High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research.   Mammalian DNA is enzymatically ...

New England BioLabs

&#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC744; &#xC774;&#xD574; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xC5ED;&#xBC29;&#xD5A5; &#xC720;&#xC804; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC740; &#xC608;&#xCE21;&#xB41C; &#xD615;&#xC5D0; &#xC758;&#xC874; &#xD558;&#xC9C0; &#xC54A;&#xACE0; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xACA9;&#xB9AC; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC758; &#xD6A8;&#xC728;&#xC131;&#xC744; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xC2DC;&#xCF1C; &#xD06C;&#xAC8C; &#xCD09;&#xC9C4; &#xB420; &#xAC83; &#xC774;&#xB2E4;. &#xC0AD;&#xC81C; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xBD84;&#xB9AC; &#xC124;&#xB9BD;&#xB41C; PCR &#xAE30;&#xBC18;&#xC758; &#xBC29;&#xBC95;&#xC740; &#xB110;&#xB9AC; Caenorhabditis elegans&#xC5D0;&#xC774; &#xBAA9;&#xC801;&#xC744; &#xC704;&#xD574; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xC791;&#xC740; &#xC0AD;&#xC81C; &#xACA9;&#xB9AC; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xBCF4;&#xACE0; &#xC5EC;&#xAE30; PCR &#xAE30;&#xBC18; &#xBC29;&#xBC95;&#xC758; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC218;&#xC815;&#xC744; &#xC0AD;&#xC81C; PCR &#xC81C;&#xD488; &#xC99D;&#xD3ED; &#xB418;&#xB3C4;&#xB85D; &#xC57C;&#xC0DD;-&#xD0C0;&#xC785; PCR &#xC81C;&#xD488;&#xC758; &#xD569;&#xC131;&#xC744; &#xCC28;&#xB2E8; &#xD558;&#xB824;&#xBA74; &#xB0B4; &#xC81C;&#xD55C; &#xD6A8;&#xC18C;&#xB97C; &#xCC44;&#xC6A9; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xC218;&#xC815; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xC791;&#xC740; &#xD0C0;&#xAC9F;&#xB41C; &#xC0AD;&#xC81C; C.elegans &#xACA9;&#xB9AC;&#xC758; &#xD6A8;&#xC728;&#xC131; &#xC99D;&#xAC00;. &#xC57D; 400 000 haploid &#xAC8C;&#xB188;, &#xC0AD;&#xC81C;&#xC640; &#xD568;&#xAED8; &#xAC00;&#xC7A5;&#xC758; &#xC791;&#xC740; &#xD654;&#xBA74;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACE0;&#xB9BD; &#xB410;&#xB2E4; &#xBC29;&#xBC95; 6 &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC0AD;&#xC81C; &#xC885;&#xC790;&#xAC00;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &lt; 1.0 kb. &#xC774; &#xC218;&#xC815;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; PCR &#xAC80;&#xCD9C; &#xAC10;&#xB3C4; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xC57D; &#xC0AC;&#xC9C4; &#xD070; &#xD480;&#xB9C1; &#xBD80;&#xB2F4; &#xD654;&#xBA74;&#xC5D0; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; &#xC2DC; &#xC57D;&#xC744; &#xC904;&#xC774;&#xBA70; DNA &#xC0D8;&#xD50C;&#xC758; &#xD5C8;&#xC6A9;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC77C;&#xBC18;&#xC801;&#xC778; &#xC99D;&#xD3ED;&#xC758; &#xD6A8;&#xACFC;&#xC801;&#xC778; &#xC5B5;&#xC81C; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xB3C5;&#xB9BD;&#xC801;&#xC778; &#xB1CC;&#xAD00; &#xC30D; &#xD568;&#xAED8; &#xB2E4;&#xC911;&#xD654; &#xD5C8;&#xC6A9;. &#xC774; &#xAE30;&#xBC95;&#xC758; &#xD6A8;&#xC728; &#xC99D;&#xAC00; &#xB9CC;&#xB4DC;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xB178;&#xD06C; &#xC544;&#xC6C3; &#xC2A4;&#xD06C;&#xB9B0;&#xC744; &#xCC29;&#xC218; &#xD558;&#xB294; &#xC791;&#xC740; &#xC2E4;&#xD5D8;&#xC2E4;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB354; &#xC2E4;&#xC6A9;&#xC801;&#xC778;.

&#xB192;&#xC740; &#xB0B4; &#xC81C;&#xD55C; endonucleases &#xBC0F; PCR&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xB300;&#xC0C1;&#xB41C; Caenorhabditis elegans &#xC0AD;&#xC81C; &#xAE34;&#xC7A5;&#xC758; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xBD84;&#xB9AC;.

