;&#x3001;K&#xFF08;+&#xFF09;-ATPase&#x3092;&#x53D6;&#x5F97;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x30CA;&#x30C8;&#x30EA;&#x30A6;&#x30E0;&#x306E;&#x5B58;&#x5728;&#x4E0B;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x975E;&#x5B58;&#x5728;&#x4E0B;&#xFF08;+&#xFF09;&#xFF08;O&#xFF09;&#x5185;&#x306E;&#x5225;&#x306E;K&#xFF08;+&#xFF09;&#xFF08;o&#xFF09;&#x306E;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x306B;&#x5375;&#x3092;&#x516C;&#x958B;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x691C;&#x8A0E;&#x3057;&#x305F;K&#xFF08;+&#xFF09;&#xFF08;O&#xFF09;&#x306E;&#x898B;&#x304B;&#x3051;&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x306B;&#x95A2;&#x3059;&#x308B;&#x8FFD;&#x52A0;&#x60C5;&#x5831;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;Na&#xFF08;+&#xFF09;&#xFF08;i&#xFF09;&#x306E;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x3092;&#x4E0B;&#x3052;&#x308B;&#x304B;&#x3001;&#x5916;&#x90E8;&#x6EB6;&#x6DB2;&#x4E2D;&#x306E;K&#xFF08;+&#xFF09;&#xFF08;O&#xFF09;&#x306E;&#x91CF;&#x3092;&#x5897;&#x3084;&#x3059;&#x3068;&#x3001;E&#xFF08;1&#xFF09;/ E&#xFF08;1&#xFF09;P.&#x306B;&#x5411;&#x304B;&#x3063;&#x3066;&#x5E73;&#x8861;&#x3092;&#x30B7;&#x30D5;&#x30C8;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;E&#xFF08;1&#xFF09;&#x306B;&#x5411;&#x304B;&#x3063;&#x3066;K&#xFF08;+&#xFF09;&#xFF08;O&#xFF09;&#x8A98;&#x767A;&#x79FB;&#x8EE2;&#x306F;&#x3001;&#x3088;&#x308A;&#x9AD8;&#x3044;&#x898B;&#x304B;&#x3051;&#x306E;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3059;&#x306E;Na&#xFF08;+&#xFF09;&#xFF08;O&#xFF09;&#x304C;&#x5B58;&#x5728;&#x3057;&#x306A;&#x3044;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x4F4E;&#x3044;K&#xFF08;+&#xFF09;&#xFF08;o&#xFF09;&#x306E;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x3067;&#x767A;&#x751F;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;&#x96FB;&#x5727;&#x4F9D;&#x5B58;&#x306E;&#x624B;&#x9806;&#x3067;&#x306F;&#x3001;K&#xFF08;+&#xFF09;&#x30D6;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C1;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x307E;&#x305F;&#x306F;Na&#xFF08;+&#xFF09;&#x306E;Na&#xFF08;+&#xFF09;&#x30D6;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C1;&#x3001;K&#xFF08;+&#xFF09;-ATP&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x306F;&#x3001;K&#xFF08;+&#xFF09;&#xFF08;o&#xFF09;&#x306E;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x3084;Na&#x306E;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53D7;&#x3051;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#xFF08; +&#xFF09;&#xFF08;i&#xFF09;&#x306E;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x305E;&#x308C;&#x3002;

&#x306E;Na +&#x3001;K +-ATPase&#x306E;&#x30B3;&#x30F3;&#x30D5;&#x30A9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x5E73;&#x8861;&#x306B;&#x30EA;&#x30AC;&#x30F3;&#x30C9;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x306B;&#x53CA;&#x307C;&#x3059;&#x5F71;&#x97FF;&#x3001;&#x96FB;&#x5727;&#x30AF;&#x30E9;&#x30F3;&#x30D7;&#x86CD;&#x5149;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x76E3;&#x8996;&#x3055;&#x308C;&#x308B;

&#xC804;&#xC555; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504; fluorometry Na (+), K (+)&#xC758; electrogenic &#xBD80;&#xBD84; &#xBC18;&#xC751;&#xACFC; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xBCC0;&#xD654;&#xB97C; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD55C;-ATPase (Na(+)(i)) &#xB610;&#xB294; &#xC678;&#xBD80; &#xCE7C;&#xB968; (K(+)(o)) &#xB0B4;&#xBD80; &#xB098;&#xD2B8;&#xB968;&#xC758; &#xB18D;&#xB3C4;&#xC758; &#xBCC0;&#xD654; &#xD6C4;. Na (+), K (+)&#xC758; Na(+) &#xC9C0;&#xC810;&#xC5D0; Na(+)(i) &#xB18D;&#xB3C4;&#xC758; &#xD6A8;&#xACFC; &#xC870;&#xC0AC; &#xD558;&#xAE30;-ATPase, oocytes na(+)(i)&#xC758; &#xACE0;&#xAC08; &#xB418; &#xACE0; &#xB2E4;&#xC74C; &#xC678;&#xBD80; &#xB098;&#xD2B8;&#xB968; (amiloride &#xBBFC;&#xAC10;&#xD55C; &#xC0C1;&#xD53C; &#xB098;&#xD2B8;&#xB968; &#xCC44;&#xB110;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; na(+)(o))&#xC640; &#xD568;&#xAED8; &#xB85C;&#xB4DC; &#xB41C;. Na (+), K (+)&#xC758; K(+) &#xBD84;&#xAE30;-ATPase &#xC874;&#xC7AC; &#xBC0F; k(+)(o)&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xBA85;&#xBC31;&#xD55C; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xB300; &#xD55C; &#xCD94;&#xAC00; &#xC815;&#xBCF4;&#xB97C; &#xC5BB;&#xC73C;&#xB824;&#xBA74; na(+)(o)&#xC758; &#xBD80;&#xC7AC;&#xC5D0; &#xB2E4;&#xB978; K(+)(o) &#xB18D;&#xB3C4;&#xC5D0; oocytes&#xB97C; &#xB178;&#xCD9C; &#xD558; &#xC5EC; &#xACF5;&#xBD80; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; na(+)(i)&#xC758; &#xB18D;&#xB3C4; &#xB0AE;&#xCD94;&#xAC70;&#xB098; &#xC678;&#xBD80; &#xC194;&#xB8E8;&#xC158;&#xC5D0;&#xC11C; k(+)(o)&#xC758; &#xC591;&#xC744; &#xC99D;&#xAC00; E (1) /E (1) &#xD53C; &#xCABD;&#xC73C;&#xB85C; &#xD3C9;&#xD615; &#xC774;&#xB3D9; &#xC785;&#xC99D; &#xB610;&#xD55C;, K(+) (o)-Na(+)(o) &#xC5C6;&#xC73C;&#xBA74;, &#xB192;&#xC740; &#xBA85;&#xBC31;&#xD55C; &#xC120;&#xD638;&#xB3C4; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0B4;&#xB294; E(1) &#xCABD;&#xC73C;&#xB85C; &#xC720;&#xB3C4; &#xB41C; &#xC7AC;&#xBC30;&#xCE58; &#xD6E8;&#xC52C; &#xB0AE;&#xC740; K(+)(o) &#xB18D;&#xB3C4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC1C;&#xC0DD; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB9C8;&#xC9C0;&#xB9C9;&#xC73C;&#xB85C;, &#xC804;&#xC555; &#xC758;&#xC874; &#xB2E8;&#xACC4; K(+) &#xBD84;&#xAE30; &#xB610;&#xB294; Na (+), K (+)&#xC758; Na(+) &#xBD84;&#xAE30; &#xC5F0;&#xAD00;-ATPase &#xAC01;&#xAC01; K(+)(o) &#xB18D;&#xB3C4; &#xB610;&#xB294; Na(+)(i) &#xB18D;&#xB3C4; &#xC758;&#xD574; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBC1B;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Ligand &#xC758;&#xC874; &#xD6A8;&#xACFC; Na +, K +&#xC758; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801; &#xD3C9;&#xD615;-ATPase &#xC804;&#xC555; &#xD074;&#xB7A8;&#xD504; fluorometry&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1;&#xC73C;&#xB85C;.