&#x53CD;&#x5411;&#x9057;&#x4F20;&#x9014;&#x5F84;&#x4E86;&#x89E3;&#x57FA;&#x56E0;&#x529F;&#x80FD;&#x5C06;&#x4F1A;&#x5927;&#x5927;&#x4FBF;&#x5229;&#xFF0C;&#x901A;&#x8FC7;&#x589E;&#x52A0;&#x9694;&#x79BB;&#x65E0;&#x9700;&#x4F9D;&#x8D56;&#x9884;&#x6D4B;&#x8868;&#x578B;&#x7A81;&#x53D8;&#x4F53;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x7684;&#x6548;&#x7387;&#x3002;&#x4E3A;&#x6B64;&#x76EE;&#x7684;&#x5728;&#x6746;&#x7EBF;&#x866B;&#x5E7F;&#x6CDB;&#x7528;&#x4E8E;&#x9694;&#x79BB;&#x7A81;&#x53D8;&#x7684;&#x5EFA;&#x7ACB;&#x57FA;&#x4E8E;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x94FE;&#x53CD;&#x5E94;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x4F46;&#x662F;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x662F;&#x5728;&#x5B64;&#x7ACB;&#x5C0F;&#x5220;&#x9664;&#x64CD;&#x4F5C;&#x6548;&#x7387;&#x4F4E;&#x4E0B;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x62A5;&#x544A;&#x57FA;&#x4E8E;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x94FE;&#x53CD;&#x5E94;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x65B0;&#x578B;&#x6539;&#x6027;&#x96C7;&#x7528;&#x8010;&#x70ED;&#x7684;&#x9650;&#x5236;&#x9176;&#xFF0C;&#x963B;&#x6B62;&#x7684;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; PCR &#x4EA7;&#x7269;&#xFF0C;&#x5408;&#x6210;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x6837;&#xFF0C;&#x53EA;&#x662F;&#x5220;&#x9664; PCR &#x4EA7;&#x54C1;&#x88AB;&#x653E;&#x5927;&#x3002;&#x8FD9;&#x9879;&#x4FEE;&#x6539;&#x5927;&#x5927;&#x63D0;&#x9AD8;&#x9694;&#x79BB;&#x5C0F;&#x76EE;&#x6807;&#x7684;&#x5220;&#x9664;&#x7EBF;&#x866B;&#x4E2D;&#x7684;&#x6548;&#x7387;&#x3002;&#x4F7F;&#x7528;&#x6B64;&#x65B9;&#x6CD5;&#x516D;&#x65B0;&#x5220;&#x9664;&#x682A;&#x88AB;&#x9694;&#x7EDD;&#x7684;&#x5927;&#x7EA6; 400 000 &#x4E2A;&#x5355;&#x500D;&#x4F53;&#x57FA;&#x56E0;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x5220;&#x9664;&#x6700;&#x5C0F;&#x5C4F;&#x5E55; &lt; 1.0 kb&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x6B64;&#x4FEE;&#x6539;&#x66F4;&#x591A;&#x805A;&#x5408;&#x9176;&#x94FE;&#x53CD;&#x5E94;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7075;&#x654F;&#x5EA6;&#x5141;&#x8BB8;&#x5927;&#x7EA6; 10 &#x500D;&#x66F4;&#x5927;&#x6C60;&#x7684; DNA &#x6837;&#x672C;&#xFF0C;&#x51CF;&#x5C11;&#x4E86;&#x7CBE;&#x529B;&#x548C;&#x5C4F;&#x5E55;&#x6240;&#x9700;&#x7684;&#x8BD5;&#x5242;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x6709;&#x6548;&#x5236;&#x6B62;&#x975E;&#x5F02;&#x6027;&#x6269;&#x589E;&#x5141;&#x8BB8;&#x6709;&#x51E0;&#x4E2A;&#x72EC;&#x7ACB;&#x7684;&#x5E95;&#x6F06;&#x5BF9;&#x591A;&#x8DEF;&#x590D;&#x7528;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x6280;&#x672F;&#x63D0;&#x9AD8;&#x7684;&#x6548;&#x7387;&#x53D8;&#x5F97;&#x66F4;&#x52A0;&#x5207;&#x5B9E;&#x53EF;&#x884C;&#x5C0F;&#x578B;&#x7684;&#x5B9E;&#x9A8C;&#x5BA4;&#xFF0C;&#x8FDB;&#x884C;&#x57FA;&#x56E0;&#x6572;&#x51FA;&#x5C4F;&#x5E55;&#x3002;

&#x4F7F;&#x7528;&#x9AD8;&#x5EA6;&#x8010;&#x9AD8;&#x6E29;&#x9650;&#x5236;&#x6027;&#x5185;&#x5207;&#x9176;&#x548C; PCR &#x7684;&#x6709;&#x9488;&#x5BF9;&#x6027;&#x79C0;&#x4E3D;&#x9690;&#x6746;&#x7EBF;&#x866B;&#x5220;&#x9664;&#x682A;&#x9AD8;&#x6548;&#x5206;&#x79BB;&#x3002;

Reverse genetic approaches to understanding gene function would be greatly facilitated by increasing the efficiency of methods for isolating mutants without the reliance on a predicted phenotype. Established PCR-based methods of isolating deletion mutants are widely used for this purpose in Caenorhabditis elegans. However, these methods are inefficient at isolating small deletions. We report here a novel modification of PCR-based methods, employing thermostable restriction enzymes to block the synthesis of wild-type PCR product, so that only the deletion PCR product is amplified. This modification greatly increases the efficiency of isolating small targeted deletions in C.elegans. Using this method six new deletion strains were isolated from a small screen of approximately 400 000 haploid genomes, most with deletions <1.0 kb. Greater PCR detection sensitivity by this modification permitted approximately 10-fold greater pooling of DNA samples, reducing the effort and reagents required for screens. In addition, effective suppression of non-specific amplification allowed multiplexing with several independent primer pairs. The increased efficiency of this technique makes it more practical for small laboratories to undertake gene knock-out screens.

Efficient isolation of targeted Caenorhabditis elegans deletion strains using highly thermostable restriction endonucleases and PCR.

Des approches de g&eacute;n&eacute;tiques inverses pour comprendre la fonction des g&egrave;nes seraient grandement facilit&eacute;es en augmentant l&#39;efficacit&eacute; des m&eacute;thodes pour isoler des mutants sans le recours &agrave; un ph&eacute;notype pr&eacute;dit. M&eacute;thodes &eacute;tablies par PCR d&#39;isoler des mutants de d&eacute;l&eacute;tion sont largement utilis&eacute;s &agrave; cet effet dans des elegans de Caenorhabditis. Cependant, ces m&eacute;thodes sont inefficaces &agrave; isoler les petites d&eacute;l&eacute;tions. Nous rapportons ici une nouvelle modification du PCR-based methods, utilisant des enzymes de restriction thermostables de bloquer la synth&egrave;se du produit PCR de type sauvage, afin que seul le produit PCR de suppression est amplifi&eacute;. Cette modification augmente consid&eacute;rablement l&#39;efficacit&eacute; d&#39;isolement de petites d&eacute;l&eacute;tions cibl&eacute;es de C.elegans. &Agrave; l&#39;aide de cette m&eacute;thode six nouvelles suppression souches ont &eacute;t&eacute; isol&eacute;es d&#39;un petit &eacute;cran d&#39;environ 400 000 de g&eacute;nomes haplo&iuml;des, plus de destructions &lt; 1,0 kb. Environ 10 fois plus grand regroupement d&#39;&eacute;chantillons d&#39;ADN, r&eacute;duire l&#39;effort et les r&eacute;actifs n&eacute;cessaires pour les &eacute;crans a permis une plus grande sensibilit&eacute; de d&eacute;tection par PCR de cette modification. En outre, efficace contre d&#39;amplification non sp&eacute;cifiques autoris&eacute;s multiplexage avec plusieurs paires d&#39;amorces ind&eacute;pendant. L&#39;efficacit&eacute; accrue de cette technique rend plus pratiques pour les petits laboratoires d&#39;entreprendre des &eacute;crans de knock-out de g&egrave;ne.

Isolation efficace des cibles Caenorhabditis elegans souches de suppression &agrave; l&#39;aide d&#39;endonucl&eacute;ases de restriction tr&egrave;s thermostables et PCR.

Effiziente Isolierung von gezielten Caenorhabditis elegans Deletionsst&#xE4;mme mit hoch thermostabilen Restriktionsendonukleasen und PCR.

Approcci di genetici inverso per comprendere la funzione del gene sarebbero facilitati notevolmente aumentando l&#39;efficienza dei metodi per isolare mutanti senza la dipendenza da un fenotipo previsto. Metodi basati sulla PCR consolidati di isolamento di mutanti di delezione sono ampiamente utilizzati per questo scopo in Caenorhabditis elegans. Tuttavia, questi metodi sono inefficienti ad isolare piccole delezioni. Riportiamo qui una romanzo modifica dei metodi basati sulla PCR, che impiegano enzimi di restrizione termostabili per bloccare la sintesi del prodotto di PCR del selvaggio-tipo, cos&igrave; che solo il prodotto di PCR di eliminazione &egrave; amplificato. Questa modifica aumenta notevolmente l&#39;efficienza dell&#39;isolamento di piccole delezioni mirate in c. elegans. Utilizzando questo metodo sei nuovi eliminazione ceppi sono stati isolati da un piccolo schermo di circa 400 000 genomi aploidi, pi&ugrave; con delezioni &lt; 1.0 kb. Una maggiore sensibilit&agrave; di rilevamento PCR da questa modifica consentita circa 10 volte maggiore pool di campioni di DNA, riducendo lo sforzo e i reagenti necessari per gli schermi. Inoltre, efficace soppressione di amplificazione non specifico permesso multiplexing con diverse coppie di primer indipendente. L&#39;aumento dell&#39;efficienza di questa tecnica lo rende pi&ugrave; pratico per piccoli laboratori di intraprendere gli schermi di gene knock-out.

Efficiente isolamento mirato Caenorhabditis elegans ceppi eliminazione tramite endonucleasi altamente termostabile e PCR.