Fluorometr&#xED;a abrazadera de voltaje se utiliza para vigilar los cambios conformacionales asociados con electr&#xF3;genos reacciones parciales de la Na (+), K (+)-ATPasa despu&#xE9;s de los cambios en la concentraci&#xF3;n de sodio interna (Na (+) (i)) o potasio externo (K ( +) (o)). Para investigar los efectos de la concentraci&#xF3;n de Na (+) (i) en la Na (+) rama de la Na (+), K (+)-ATPasa, los oocitos se agota de Na (+) (i) y despu&#xE9;s se carga con s&#xF3;dico externa (Na (+) (o)) utilizando el canal sensible a amilorida epitelial de sodio. El K (+) rama de la Na (+), K (+)-ATPasa se estudi&#xF3; mediante la exposici&#xF3;n de los oocitos a diferente K (+) (o) las concentraciones en la presencia y ausencia de Na (+) (o) para obtener Informaci&#xF3;n adicional sobre la afinidad aparente de K (+) (o). Nuestros resultados demuestran que la reducci&#xF3;n de la concentraci&#xF3;n de Na (+) (i) o aumentando la cantidad de K (+) (o) en la soluci&#xF3;n externa desplaza el equilibrio hacia E (1) / E (1) P. Adem&#xE1;s, la reubicaci&#xF3;n de K (+) (O)-inducida hacia E (1) se produce a una mucho m&#xE1;s baja K (+) (o) cuando la concentraci&#xF3;n de Na (+) (o) est&#xE1; ausente, lo que indica una mayor afinidad aparente. Finalmente, dependientes de voltaje pasos asociados con la K (+) o la rama Na (+) rama de la Na (+), K (+)-ATPasa se ven afectados por la K (+) (o) o Na concentraci&#xF3;n del ( +) (i) la concentraci&#xF3;n, respectivamente.

Ligando-dependiente efectos sobre el equilibrio conformacional de la Na +, K +-ATPasa como la supervisi&#xF3;n de fluorometr&#xED;a fijaci&#xF3;n de voltaje

The light-gated cation channel channelrhodopsin-2 (ChR2) has rapidly become an important tool in neuroscience, and its use is being considered in therapeutic interventions. Although wild-type and known variant ChR2s are able to drive light-activated spike trains, their use in potential clinical applications is limited by either low light sensitivity or slow channel kinetics. We present a new variant, calcium translocating channelrhodopsin (CatCh), which mediates an accelerated response time and a voltage response that is ~70-fold more light sensitive than that of wild-type ChR2. CatCh's superior properties stem from its enhanced CaÂ²(+) permeability. An increase in [CaÂ²(+)](i) elevates the internal surface potential, facilitating activation of voltage-gated Na(+) channels and indirectly increasing light sensitivity. Repolarization following light-stimulation is markedly accelerated by CaÂ²(+)-dependent BK channel activation. Our results demonstrate a previously unknown principle: shifting permeability from monovalent to divalent cations to increase sensitivity without compromising fast kinetics of neuronal activation. This paves the way for clinical use of light-gated channels.

Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the CaÂ²+-permeable channelrhodopsin CatCh.

&#x5149;&#x95E8;&#x63A7;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x901A;&#x9053;&#x79BB;&#x5B50;-2 &#xFF08;ChR2&#xFF09; &#x5DF2;&#x8FC5;&#x901F;&#x6210;&#x4E3A;&#x5728;&#x795E;&#x7ECF;&#x79D1;&#x5B66;&#x4E2D;&#x7684;&#x91CD;&#x8981;&#x5DE5;&#x5177;&#x548C;&#x6CBB;&#x7597;&#x5E72;&#x9884;&#x63AA;&#x65BD;&#x76EE;&#x524D;&#x6B63;&#x5728;&#x8003;&#x8651;&#x5176;&#x4F7F;&#x7528;&#x3002;&#x867D;&#x7136;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x548C;&#x5DF2;&#x77E5;&#x53D8;&#x91CF; ChR2s &#x90FD;&#x80FD;&#x5230;&#x9A71;&#x52A8;&#x5668;&#x5149;&#x6D3B;&#x5316;&#x7A57;&#x5217;&#x8F66;&#xFF0C;&#x5176;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x4E34;&#x5E8A;&#x5E94;&#x7528;&#x5728;&#x4F7F;&#x7528;&#x4F4E;&#x611F;&#x5149;&#x5EA6;&#x6216;&#x6162;&#x901A;&#x9053;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x53D7;&#x5230;&#x7684;&#x9650;&#x5236;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x63D0;&#x51FA;&#x65B0;&#x7684;&#x6B3E;&#x5F0F;&#x3001; &#x9499;&#x8F6C;&#x8FD0;&#x79BB;&#x5B50; (CatCh)&#xFF0C;&#x5176;&#x4E2D;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x7684;&#x52A0;&#x901F;&#x7684;&#x53CD;&#x5E94;&#x65F6;&#x95F4;&#x548C;&#x7535;&#x538B;&#x7684;&#x54CD;&#x5E94;&#xFF0C;&#x662F; ~ 70-fold &#x66F4;&#x591A;&#x7684;&#x5149;&#x654F;&#x611F;&#x6BD4;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; ChR2.&#x6E14;&#x4F18;&#x8D8A;&#x5C5E;&#x6027;&#xFF0C;&#x6E90;&#x4E8E;&#x5176;&#x589E;&#x5F3A;&#x7684; Ca&sup2;(+) &#x6E17;&#x900F;&#x3002;&#x589E;&#x52A0; [Ca&sup2;(+)](i) &#x63D0;&#x5347;&#x5185;&#x90E8;&#x8868;&#x9762;&#x6F5C;&#x529B;&#xFF0C;&#x4FC3;&#x8FDB;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x7535;&#x538B;&#x95E8;&#x63A7; Na(+) &#x6E20;&#x9053;&#x548C;&#x95F4;&#x63A5;&#x589E;&#x52A0;&#x5149;&#x654F;&#x611F;&#x5EA6;&#x3002;&#x5149;&#x523A;&#x6FC0;&#x540E;&#x7684;&#x590D;&#x6781;&#x663E;&#x8457;&#x7684;&#x52A0;&#x901F;&#x4E0B; Ca&sup2; (+)-&#x4F9D;&#x5B58; BK &#x901A;&#x9053;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x7814;&#x7A76;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x4E00;&#x79CD;&#x4EE5;&#x524D;&#x672A;&#x77E5;&#x7684;&#x539F;&#x5219;&#xFF1A; &#x4ECE;&#x5355;&#x4EF7;&#x7684;&#x901A;&#x900F;&#x6027;&#x8F6C;&#x5411;&#x4E8C;&#x4EF7;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x53EF;&#x63D0;&#x9AD8;&#x7075;&#x654F;&#x5EA6;&#xFF0C;&#x540C;&#x65F6;&#x53C8;&#x4E0D;&#x635F;&#x5BB3;&#x795E;&#x7ECF;&#x5143;&#x6FC0;&#x6D3B;&#x5FEB;&#x901F;&#x53CD;&#x5E94;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x3002;&#x8FD9;&#x4E3A;&#x4E34;&#x5E8A;&#x4F7F;&#x7528;&#x5149;&#x5C01;&#x95ED;&#x6E20;&#x9053;&#x94FA;&#x5E73;&#x4E86;&#x9053;&#x8DEF;&#x3002;