&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3092;&#x7406;&#x89E3;&#x3059;&#x308B;&#x9006;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B66;&#x7684;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306F;&#x3001;&#x5927;&#x304D;&#x304F;&#x4E88;&#x6E2C;&#x306E;&#x8868;&#x73FE;&#x578B;&#x306B;&#x4F9D;&#x5B58;&#x3057;&#x306A;&#x3044;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x4F53;&#x3092;&#x5206;&#x96E2;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306E;&#x52B9;&#x7387;&#x3092;&#x5897;&#x3084;&#x3059;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x4FC3;&#x9032;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3067;&#x3057;&#x3087;&#x3046;&#x3002;&#x6B20;&#x5931;&#x5909;&#x7570;&#x682A;&#x3092;&#x5206;&#x96E2;&#x3059;&#x308B;&#x78BA;&#x7ACB;&#x3055;&#x308C;&#x305F; PCR &#x57FA;&#x3065;&#x304B;&#x305B;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306F;&#x3001;&#x5E83;&#x304F;&#x7DDA;&#x866B;&#x3067;&#x3053;&#x306E;&#x76EE;&#x7684;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x305F;&#x3060;&#x3057;&#x3001;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F;&#x5C0F;&#x3055;&#x306A;&#x524A;&#x9664;&#x3092;&#x5206;&#x96E2;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3067;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x524A;&#x9664; PCR &#x306E;&#x88FD;&#x54C1;&#x304C;&#x5897;&#x5E45;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x306E;&#x3067;&#x3001;&#x91CE;&#x751F;&#x578B; PCR &#x7523;&#x7269;&#x306E;&#x5408;&#x6210;&#x3092;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x3059;&#x308B;&#x8010;&#x71B1;&#x6027;&#x306E;&#x5236;&#x9650;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x305F; PCR &#x6CD5;&#x306E;&#x65B0;&#x898F;&#x5909;&#x66F4;&#x3092;&#x5831;&#x544A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x5909;&#x66F4;&#x306F;&#x5927;&#x5E45;&#x306E;&#x5C0F;&#x3055;&#x306A;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x306E;&#x524A;&#x9664;&#x7DDA;&#x866B;&#x3092;&#x5206;&#x96E2;&#x3059;&#x308B;&#x52B9;&#x7387;&#x3092;&#x5411;&#x4E0A;&#x3055;&#x305B;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306E; 6 &#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x524A;&#x9664;&#x7CFB;&#x7D71;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x7D04; 400 000 &#x534A;&#x6570;&#x4F53;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x306E;&#x524A;&#x9664;&#x3068;&#x6700;&#x3082;&#x5C0F;&#x3055;&#x306A;&#x753B;&#x9762;&#x304B;&#x3089;&#x5206;&#x96E2;&#x3055;&#x308C;&#x305F; &lt; 1.0 kb&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x5909;&#x66F4;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3088;&#x308A; PCR &#x691C;&#x51FA;&#x611F;&#x5EA6;&#x306F;&#x7D04; 10 &#x500D;&#x3088;&#x308A;&#x5927;&#x304D;&#x3044;&#x52AA;&#x529B;&#x3068;&#x753B;&#x9762;&#x306E;&#x5FC5;&#x8981;&#x306A;&#x8A66;&#x85AC;&#x3092;&#x6E1B;&#x3089;&#x3059;&#x306E; DNA &#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x306E;&#x30D7;&#x30FC;&#x30EA;&#x30F3;&#x30B0;&#x8A31;&#x53EF;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x975E;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x5897;&#x5E45;&#x306E;&#x52B9;&#x679C;&#x7684;&#x306A;&#x6291;&#x5236;&#x306F;&#x3001;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E;&#x72EC;&#x7ACB;&#x3057;&#x305F;&#x30D7;&#x30E9;&#x30A4;&#x30DE;&#x30FC;&#x5BFE;&#x3092;&#x591A;&#x91CD;&#x5316;&#x3092;&#x8A31;&#x53EF;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30C6;&#x30AF;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AF;&#x306E;&#x52B9;&#x7387;&#x5411;&#x4E0A;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x30CE;&#x30C3;&#x30AF;&#x30A2;&#x30A6;&#x30C8;&#x753B;&#x9762;&#x306B;&#x7740;&#x624B;&#x3059;&#x308B;&#x5C0F;&#x3055;&#x306A;&#x7814;&#x7A76;&#x6240;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x3088;&#x308A;&#x5B9F;&#x7528;&#x7684;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x9AD8;&#x5EA6;&#x8010;&#x71B1;&#x6027;&#x5236;&#x9650;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x3068; PCR &#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x7D5E;&#x3063;&#x305F;&#x7DDA;&#x866B;&#x7DDA;&#x866B;&#x524A;&#x9664;&#x7CFB;&#x7D71;&#x306E;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;&#x5206;&#x96E2;&#x3002;

Enfoques gen&eacute;ticos inversas para comprender las funciones de los genes se facilitar&iacute;a enormemente incrementando la eficiencia de los m&eacute;todos para aislar mutantes sin la dependencia de un fenotipo predicha. M&eacute;todos basados en PCR establecidos de aislar mutantes de deleci&oacute;n son ampliamente utilizados para este prop&oacute;sito en Caenorhabditis elegans. Sin embargo, estos m&eacute;todos son ineficientes a aislar peque&ntilde;as canceladuras. Se presenta aqu&iacute; una nueva modificaci&oacute;n de m&eacute;todos basados en PCR, empleando termoestables enzimas de restricci&oacute;n para bloquear la s&iacute;ntesis del producto PCR de tipo salvaje, por lo que s&oacute;lo el producto PCR de eliminaci&oacute;n se amplifica. Esta modificaci&oacute;n aumenta grandemente la eficacia de aislar peque&ntilde;as eliminaciones selectivas en C.elegans. Utilizando este m&eacute;todo seis cepas nuevas de eliminaci&oacute;n se aislaron una pantalla peque&ntilde;a de aproximadamente 400 000 genomas haploides, m&aacute;s con las canceladuras &lt; 1.0 kb. Una mayor sensibilidad de detecci&oacute;n de PCR por esta modificaci&oacute;n permite aproximadamente 10 veces mayor agrupamiento de muestras de ADN, reduciendo el esfuerzo y los reactivos necesarios para las pantallas. Adem&aacute;s, la supresi&oacute;n efectiva de amplificaci&oacute;n inespec&iacute;fica permiti&oacute; multiplexaci&oacute;n con varios pares de cartilla independiente. El aumento de la eficiencia de esta t&eacute;cnica, resulta m&aacute;s pr&aacute;ctico para peque&ntilde;os laboratorios realizar pantallas de knock-out del gene.

Eficaz aislamiento de cepas de eliminaci&oacute;n elegans de Caenorhabditis dirigidas con endonucleasas de restricci&oacute;n altamente termoestables y PCR.