&#x7528; Ca&sup2; + &#x8D85;&#x5149;&#x654F;&#x611F;&#x548C;&#x5FEB;&#x901F;&#x795E;&#x7ECF;&#x5143;&#x6FC0;&#x6D3B;-&#x900F;&#x6C34;&#x79BB;&#x5B50;&#x6355;&#x83B7;&#x3002;

Le canal cationique lumi&#xE8;re gated channelrhodopsin-2 (CHR2) est rapidement devenu un outil important en neurosciences, et son utilisation est envisag&#xE9;e dans les interventions th&#xE9;rapeutiques. Bien que ChR2s variantes de type sauvage et connus sont en mesure de conduire activ&#xE9;s par la lumi&#xE8;re trains de potentiels, leur utilisation dans des applications cliniques potentielles est limit&#xE9;e soit par sensibilit&#xE9; &#xE0; la lumi&#xE8;re est faible ou la cin&#xE9;tique des canaux lents. Nous pr&#xE9;sentons une nouvelle variante, le calcium translocation channelrhodopsin (Catch), qui assure la m&#xE9;diation un temps de r&#xE9;ponse acc&#xE9;l&#xE9;r&#xE9; et une r&#xE9;ponse de tension qui est ~ 70 fois plus sensible &#xE0; la lumi&#xE8;re que celle de type sauvage CHR2. Des propri&#xE9;t&#xE9;s sup&#xE9;rieures de capture d&#xE9;coulent de son am&#xE9;lior&#xE9;e Ca &#xB2; (+) la perm&#xE9;abilit&#xE9;. Une augmentation de [Ca &#xB2; (+)] (i) &#xE9;l&#xE8;ve le potentiel de surface interne, facilitant l&#x26;#39;activation du voltage-d&#xE9;pendant Na (+) et les canaux sensibilit&#xE9; &#xE0; la lumi&#xE8;re indirecte &#xE0; la hausse. Repolarisation suivant lumi&#xE8;re de stimulation est sensiblement acc&#xE9;l&#xE9;r&#xE9;e par Ca &#xB2; (+)-d&#xE9;pendante d&#x26;#39;activation de canal BK. Nos r&#xE9;sultats d&#xE9;montrent un principe jusque-l&#xE0; inconnue: le d&#xE9;calage de perm&#xE9;abilit&#xE9; &#xE0; partir monovalent aux cations divalents pour augmenter la sensibilit&#xE9; sans pour autant compromettre cin&#xE9;tique rapide de l&#x26;#39;activation neuronale. Cela ouvre la voie pour une utilisation clinique de la lumi&#xE8;re-d&#xE9;pendants canaux.

Ultra sensible &#xE0; la lumi&#xE8;re d&#x26;#39;activation et rapide neuronale avec le Ca &#xB2; +-perm&#xE9;able channelrhodopsin Catch

Die Licht-Gating kation Kanal Channelrhodopsin-2 (ChR2) ist ein wichtiges Instrument in der Neurowissenschaft schnell geworden, und seine Verwendung wird in therapeutischen Interventionen gepr&uuml;ft. Obwohl Wildtyp und bekannte Variante ChR2s sind in der Lage, mit dem Licht aktivierte Spitze Z&uuml;ge, ist ihre Verwendung in der klinischen Einsatzm&ouml;glichkeiten durch geringe Lichtempfindlichkeit oder langsame Kanal Kinetik begrenzt. Wir pr&auml;sentieren eine neue Variante, Kalzium, translocating Channelrhodopsin (CatCh), die vermittelt eine beschleunigte Reaktionszeit und eine Spannung Antwort ~ 70-fold Licht empfindlicher als der Wildtyp ChR2. CatCh &uuml;berlegenen Eigenschaften ergeben sich aus seiner erweiterten Ca&sup2;(+)-Durchl&auml;ssigkeit. Eine Zunahme [Ca&sup2;(+)](i) erhebt das interne Oberfl&auml;che Potential, Erleichterung der Aktivierung der Spannung-Gating Na(+) Kan&auml;le und indirekt zunehmender Lichtempfindlichkeit. Repolarisation nach Licht-Stimulierung ist deutlich beschleunigt durch Ca&sup2; (+)-abh&auml;ngige Aktivierung von BK-Kanal. Unsere Ergebnisse zeigen eine bisher unbekannte Prinzip: Durchl&auml;ssigkeit von monovalenten auf bivalente kationen um Empfindlichkeit zu erh&ouml;hen, ohne dabei schnelle Kinetik der neuronalen Aktivierung verlagert. Dies ebnet den Weg f&uuml;r den klinischen Einsatz von Licht-Gating-Kan&auml;le.

Extrem lichtempfindliche und schnelle neuronale Aktivierung mit Ca&sup2; +-durchl&auml;ssigen Channelrhodopsin CatCh.

La luce-gated cazione canale channelrhodopsin-2 (ChR2) &egrave; rapidamente diventato un importante strumento in neuroscienze, e il suo utilizzo &egrave; stato considerato in interventi terapeutici. Anche se la variante wild-type e noto ChR2s sono in grado di auto-attivati spike treni, loro uso in applicazioni cliniche potenziali &egrave; limitata dalla bassa sensibilit&agrave; alla luce o canale lenta cinetica. Vi presentiamo un nuovo variante, calcio translocating channelrhodopsin (fermo), che media un tempo di risposta accelerato e una risposta di tensione che &egrave; ~ 70-fold pi&ugrave; luce sensibile quanto quello della propriet&agrave; superiori di selvaggio-tipo ChR2. CatCh derivano dalla sua maggiore permeabilit&agrave; Ca&sup2;(+). Un aumento in [Ca&sup2;(+)](i) eleva il potenziale di superficie interno, facilitando l&#39;attivazione dei canali Na(+) tensione-gated e indirettamente aumentare la sensibilit&agrave; alla luce. Ripolarizzazione seguito luce-stimolazione &egrave; marcatamente accelerata dal Ca&sup2; (+)-dipendente attivazione canale di BK. I nostri risultati dimostrano un principio precedentemente sconosciuto: spostando permeabilit&agrave; da monovalente cationi divalenti per aumentare la sensibilit&agrave; senza compromettere la rapida cinetica di attivazione neuronale. Questo spiana la strada per l&#39;uso clinico della luce-gated canali.