MmeI &#x662F;&#x4E00;&#x79CD;&#x4E0D;&#x5BFB;&#x5E38;&#x7684;&#x7B2C;&#x4E8C;&#x7C7B;&#x9650;&#x5236;&#x9176;&#xFF0C;&#x53EF;&#x7528;&#x4E8E;&#x751F;&#x6210;&#x957F;&#x5E8F;&#x5217;&#x7684;&#x6807;&#x8BB0;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x6709;&#x514B;&#x9686; MmeI &#x9650;&#x5236;&#x4FEE;&#x6539; (R M) &#x7CFB;&#x7EDF;&#xFF0C;&#x53D1;&#x73B0;&#x5B83;&#x662F;&#x7531;&#x5355;&#x4E2A;&#x86CB;&#x767D;&#x5177;&#x6709;&#x6838;&#x9178;&#x5185;&#x5207;&#x9176;&#x548C; DNA &#x7532;&#x57FA;&#x8F6C;&#x79FB;&#x9176;&#x6D3B;&#x52A8;&#x3002;&#x86CB;&#x767D;&#x8D28;&#x7531;&#x6838;&#x9178;&#x5185;&#x5207;&#x9176;&#x6C28;&#x57FA;&#x672B;&#x7AEF;&#x57DF;&#x3001; &#x4E2D;&#x592E; DNA &#x7532;&#x57FA;&#x8F6C;&#x79FB;&#x9176;&#x57DF;&#x548C; C &#x7EC8;&#x7AEF; DNA &#x8BC6;&#x522B;&#x57DF;&#x7EC4;&#x6210;&#x3002;&#x6838;&#x9178;&#x5185;&#x5207;&#x9176;&#x526A;&#x5207;&#x4E00;&#x4E2A;&#x7AD9;&#x70B9;&#x4E0A;&#x7684;&#x4E24;&#x4E2A; DNA &#x94FE;&#x540C;&#x65F6;&#xFF0C;&#x5728;&#x4E24;&#x4E2A;&#x7AD9;&#x70B9;&#x8FDB;&#x884C;&#x4EA4;&#x4E92;&#x6765;&#x5B8C;&#x6210;&#x5288;&#x7ED1;&#x5B9A;&#x7684;&#x9176;&#x3002;&#x5288;&#x88C2;&#x6BD4;&#x672A;&#x4FEE;&#x6539; dna &#x7532;&#x57FA;&#x8F6C;&#x79FB;&#x66F4;&#x8FC5;&#x901F;&#x5730;&#x53D1;&#x751F;&#x3002;MmeI &#x4FEE;&#x6539;&#x53EA;&#x5728;&#x9876;&#x90E8;&#x94A2;&#x7EDE;&#x7EBF;&#x3001; &#x817A;&#x560C;&#x5464; 5&#39;-TCCRAC-3&#39;&#x3002;MmeI &#x6838;&#x9178;&#x5185;&#x5207;&#x9176;&#x6D3B;&#x6027;&#x88AB;&#x963B;&#x6B62;&#x8FD9;&#x9876;&#x94A2;&#x7EDE;&#x7EBF;&#x817A;&#x560C;&#x5464;&#x7532;&#x57FA;&#x5316;&#x548C;&#x4E0D;&#x53D7;&#x7532;&#x57FA;&#x5316;&#x4E2D;&#x8865;&#x5145;&#x94A2;&#x7EDE;&#x7EBF;&#x3001; &#x817A;&#x560C;&#x5464; 5&#39;-GTYGGA-3&#39;&#x3002;&#x6CA1;&#x6709;&#x989D;&#x5916;&#x7684; DNA &#x4FEE;&#x9970; MmeI R-M &#x7CFB;&#x7EDF;&#xFF0C;&#x6B63;&#x5982;&#x5148;&#x524D;&#x7279;&#x5F81;&#x7C7B;&#x578B; IIG R-M &#x7CFB;&#x7EDF;&#x9700;&#x8981;&#x4E0E;&#x76F8;&#x5173;&#x8054;&#x3002;MmeI R-M &#x7CFB;&#x7EDF;&#x56E0;&#x6B64;&#x4F1A;&#x53EA;&#x4E00;&#x4E2A;&#x4E24;&#x4E2A;&#x7684; DNA &#x94FE;&#x4E0A;&#x7684;&#x4FEE;&#x6539;&#x4FDD;&#x62A4;&#x4E3B;&#x673A;&#x4F7F;&#x7528;&#x3002;MmeI &#x4F53;&#x7CFB;&#x7ED3;&#x6784;&#x662F;&#x5BF9;&#x88C5;&#x914D;&#x5176;&#x4E2D;&#x5355;&#x4E2A; DNA &#x8BC6;&#x522B;&#x57DF;&#x76EE;&#x6807;&#x7684;&#x6838;&#x9178;&#x5185;&#x5207;&#x9176;&#x548C; DNA &#x7532;&#x57FA;&#x8F6C;&#x79FB;&#x9176;&#x6D3B;&#x52A8;&#x9650;&#x5236;&#x4FEE;&#x6539;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x4E00;&#x4E2A;&#x6700;&#x5C0F;&#x7684;&#x505A;&#x6CD5;&#x3002;

MmeI&#xFF1A; &#x6700;&#x5C0F;&#x7B2C;&#x4E8C;&#x7C7B;&#x9650;&#x5236;&#x4FEE;&#x6539;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x4EC5;&#x4FEE;&#x6539;&#x4FDD;&#x62A4;&#x4E3B;&#x673A;&#x7684;&#x4E00;&#x4E2A; DNA &#x94FE;&#x3002;

MmeI is an unusual Type II restriction enzyme that is useful for generating long sequence tags. We have cloned the MmeI restriction-modification (R-M) system and found it to consist of a single protein having both endonuclease and DNA methyltransferase activities. The protein comprises an amino-terminal endonuclease domain, a central DNA methyltransferase domain and C-terminal DNA recognition domain. The endonuclease cuts the two DNA strands at one site simultaneously, with enzyme bound at two sites interacting to accomplish scission. Cleavage occurs more rapidly than methyl transfer on unmodified DNA. MmeI modifies only the adenine in the top strand, 5'-TCCRAC-3'. MmeI endonuclease activity is blocked by this top strand adenine methylation and is unaffected by methylation of the adenine in the complementary strand, 5'-GTYGGA-3'. There is no additional DNA modification associated with the MmeI R-M system, as is required for previously characterized Type IIG R-M systems. The MmeI R-M system thus uses modification on only one of the two DNA strands for host protection. The MmeI architecture represents a minimal approach to assembling a restriction-modification system wherein a single DNA recognition domain targets both the endonuclease and DNA methyltransferase activities.

MmeI: a minimal Type II restriction-modification system that only modifies one DNA strand for host protection.