Ultra sensibili alla luce e veloce neuronale l&#39;attivazione con il Ca&sup2; +-permeabile channelrhodopsin CatCh.

&#x5149;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30AB;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;channelrhodopsin-2&#xFF08;ChR2&#xFF09;&#x306F;&#x3001;&#x6025;&#x901F;&#x306B;&#x795E;&#x7D4C;&#x79D1;&#x5B66;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3068;&#x306A;&#x3063;&#x3066;&#x304A;&#x308A;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x306F;&#x6CBB;&#x7642;&#x7684;&#x4ECB;&#x5165;&#x3067;&#x8003;&#x616E;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x65E2;&#x77E5;&#x306E;&#x5909;&#x7570;ChR2s&#x306F;&#x3001;&#x5149;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x30B9;&#x30D1;&#x30A4;&#x30AF;&#x5217;&#x3092;&#x99C6;&#x52D5;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x6F5C;&#x5728;&#x7684;&#x306A;&#x81E8;&#x5E8A;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3067;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x306F;&#x3001;&#x4F4E;&#x7167;&#x5EA6;&#x611F;&#x5EA6;&#x3084;&#x4F4E;&#x901F;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x52D5;&#x614B;&#x306E;&#x3044;&#x305A;&#x308C;&#x304B;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5236;&#x9650;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;&#x52A0;&#x901F;&#x30EC;&#x30B9;&#x30DD;&#x30F3;&#x30B9;&#x30BF;&#x30A4;&#x30E0;&#x3068;&#x91CE;&#x751F;&#x578B;ChR2&#x306E;&#x305D;&#x308C;&#x3088;&#x308A;&#x3082;&#x654F;&#x611F;&#x301C;70&#x500D;&#x4EE5;&#x4E0A;&#x306E;&#x5149;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x96FB;&#x5727;&#x5FDC;&#x7B54;&#x3092;&#x4EF2;&#x4ECB;&#x3059;&#x308B;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x4E9C;&#x7A2E;&#x3001;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0;&#x8EE2;&#x4F4D;channelrhodopsin&#x3092;&#xFF08;&#x30AD;&#x30E3;&#x30C3;&#x30C1;&#xFF09;&#x304C;&#x5B58;&#x5728;&#x3059;&#x308B;&#x3002;&#x30AD;&#x30E3;&#x30C3;&#x30C1;&#x306E;&#x512A;&#x308C;&#x305F;&#x7279;&#x6027;&#x306F;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x5F37;&#x5316;&#x306E;Ca&#xB2;&#xFF08;+&#xFF09;&#x900F;&#x904E;&#x6027;&#x306B;&#x7531;&#x6765;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3002; &#x3014;Ca&#xB2;&#xFF08;+&#xFF09;]&#xFF08;I&#xFF09;&#x306E;&#x5897;&#x52A0;&#x306F;&#x3001;&#x96FB;&#x4F4D;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;Na&#xFF08;+&#xFF09;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x3068;&#x9593;&#x63A5;&#x7684;&#x306B;&#x5897;&#x52A0;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x5149;&#x611F;&#x53D7;&#x6027;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x3092;&#x4FC3;&#x9032;&#x3057;&#x3001;&#x5185;&#x90E8;&#x306E;&#x8868;&#x9762;&#x96FB;&#x4F4D;&#x3092;&#x9AD8;&#x3081;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5149;&#x523A;&#x6FC0;&#x5F8C;&#x306E;&#x518D;&#x5206;&#x6975;&#x304C;&#x8457;&#x3057;&#x304F;&#x30AB;&#x30EB;&#x30B7;&#x30A6;&#x30E0;&#xB2;&#xFF08;+&#xFF09;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;BK&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x52A0;&#x901F;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30CB;&#x30E5;&#x30FC;&#x30ED;&#x30F3;&#x306E;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;&#x306E;&#x901F;&#x3044;&#x901F;&#x5EA6;&#x3092;&#x640D;&#x306A;&#x3046;&#x3053;&#x3068;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x611F;&#x5EA6;&#x3092;&#x4E0A;&#x3052;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4E8C;&#x4FA1;&#x306E;&#x967D;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x306B;&#x4E00;&#x4FA1;&#x306E;&#x900F;&#x904E;&#x6027;&#x3092;&#x30B7;&#x30D5;&#x30C8;&#x3059;&#x308B;&#xFF1A;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x672A;&#x77E5;&#x306E;&#x539F;&#x7406;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x306F;&#x5149;&#x4F9D;&#x5B58;&#x6027;&#x30C1;&#x30E3;&#x30CD;&#x30EB;&#x306E;&#x81E8;&#x5E8A;&#x4F7F;&#x7528;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x9053;&#x3092;&#x958B;&#x304F;&#x3002;

&#x306E;Ca&#xB2;+&#x900F;&#x904E;&#x6027;Channelrhodopsin&#x30AD;&#x30E3;&#x30C3;&#x30C1;&#x3057;&#x305F;&#x30A6;&#x30EB;&#x30C8;&#x30E9;&#x30E9;&#x30A4;&#x30C8;&#x3068;&#x5C0F;&#x6587;&#x5B57;&#x3092;&#x533A;&#x5225;&#x3057;&#x3001;&#x9AD8;&#x901F;&#x795E;&#x7D4C;&#x7D30;&#x80DE;&#x6D3B;&#x6027;&#x5316;

&#xBE5B; &#xBB38;&#xC774; &#xC591;&#xC774;&#xC628; &#xCC44;&#xB110; channelrhodopsin-2 (ChR2) &#xC2E0;&#xACBD; &#xACFC;&#xD559;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xAC00; &#xB418;&#xACE0;&#xC788;&#xB2E4; &#xBE60;&#xB974;&#xAC8C; &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xCE58;&#xB8CC; &#xC801; &#xC911;&#xC7AC;&#xC5D0;&#xC758; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC744; &#xACE0;&#xB824; &#xB418; &#xACE0; &#xC788;&#xB2E4;. &#xC57C;&#xC0DD;-&#xD0C0;&#xC785; &#xBC0F; &#xC54C;&#xB824;&#xC9C4; &#xBCC0;&#xC885; ChR2s &#xB4DC;&#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; &#xBE5B; &#xC2A4;&#xD30C;&#xC774;&#xD06C; &#xC5F4;&#xCC28; &#xC218; &#xC788;&#xC9C0;&#xB9CC;, &#xB0AE;&#xC740; &#xC870;&#xBA85; &#xAC10;&#xB3C4; &#xB610;&#xB294; &#xB290;&#xB9B0; &#xCC44;&#xB110; &#xC18D;&#xB3C4; &#xB860; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xC801;&#xC778; &#xC784;&#xC0C1; &#xC751;&#xC6A9; &#xD504;&#xB85C;&#xADF8;&#xB7A8;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xC81C;&#xD55C; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC120;&#xBB3C;&#xC774; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xBCC0;&#xD615;, &#xCE7C;&#xC298; &#xBE60;&#xB978;&#xB41C; &#xC751;&#xB2F5; &#xC2DC;&#xAC04; &#xBC0F; &#xC804;&#xC555; &#xC751;&#xB2F5;&#xC740; &#xC911;&#xC7AC; channelrhodopsin (CatCh) translocating ~ 70-fold &#xB354; &#xBBFC;&#xAC10;&#xD55C; &#xBE5B; &#xBCF4;&#xB2E4;&#xB294; &#xC57C;&#xC0DD;-&#xD0C0;&#xC785; ChR2. Catch&#xC758; &#xB6F0;&#xC5B4;&#xB09C; &#xC18D;&#xC131;&#xC758; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; Ca&sup2;(+) &#xCE68;&#xD22C;&#xC131;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC904;&#xAE30;. &#xC99D;&#xAC00; [Ca&sup2;(+)](i) Na(+) &#xCC44;&#xB110; &#xC804;&#xC555; &#xAC1C;&#xD3D0;&#xC758; &#xD65C;&#xC131;&#xD654;&#xB97C; &#xCD09;&#xC9C4; &#xD558; &#xACE0; &#xBE5B;&#xC774; &#xAC10;&#xB3C4; &#xC9C1;&#xC811; &#xC99D;&#xAC00; &#xB0B4;&#xBD80; &#xD45C;&#xBA74; &#xC7A0;&#xC7AC;&#xB825;&#xC744; &#xB04C;&#xC5B4;&#xC62C;&#xB9AC;&#xACE0;. &#xBE5B; &#xC790;&#xADF9;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; repolarization ca&sup2;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xD604;&#xC800; &#xD558; &#xAC8C; &#xAC00;&#xC18D; (+)-&#xC885;&#xC18D; BK &#xCC44;&#xB110; &#xD65C;&#xC131;&#xD654;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xC758; &#xACB0;&#xACFC; &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; &#xC54C; &#xC218; &#xC5C6;&#xB294; &#xC6D0;&#xB9AC; &#xC785;&#xC99D;: &#xC5EC;&#xB7EC;&#xCC28;&#xB840;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2E0;&#xACBD; &#xD65C;&#xC131;&#xD654;&#xC758; &#xBE60;&#xB978; &#xC18D;&#xB3C4; &#xC800;&#xD558; &#xC5C6;&#xC774; &#xAC10;&#xB3C4; &#xB192;&#xC774;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; divalent &#xC591;&#xC774;&#xC628; &#xD22C;&#xACFC;&#xC728;&#xC744; &#xBCC0;&#xD654;. &#xC774; &#xBE5B; &#xBB38;&#xC774; &#xCC44;&#xB110;&#xC758; &#xC784;&#xC0C1; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC774; &#xBD88;&#xBC95; &#xCCB4;&#xB958;&#xC790;.

Ca&sup2; + &#xC6B8;&#xD2B8;&#xB77C; &#xBE5B;&#xC5D0; &#xBBFC;&#xAC10;&#xD558;&#xACE0; &#xBE60;&#xB978; &#xC2E0;&#xACBD; &#xD65C;&#xC131;&#xD654;-&#xD22C;&#xACFC;&#xC131; channelrhodopsin &#xCE90;&#xCE58;.

El canal cati&#xF3;nico de luz cerrada canalrodopsina-2 (ChR2) se ha convertido r&#xE1;pidamente en una herramienta importante para la neurociencia, y su uso est&#xE1; siendo considerado en las intervenciones terap&#xE9;uticas. Aunque ChR2s variante de tipo salvaje y conocidos son capaces de conducir la luz activados por los trenes de espiga, su uso en las posibles aplicaciones cl&#xED;nicas est&#xE1; limitado por la sensibilidad con poca luz o la lenta cin&#xE9;tica de los canales. Se presenta una nueva variante, el calcio translocaci&#xF3;n canalrodopsina el disparo (Atajada), que media un tiempo de respuesta acelerada y una respuesta de tensi&#xF3;n que es ~ 70 veces m&#xE1;s sensible a la luz que la de tipo salvaje ChR2. Propiedades superiores de captura se derivan de su mayor Ca &#xB2; (+) la permeabilidad. Un aumento de [Ca &#xB2; (+)] (i) eleva el potencial de la superficie interna, lo que facilita la activaci&#xF3;n de sodio voltaje-dependientes (+) y la sensibilidad de los canales de forma indirecta el aumento de luz. La repolarizaci&#xF3;n tras la estimulaci&#xF3;n de luz es notablemente acelerado por Ca &#xB2; (+)-dependiente de la activaci&#xF3;n del canal BK. Nuestros resultados demuestran un principio hasta ahora desconocido: el cambio de la permeabilidad de la vacuna monovalente a los cationes divalentes para aumentar la sensibilidad sin comprometer la r&#xE1;pida cin&#xE9;tica de activaci&#xF3;n neuronal. Esto allana el camino para el uso cl&#xED;nico de la luz-canales con compuertas.

La activaci&#xF3;n neuronal ultra sensible a la luz y r&#xE1;pido con el Ca &#xB2; + permeable canalrodopsina Catch