MmeI est une enzyme de restriction de Type II inhabituelle qui est utile pour g&eacute;n&eacute;rer des &eacute;tiquettes de longues s&eacute;quences. Nous avons clon&eacute; le syst&egrave;me de restriction-R-M (modification) MmeI et trouv&eacute; se composer d&#39;une seule prot&eacute;ine endonucl&eacute;ase et activit&eacute;s d&#39;ADN m&eacute;thyltransf&eacute;rase. La prot&eacute;ine comprend un domaine amino-terminale endonucl&eacute;ase et un central domaine l&#39;ADN m&eacute;thyltransf&eacute;rase, domaine de reconnaissance ADN C-terminal. L&#39;endonucl&eacute;ase coupe les deux brins d&#39;ADN au m&ecirc;me endroit en m&ecirc;me temps, avec l&#39;enzyme li&eacute;e &agrave; deux sites interagissant pour accomplir la scission. Le clivage se produit plus rapidement que le transfert de m&eacute;thyle sur l&#39;ADN non modifi&eacute;. MmeI modifie seulement l&#39;ad&eacute;nine dans le volet sup&eacute;rieur, 5&#39;-TCCRAC-3&#39;. Activit&eacute; endonucl&eacute;asique MmeI est bloqu&eacute;e par cette m&eacute;thylation d&#39;ad&eacute;nine de brin sup&eacute;rieur et n&#39;est pas affect&eacute;e par la m&eacute;thylation de l&#39;ad&eacute;nine dans le brin compl&eacute;mentaire, 5&#39;-GTYGGA-3&#39;. Il n&#39;y a aucune modification de l&#39;ADN suppl&eacute;mentaire associ&eacute;e au syst&egrave;me de la MmeI R-M, comme est requise pour les syst&egrave;mes de Type IIG R-M pr&eacute;c&eacute;demment caract&eacute;ris&eacute;es. Ainsi, le syst&egrave;me MmeI R-M utilise modification sur une seule des deux brins de l&#39;ADN pour la protection de l&#39;h&ocirc;te. L&#39;architecture de la MmeI repr&eacute;sente une approche minimale au montage d&#39;un syst&egrave;me de restriction-modification dans laquelle un seul domaine de la reconnaissance de l&#39;ADN cible l&#39;endonucl&eacute;ase et activit&eacute;s d&#39;ADN m&eacute;thyltransf&eacute;rase.

MmeI : un Type II-modification des restrictions syst&egrave;me minimal qui modifie uniquement un seul brin d&#39;ADN pour la protection de l&#39;h&ocirc;te.

MmeI ist eine ungew&ouml;hnliche Typ II Beschr&auml;nkungsenzym, das beim Erstellen von langen Sequenz Markierungen ist. Wir haben das MmeI Beschr&auml;nkung-Modifikation (R-M) System geklont und fand es ein einziges Protein Endonuklease sowohl DNA Methyltransferase Aktivit&auml;ten bestehen. Das Protein besteht aus einer amino-Terminal Endonuklease-Dom&auml;ne, einer zentralen DNA-Methyltransferase-Dom&auml;ne und C-terminale DNA Anerkennung Domain. Die Endonuklease schneidet die zwei DNA-Str&auml;nge an einem Standort gleichzeitig mit Enzym gebunden an zwei Standorten interagieren um Abspaltung zu erreichen. Spaltbarkeit tritt schneller als Methyl-Transfer auf unver&auml;nderte DNA. MmeI &auml;ndert nur die Adenin im oberen Strang, 5&#39;-TCCRAC-3&#39;. MmeI Endonuklease Aktivit&auml;t dieser oberen Strang-Adenin-Methylierung geblockt wird und wird nicht durch Methylierung von Adenin in den komplement&auml;ren Strang, 5&#39;-GTYGGA-3&#39;. Es gibt keine zus&auml;tzliche DNA-Modifikation, verbunden mit dem MmeI R-M-System, wie f&uuml;r zuvor gekennzeichneten Typ IIG R-M-Systeme erforderlich ist. So verwendet das MmeI R-M-System &Auml;nderung nur f&uuml;r einen der beiden DNA-Str&auml;nge zur Hostschutz. Die MmeI-Architektur stellt einen minimalen Ansatz zur Montage ein Beschr&auml;nkung &Auml;nderung System worin eine Einzeldom&auml;ne DNA-Anerkennung sowohl der DNA Methyltransferase Aktivit&auml;ten die Endonuklease zielt.

MmeI: ein minimales Typ II Beschr&auml;nkung &Auml;nderung System, das nur ein DNA-Strang f&uuml;r Hostschutz &auml;ndert.

MmeI &egrave; un insolito enzima di restrizione di tipo II che &egrave; utile per generare tag lunga sequenza. Abbiamo clonato il sistema di restrizione-modificazione (R-M) MmeI e trovato che consistono di una singola proteina avendo endonucleasi e attivit&agrave; di DNA metiltransferasi. La proteina &egrave; costituito da un dominio amino-terminale endonucleasi, un dominio centrale di methyltransferase del DNA e dominio di riconoscimento del DNA C-terminale. Le endonucleasi taglia simultaneamente, i due filamenti di DNA in un sito con enzima legato a due siti di interazione per compire la scissione. Scissione si verifica pi&ugrave; rapidamente di trasferimento del metile sul DNA non modificato. MmeI modifica solo l&#39;adenina nel filo top, 5 &#39;-TCCRAC - 3&#39;. Attivit&agrave; endonucleasi MmeI &egrave; bloccato da questa metilazione di adenina filo top e non &egrave; influenzato da metilazione dell&#39;adenina in filamento complementare, 5 &#39;-GTYGGA - 3&#39;. Non non c&#39;&egrave; nessun ulteriori modifiche del DNA associato al sistema MmeI R-M, come &egrave; richiesto per i sistemi di tipo IIG R-M in precedenza caratterizzato. Il sistema MmeI R-M utilizza quindi modifica su uno solo dei due filamenti di DNA di protezione host. L&#39;architettura MmeI rappresenta un minimo approccio al montaggio di un sistema di restrizione-modificazione in cui &egrave; destinato un singolo dominio di riconoscimento del DNA endonucleasi sia attivit&agrave; di DNA metiltransferasi.