&#x950C;&#x662F;&#x4F53;&#x5185;&#x7B2C;&#x4E8C;&#x6700;&#x4E30;&#x5BCC;&#x7684;&#x8FC7;&#x6E21;&#x91D1;&#x5C5E;&#x3002;&#x5C3D;&#x7BA1;&#x6570;&#x4EE5;&#x767E;&#x8BA1;&#x7684;&#x751F;&#x7269;&#x5206;&#x5B50;&#x5E94;&#x6709;&#x7684;&#x529F;&#x80FD;&#x548C;/&#x6216;&#x7ED3;&#x6784;&#x9700;&#x8981;&#x950C;&#xFF0C;&#x950C;&#x8FD0;&#x8F93;&#x5230;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x673A;&#x5236;&#x4E0D;&#x662F;&#x4E0D;&#x8A00;&#x800C;&#x55BB;&#x7684;&#x3002;ZIP (Zrt &#x548C; Irt &#x6837;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28; &#xFF1B;SLC39A) &#x5BB6;&#x65CF;&#x86CB;&#x767D;&#x7684;&#x884C;&#x4E3A;&#x589E;&#x52A0;&#x6E38;&#x79BB;&#x950C;&#x7684;&#x6D53;&#x5EA6;&#x3002;&#x4E00;&#x4E2A;&#x5927;&#x5BB6;&#x5EAD;&#x7684;&#x6210;&#x5458; ZIP &#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#xFF0C;&#x4EBA;&#x7C7B; ZIP4 &#x57FA;&#x56E0;&#x7A81;&#x53D8; (hZIP4 &#xFF1B;SLC39A4&#xFF09; &#x7684;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#xFF0C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x5BFC;&#x81F4;&#x75BE;&#x75C5; acrodermatitis enteropathica &#xFF08;AE&#xFF09;&#x3002;AE &#x7684;&#x7279;&#x70B9;&#x662F;&#x751F;&#x957F;&#x8FDF;&#x7F13;&#x548C;&#x8179;&#x6CFB;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x884C;&#x4E3A;&#x548C;&#x795E;&#x7ECF;&#x529F;&#x80FD;&#x7D0A;&#x4E71;&#x3002;&#x867D;&#x7136;&#x5DF2;&#x9610;&#x660E;&#x7684; hZIP4 &#x86CB;&#x767D;&#x8868;&#x8FBE;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5206;&#x5E03;&#xFF0C;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x7279;&#x5F02;&#x6027;&#xFF0C;&#x950C;&#x8FD0;&#x8F93;&#x548C;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x6240;&#x6D89;&#x53CA;&#x7684;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x6613;&#x4F4D;&#x7684;&#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x53C2;&#x6570;&#x90FD;&#x672A;&#x89E3;&#x51B3;&#x7684;&#x95EE;&#x9898;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x5EFA;&#x7ACB;&#x4E86;&#x4E4B;&#x540E;&#x5728;&#x975E;&#x6D32;&#x722A;&#x87FE;&#x5375;&#x6BCD;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E2D; hZIP4 &#x7684;&#x5F02;&#x6E90;&#x8868;&#x8FBE;&#x9AD8;&#x4FE1;&#x53F7;&#x5230;&#x566A;&#x58F0;&#x950C;&#x5438;&#x6536;&#x6D4B;&#x5B9A;&#x3002;&#x4ECE;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x7ED3;&#x679C;&#x8868;&#x660E;&#x950C;&#x3001; &#x94DC;&#x3001; &#x954D;&#x53EF;&#x4EE5;&#x4E58;&#x5750; hZIP4 &#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x6D53;&#x5EA6;&#x5728; micromolar &#x8303;&#x56F4;&#x5185;&#x65F6;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8FD8;&#x786E;&#x5B9A;&#x4E86;&#x94DC;&#x548C;&#x950C;&#x53EF;&#x4EE5;&#x8FD0; nanomolar &#x7ED1;&#x5B9A;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x3002;&#x76F8;&#x6BD4;&#x4E4B;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x5728;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#xFF0C;&#x954D;&#x53EF;&#x4EE5;&#x7ED1;&#x5B9A;&#xFF0C;&#x4F46;&#x4E0D;&#x901A;&#x8FC7; hZIP4 &#x8FD0;&#x8F93;&#x3002;&#x6700;&#x540E;&#xFF0C;&#x9A6C;&#x6765;&#x9170;&#x4E9A;&#x80FA;&#x6216; diethylpyrocarbonate &#x4E0E; hZIP4 &#x7684;&#x6807;&#x7B7E;&#x6307;&#x793A;&#xFF0C;extracellularly &#x53EF;&#x8BBF;&#x95EE;&#x7684;&#x7EC4;&#x6C28;&#x9178;&#xFF0C;&#x4F46;&#x4E0D;&#x662F;&#x542B;&#x534A;&#x80F1;&#x6C28;&#x9178;&#xFF0C;&#x6B8B;&#x7559;&#x7269;&#x662F;&#x5FC5;&#x9700;&#x7684;&#x76F4;&#x63A5;&#x6216;&#x95F4;&#x63A5;&#x5730;&#x4E3A;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x5438;&#x6536;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x7684;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x7ED3;&#x679C;&#x8BC6;&#x522B;&#x81F3;&#x5C11;&#x4E24;&#x4E2A;&#x534F;&#x8C03;&#x7AD9;&#x70B9;&#x7684;&#x4E8C;&#x4EF7;&#x9633;&#x79BB;&#x5B50;&#x548C;&#x8C03;&#x67E5;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7684; ZIP &#x5BB6;&#x5EAD;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E00;&#x4E2A;&#x65B0;&#x7684;&#x6846;&#x67B6;&#x3002;

&#x4EBA;&#x7C7B; ZIP4 &#x8F6C;&#x8FD0;&#x86CB;&#x767D;&#x6709;&#x4E24;&#x4E2A;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x4EB2;&#x548C;&#x529B;&#x548C;&#x4ECB;&#x5BFC;&#x7684;&#x591A;&#x4E2A;&#x8FC7;&#x6E21;&#x91D1;&#x5C5E;&#x7684;&#x8FD0;&#x8F93;&#x3002;

Zinc is the second most abundant transition metal in the body. Despite the fact that hundreds of biomolecules require zinc for proper function and/or structure, the mechanism of zinc transport into cells is not well-understood. The ZIP (Zrt- and Irt-like proteins; SLC39A) family of proteins acts to increase cytosolic concentrations of zinc. Mutations in one member of the ZIP family of proteins, the human ZIP4 (hZIP4; SLC39A4) protein, can result in the disease acrodermatitis enteropathica (AE). AE is characterized by growth retardation and diarrhea, as well as behavioral and neurological disturbances. While the cellular distribution of hZIP4 protein expression has been elucidated, the cation specificity, kinetic parameters of zinc transport, and residues involved in cation translocation are unresolved questions. Therefore, we have established a high signal-to-noise zinc uptake assay following heterologous expression of hZIP4 in Xenopus laevis oocytes. The results from our experiments have demonstrated that zinc, copper(II), and nickel can be transported by hZIP4 when the cation concentration is in the micromolar range. We have also identified a nanomolar binding affinity where copper(II) and zinc can be transported. In contrast, under these conditions, nickel can bind but is not transported by hZIP4. Finally, labeling of hZIP4 with maleimide or diethylpyrocarbonate indicates that extracellularly accessible histidine, but not cysteine, residues are required, either directly or indirectly, for cation uptake. The results of our experiments identify at least two coordination sites for divalent cations and provide a new framework for investigating the ZIP family of proteins.

The Human ZIP4 Transporter Has Two Distinct Binding Affinities and Mediates Transport of Multiple Transition Metals.