MmeI: un tipo II restrizione-modificazione sistema minimale che modifica solo un filo del DNA di protezione host.

&#x30B3;&#x30ED;&#x30CB;&#x30FC;&#x306F;&#x3001;&#x9577;&#x3044;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x306E;&#x30BF;&#x30B0;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x4FBF;&#x5229;&#x3067;&#x3059;&#x304C;&#x73CD;&#x3057;&#x3044; II &#x578B;&#x5236;&#x9650;&#x9175;&#x7D20;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x30B3;&#x30ED;&#x30CB;&#x30FC; &#xFF08;R-M&#xFF09; &#x306E;&#x5236;&#x9650;&#x4FEE;&#x98FE;&#x7CFB;&#x3092;&#x8907;&#x88FD;&#x3057;&#x3001;&#x305D;&#x308C;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x3068; DNA &#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x306E;&#x4E21;&#x65B9;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x5358;&#x4E00;&#x306E;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306E;&#x69CB;&#x6210;&#x3092;&#x767A;&#x898B;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x86CB;&#x767D;&#x8CEA;&#x306F;&#x30A2;&#x30DF;&#x30CE; &#x30BF;&#x30FC;&#x30DF;&#x30CA;&#x30EB; &#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3001;&#x4E2D;&#x592E;&#x306E; DNA &#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC; &#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3; C &#x30BF;&#x30FC;&#x30DF;&#x30CA;&#x30EB; DNA &#x8A8D;&#x8B58;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3;&#x3092;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC; 1 &#x3064;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x3067; 2 &#x3064;&#x306E; DNA &#x306E;&#x7E4A;&#x7DAD;&#x306F;&#x3001;&#x540C;&#x6642;&#x306B;&#x3001;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x5207;&#x65AD;&#x3092;&#x9054;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x76F8;&#x4E92;&#x306B;&#x4F5C;&#x7528;&#x3059;&#x308B; 2 &#x3064;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306B;&#x30D0;&#x30A4;&#x30F3;&#x30C9;&#x3092;&#x30AB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x80F8;&#x306E;&#x8C37;&#x9593;&#x306B;&#x672A;&#x5909;&#x66F4;&#x306E; dna &#x306E;&#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x8EE2;&#x9001;&#x3088;&#x308A;&#x6025;&#x901F;&#x306B;&#x767A;&#x751F;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30B3;&#x30ED;&#x30CB;&#x30FC; &#x30A2;&#x30C7;&#x30CB;&#x30F3; &#x30C8;&#x30C3;&#x30D7; &#x30B9;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C9;&#x3001;5 &#39;-TCCRAC - 3&#39; &#x3067;&#x306E;&#x307F;&#x3092;&#x5909;&#x66F4;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30B3;&#x30ED;&#x30CB;&#x30FC; &#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x6D3B;&#x6027;&#x306F;&#x3053;&#x306E;&#x30C8;&#x30C3;&#x30D7; &#x30B9;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C9; &#x30A2;&#x30C7;&#x30CB;&#x30F3; &#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x5316;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x30D6;&#x30ED;&#x30C3;&#x30AF;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3057;&#x3001;5 &#39;-GTYGGA - 3&#39; &#x306E;&#x88DC;&#x8DB3;&#x306E;&#x7E4A;&#x7DAD;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B;&#x30A2;&#x30C7;&#x30CB;&#x30F3;&#x306E;&#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x5316;&#x306E;&#x5F71;&#x97FF;&#x3092;&#x53D7;&#x3051;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;&#x65E2;&#x5831;&#x306E; R M IIG &#x578B;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306B;&#x5FC5;&#x8981;&#x3067;&#x3042;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x3001;&#x30B3;&#x30ED;&#x30CB;&#x30FC;&#x306E; R M &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x306B;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x3089;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x8FFD;&#x52A0;&#x306E; DNA &#x4FEE;&#x98FE;&#x306F;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x305B;&#x3093;&#x3002;&#x30B3;&#x30ED;&#x30CB;&#x30FC; R M &#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x5909;&#x66F4;&#x306F; 2 &#x3064;&#x306E; DNA &#x306E;&#x7E4A;&#x7DAD;&#x306E; 1 &#x3064;&#x3067;&#x306E;&#x307F;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8;&#x4FDD;&#x8B77;&#x306E;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30B3;&#x30ED;&#x30CB;&#x30FC;&#x306E;&#x30A2;&#x30FC;&#x30AD;&#x30C6;&#x30AF;&#x30C1;&#x30E3;&#x306F;&#x3001;&#x524D;&#x8A18;&#x5358;&#x4E00; DNA &#x8A8D;&#x8B58;&#x30C9;&#x30E1;&#x30A4;&#x30F3; &#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x3068; DNA &#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30D5;&#x30A7;&#x30E9;&#x30FC;&#x30BC;&#x306E;&#x6D3B;&#x52D5;&#x76EE;&#x6A19;&#x306E;&#x5236;&#x9650;&#x4FEE;&#x98FE;&#x7CFB;&#x3092;&#x7D44;&#x307F;&#x7ACB;&#x3066;&#x308B;&#x306B;&#x306F;&#x6700;&#x5C0F;&#x9650;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3092;&#x8868;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30B3;&#x30ED;&#x30CB;&#x30FC;: &#x306E;&#x307F;&#x30DB;&#x30B9;&#x30C8;&#x4FDD;&#x8B77;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E; 1 &#x3064;&#x306E; DNA &#x9396;&#x3092;&#x5909;&#x66F4;&#x6700;&#x5C0F;&#x9650; II &#x578B;&#x5236;&#x9650;&#x4FEE;&#x98FE;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3002;