Le zinc est le m&#xE9;tal de transition le plus abondant dans le corps. Malgr&#xE9; le fait que des centaines de biomol&#xE9;cules besoin de zinc pour le bon fonctionnement et / ou de la structure, le m&#xE9;canisme de transport du zinc dans les cellules n&#x26;#39;est pas bien comprise. La ZIP (ZRT-et-Irt comme les prot&#xE9;ines; SLC39A) famille de prot&#xE9;ines agit pour augmenter les concentrations cytosoliques de zinc. Des mutations dans un membre de la famille ZIP de prot&#xE9;ines, l&#x26;#39;&#xEA;tre humain ZIP4 (hZIP4; SLC39A4) prot&#xE9;ines, peut entra&#xEE;ner la maladie acrodermatite ent&#xE9;ropathique (AE). AE est caract&#xE9;ris&#xE9; par un retard de croissance et de la diarrh&#xE9;e, ainsi que des troubles du comportement et neurologiques. Alors que la distribution cellulaire de hZIP4 expression de la prot&#xE9;ine a &#xE9;t&#xE9; &#xE9;lucid&#xE9;e, la sp&#xE9;cificit&#xE9; de cations, les param&#xE8;tres cin&#xE9;tiques de transport du zinc, et les r&#xE9;sidus impliqu&#xE9; dans la translocation de cations sont des questions non r&#xE9;solues. Par cons&#xE9;quent, nous avons &#xE9;tabli un rapport signal-bruit dosage absorption du zinc &#xE0; la suite l&#x26;#39;expression h&#xE9;t&#xE9;rologue de hZIP4 en ovocytes de Xenopus laevis. Les r&#xE9;sultats de nos exp&#xE9;riences ont d&#xE9;montr&#xE9; que le zinc, le cuivre (II), et le nickel peuvent &#xEA;tre transport&#xE9;s par hZIP4 lorsque la concentration en cations est dans la gamme micromolaire. Nous avons &#xE9;galement identifi&#xE9; une affinit&#xE9; nanomolaire contraignant o&#xF9; le cuivre (II) et le zinc peuvent &#xEA;tre transport&#xE9;s. En revanche, dans ces conditions, le nickel peut se lier, mais n&#x26;#39;est pas transport&#xE9; par hZIP4. Enfin, l&#x26;#39;&#xE9;tiquetage des hZIP4 avec mal&#xE9;imide ou di&#xE9;thyle indique que l&#x26;#39;histidine extracellulaire accessibles, mais pas les r&#xE9;sidus cyst&#xE9;ine, sont tenus, soit directement, soit indirectement, par l&#x26;#39;absorption de cations. Les r&#xE9;sultats de nos exp&#xE9;riences d&#x26;#39;identifier au moins deux sites de coordination pour les cations divalents et de fournir un nouveau cadre pour enqu&#xEA;ter sur la famille ZIP de prot&#xE9;ines.

Le Human Transporter ZIP4 a deux distincts affinit&#xE9;s de liaison et de transport de m&#xE9;diateur de m&#xE9;taux de transition multiples

Zink ist die zweith&auml;ufigste &Uuml;bergangsmetall im K&ouml;rper. Trotz der Tatsache, dass Hunderte von Biomolek&uuml;len Zink f&uuml;r einwandfreie Funktion und/oder Struktur erfordern ist die Wirkungsweise von Zink-Transport in die Zellen nicht anerkannte. ZIP (Zrt - und Irt-&auml;hnliche Proteine; SLC39A) Familie der Proteine fungiert Zytosolische Konzentrationen von Zink erh&ouml;hen. Mutationen in einem Mitglied der ZIP-Familie von Proteinen, die menschlichen ZIP4 (hZIP4; SLC39A4) Protein, kann die Krankheit Acrodermatitis Enteropathica (AE) f&uuml;hren. AE zeichnet sich durch Wachstumsretardierung und Durchfall, sowie Verhaltens- und neurologische St&ouml;rungen. W&auml;hrend die zellul&auml;re Verteilung der hZIP4 Proteinexpression gekl&auml;rt hat, die kation Spezifit&auml;t, kinetische Parameter der Zink-Transport und R&uuml;ckst&auml;nde kation Translokation beteiligt sind ungel&ouml;ste Fragen. Daher haben wir einen hohen Signal-Rausch-Zink-Aufnahme-Assay nach heterologe Expression von hZIP4 in Xenopus Laevis Eizellen etabliert. Die Ergebnisse aus unseren Experimenten haben gezeigt, dass Zink, Kupfer(II) und Nickel von hZIP4 bef&ouml;rdert werden k&ouml;nnen, wenn die kation-Konzentration im Bereich von micromolar ist. Wir haben auch eine Bindungsaffinit&auml;t Nanomolar identifiziert, wo Kupfer(II) und Zink transportiert werden kann. Im Gegensatz dazu unter diesen Bedingungen Nickel kann binden aber wird nicht durch hZIP4 transportiert. Schlie&szlig;lich gibt, die Kennzeichnung von hZIP4 mit Maleimide oder Diethyldicarbonat extracellularly zug&auml;nglich Histidin, aber nicht Cystein, R&uuml;ckst&auml;nde sind erforderlich, entweder direkt oder indirekt, f&uuml;r kation Aufnahme. Die Ergebnisse unserer Experimente mindestens zwei Koordinierung Standorte f&uuml;r bivalente Kationen zu identifizieren und liefern einen neuen Rahmen f&uuml;r die Untersuchung der ZIP-Familie der Proteine.

Der menschlichen ZIP4 Transporter hat zwei unterschiedliche verbindliche Affinit&auml;ten und Transport von mehreren &Uuml;bergangsmetalle vermittelt.

Lo zinco &egrave; il metallo di transizione secondo pi&ugrave; abbondante nel corpo. Nonostante il fatto che centinaia di biomolecole richiede zinco per il corretto funzionamento e/o struttura, il meccanismo di trasporto di zinco nelle cellule non &egrave; ben capito. ZIP (Zrt - e Irt-come le proteine; SLC39A) famiglia delle proteine agisce per aumentare la concentrazione citosoliche di zinco. Mutazioni in un membro della famiglia di proteine, il ZIP4 umano ZIP (hZIP4; Proteina SLC39A4), pu&ograve; provocare la malattia acrodermatite enteropatica (AE). AE &egrave; caratterizzata da ritardo della crescita e diarrea, come pure disturbi comportamentali e neurologici. Mentre la distribuzione cellulare di espressione della proteina di hZIP4 &egrave; stata chiarita, la specificit&agrave; del catione, parametri cinetici di zinco trasporto e residui coinvolti nella traslocazione cazione sono irrisolti. Pertanto, abbiamo stabilito un dosaggio di assorbimento elevato segnale-rumore zinco seguito espressione eterologa di hZIP4 in ovociti di Xenopus laevis. I risultati dei nostri esperimenti hanno dimostrato che lo zinco, rame (II) e nichel pu&ograve; essere trasportati da hZIP4 quando la concentrazione del catione nella gamma micromolar. Inoltre abbiamo identificato un&#39;affinit&agrave; di legame nanomolari dove pu&ograve; essere trasportati con zinco e rame (II). Al contrario, in queste condizioni, nichel pu&ograve; associare, ma non &egrave; trasportato da hZIP4. Infine, il contrassegno del hZIP4 con con o dietilpirocarbonato indica che i residui di istidina extracellularly accessibile, ma non cisteina, sono necessari, direttamente o indirettamente, per assorbimento di cationi. I risultati dei nostri esperimenti identificano almeno due siti di coordinamento per i cationi bivalenti e forniscono un nuovo quadro per indagare la famiglia ZIP delle proteine.

Il Human Transporter ZIP4 ha due distinte associazione affinit&agrave; e da intermediario trasporto di metalli di transizione pi&ugrave;.

&#x4E9C;&#x925B;&#x306F;&#x4F53;&#x5185;&#x3067;&#x4E8C;&#x756A;&#x76EE;&#x306B;&#x591A;&#x3044;&#x9077;&#x79FB;&#x91D1;&#x5C5E;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3002;&#x751F;&#x4F53;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x4F55;&#x767E;&#x3082;&#x306E;&#x9069;&#x5207;&#x306A;&#x6A5F;&#x80FD;&#x304A;&#x3088;&#x3073;/&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x4E9C;&#x925B;&#x3092;&#x5FC5;&#x8981;&#x3068;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x3044;&#x3046;&#x4E8B;&#x5B9F;&#x306B;&#x3082;&#x304B;&#x304B;&#x308F;&#x3089;&#x305A;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x3078;&#x306E;&#x4E9C;&#x925B;&#x8F38;&#x9001;&#x306E;&#x30E1;&#x30AB;&#x30CB;&#x30BA;&#x30E0;&#x306F;&#x3088;&#x304F;&#x7406;&#x89E3;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002; ZIP&#xFF08;ZRT&#x3068;IRT&#x306E;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;; SLC39A&#xFF09;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;&#x30D5;&#x30A1;&#x30DF;&#x30EA;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x4E9C;&#x925B;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x8CEA;&#x30BE;&#x30EB;&#x306E;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x3092;&#x5897;&#x52A0;&#x3055;&#x305B;&#x308B;&#x5F79;&#x5272;&#x3092;&#x679C;&#x305F;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;ZIP&#x30D5;&#x30A1;&#x30DF;&#x30EA;&#x30FC;&#x306E;&#x4E00;&#x54E1;&#x3001;&#x4EBA;&#x9593;ZIP4&#xFF08;hZIP4&#x3001;SLC39A4&#xFF09;&#x306E;&#x5909;&#x7570;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306F;&#x3001;&#x75BE;&#x60A3;&#x306E;&#x8178;&#x6027;&#x5148;&#x7AEF;&#x76AE;&#x819A;&#x708E;&#xFF08;AE&#xFF09;&#x304C;&#x767A;&#x751F;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002; AE&#x306F;&#x3001;&#x6210;&#x9577;&#x9045;&#x5EF6;&#x3084;&#x4E0B;&#x75E2;&#x3060;&#x3051;&#x3067;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x884C;&#x52D5;&#x3084;&#x795E;&#x7D4C;&#x969C;&#x5BB3;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x7279;&#x5FB4;&#x3065;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x308B;&#x3002; hZIP4&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x767A;&#x73FE;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x5206;&#x5E03;&#x304C;&#x89E3;&#x660E;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x3001;&#x967D;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x8EE2;&#x306B;&#x95A2;&#x4E0E;&#x3059;&#x308B;&#x30AB;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;&#x306E;&#x7279;&#x7570;&#x6027;&#x3001;&#x4E9C;&#x925B;&#x8F38;&#x9001;&#x306E;&#x901F;&#x5EA6;&#x8AD6;&#x7684;&#x30D1;&#x30E9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30BF;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x6B8B;&#x57FA;&#x304C;&#x672A;&#x89E3;&#x6C7A;&#x306E;&#x8CEA;&#x554F;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x30A2;&#x30D5;&#x30EA;&#x30AB;&#x30C4;&#x30E1;&#x30AC;&#x30A8;&#x30EB;&#x5375;&#x6BCD;&#x7D30;&#x80DE;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;hZIP4&#x306E;&#x7570;&#x7A2E;&#x767A;&#x73FE;&#x5F8C;&#x306B;&#x9AD8;&#x3044;&#x4FE1;&#x53F7;&#x5BFE;&#x96D1;&#x97F3;&#x4E9C;&#x925B;&#x53D6;&#x308A;&#x8FBC;&#x307F;&#x30A2;&#x30C3;&#x30BB;&#x30A4;&#x3092;&#x78BA;&#x7ACB;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x304B;&#x3089;&#x3001;&#x30AB;&#x30C1;&#x30AA;&#x30F3;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x304C;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30E2;&#x30EB;&#x306E;&#x7BC4;&#x56F2;&#x5185;&#x306B;&#x3042;&#x308B;&#x3068;&#x304D;&#x3001;&#x4E9C;&#x925B;&#x3001;&#x9285;&#xFF08;II&#xFF09;&#x3001;&#x30CB;&#x30C3;&#x30B1;&#x30EB;&#x304C;hZIP4&#x3067;&#x8F38;&#x9001;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x5B9F;&#x8A3C;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x9285;&#xFF08;II&#xFF09;&#x3068;&#x4E9C;&#x925B;&#x3092;&#x79FB;&#x9001;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x30CA;&#x30CE;&#x30E2;&#x30EB;&#x7D50;&#x5408;&#x89AA;&#x548C;&#x6027;&#x3092;&#x540C;&#x5B9A;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x5BFE;&#x7167;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x6761;&#x4EF6;&#x4E0B;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30CB;&#x30C3;&#x30B1;&#x30EB;&#x306B;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x304C;&#x3001;hZIP4&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x8F38;&#x9001;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;&#x6700;&#x5F8C;&#x306B;&#x3001;&#x30DE;&#x30EC;&#x30A4;&#x30DF;&#x30C9;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x30B8;&#x30A8;&#x30C1;&#x30EB;&#x3068;hZIP4&#x6A19;&#x8B58;&#x3059;&#x308B;&#x3068;&#x3001;&#x305D;&#x306E;&#x5916;&#x306B;&#x30A2;&#x30AF;&#x30BB;&#x30B9;&#x3059;&#x308B;&#x30D2;&#x30B9;&#x30C1;&#x30B8;&#x30F3;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3067;&#x306F;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30A4;&#x30F3;&#x6B8B;&#x57FA;&#x306F;&#x3001;&#x967D;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x306E;&#x53D6;&#x308A;&#x8FBC;&#x307F;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x3001;&#x76F4;&#x63A5;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x9593;&#x63A5;&#x7684;&#x306B;&#x3001;&#x8981;&#x6C42;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306E;&#x5B9F;&#x9A13;&#x306E;&#x7D50;&#x679C;&#x306F;&#x3001;&#x4E8C;&#x4FA1;&#x306E;&#x967D;&#x30A4;&#x30AA;&#x30F3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x5C11;&#x306A;&#x304F;&#x3068;&#x3082;&#x4E8C;&#x3064;&#x306E;&#x914D;&#x4F4D;&#x90E8;&#x4F4D;&#x3092;&#x7279;&#x5B9A;&#x3057;&#x3001;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x306E;ZIP&#x30D5;&#x30A1;&#x30DF;&#x30EA;&#x30FC;&#x3092;&#x8ABF;&#x67FB;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30D5;&#x30EC;&#x30FC;&#x30E0;&#x30EF;&#x30FC;&#x30AF;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

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Robert E. Dempski

Department of Chemistry and Biochemistry

Worcester Polytechnic Institute

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Robert E. Dempski

.css-o250i3{font-size:18px;font-family:Open Sans,sans-serif;line-height:21.6px;}Department of Chemistry and Biochemistry

Worcester Polytechnic Institute

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Department of Chemistry and Biochemistry