Mmei&#xB294; &#xD2B9;&#xC774; &#xD55C; &#xD0C0;&#xC785; II &#xC81C;&#xD55C; &#xD6A8;&#xC18C; &#xAE34; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xD0DC;&#xADF8;&#xB97C; &#xC0DD;&#xC131; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xC720;&#xC6A9; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; MmeI &#xC81C;&#xD55C; &#xC218;&#xC815; (R-M) &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC744; &#xBCF5;&#xC81C; &#xD558; &#xACE0; endonuclease &#xBC0F; DNA methyltransferase &#xD65C;&#xB3D9; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xB2E8;&#xC77C; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;&#xC73C;&#xB85C; &#xC774;&#xB8E8;&#xC5B4;&#xC838; &#xADF8;&#xAC83;&#xC744; &#xBC1C;&#xACAC;. &#xC544;&#xBBF8;&#xB178; &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; endonuclease &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;, &#xC911;&#xC559; DNA methyltransferase &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; &#xBC0F; C &#xD130;&#xBBF8;&#xB110; DNA &#xC778;&#xC2DD; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778;&#xC744; &#xAD6C;&#xC131; &#xD558;&#xB294; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;. Endonuclease &#xB9E4;&#xCD98;&#xBD80;&#xB97C; &#xB2EC;&#xC131; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD574; &#xC0C1;&#xD638; &#xC791;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xB450; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0; &#xBC14;&#xC778;&#xB529;&#xB41C; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC640; &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC5D0;, &#xD55C; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; DNA &#xAC00;&#xB2E5;&#xC744; &#xC798;&#xB77C;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC720; &#xBC29; &#xC0AC;&#xC774;&#xC758; &#xACE8;&#xC9DC;&#xAE30;&#xC5D0; &#xC218;&#xC815; &#xB418;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC740; DNA&#xC5D0; &#xBA54; &#xD2F8; &#xC804;&#xC1A1; &#xC18D;&#xB3C4; &#xBCF4;&#xB2E4; &#xB354; &#xBE60;&#xB978; &#xC18D;&#xB3C4;&#xB85C; &#xBC1C;&#xC0DD;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. MmeI &#xC218;&#xC815;&#xB9CC; &#xAC00;&#xAE30; &#xAC00;&#xB2E5;&#xC5D0; &#xC544;&#xB370;&#xB2CC; 5&#39;-TCCRAC-3&#39;. MmeI endonuclease &#xD65C;&#xB3D9;&#xC774; &#xCD5C;&#xACE0; &#xAC00;&#xB2E5; &#xC544;&#xB370;&#xB2CC; &#xBA54; &#xD2F8; &#xD654;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xCC28;&#xB2E8; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBC0F; &#xBCF4;&#xC644; &#xAC00;&#xB2E5;&#xC5D0; &#xC544;&#xB370;&#xB2CC;&#xC758; &#xBA54; &#xD2F8; &#xD654;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC601;&#xD5A5;&#xC744; &#xBC1B;&#xC9C0; &#xC54A;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; 5&#39;-GTYGGA-3&#39;. &#xC774;&#xC804;&#xC5D0; &#xD2B9;&#xC9D5;&#xC774; &#xC720;&#xD615; IIG R M &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC5D0; &#xD544;&#xC694;&#xD55C; MmeI R M &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC640; &#xAD00;&#xB828; &#xB41C; &#xCD94;&#xAC00; DNA &#xC218;&#xC815;&#xC774;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; MmeI R M &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xBCF4;&#xD638;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC218;&#xC815;&#xB9CC; &#xD55C; &#xB450; &#xAC1C;&#xC758; DNA &#xAC00;&#xB2E5;&#xC5D0; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. MmeI &#xC544;&#xD0A4;&#xD14D;&#xCC98; &#xC870;&#xB9BD; &#xB2E8;&#xC77C; DNA &#xC778;&#xC2DD; &#xB3C4;&#xBA54;&#xC778; endonuclease &#xBC0F; DNA methyltransferase &#xD65C;&#xB3D9;&#xC744; &#xC5B4;&#xB5A4; &#xC810;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xC81C;&#xD55C; &#xC218;&#xC815; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC744; &#xCD5C;&#xC18C;&#xD55C;&#xC758; &#xC811;&#xADFC; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC744; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

MmeI: &#xCD5C;&#xC18C;&#xD55C;&#xC758; &#xC720;&#xD615; II &#xC81C;&#xD55C; &#xC218;&#xC815; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC744; &#xD638;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xBCF4;&#xD638; &#xD55C; DNA &#xAC00;&#xB2E5; &#xC218;&#xC815;.

MmeI es una enzima de restricci&oacute;n de tipo II inusual que es &uacute;til para generar etiquetas de larga secuencia. Hemos clonado el sistema de restricci&oacute;n-modificaci&oacute;n (R-M) de MmeI y que consisten en una sola prote&iacute;na endonucleasa y actividades metiltransferasa de ADN. La prote&iacute;na compone de un dominio amino-terminal endonucleasa, central dominio metiltransferasa de ADN y dominio de reconocimiento de ADN c-terminal. La endonucleasa corta los dos filamentos de la DNA en un sitio al mismo tiempo, con limitados en dos sitios de interacci&oacute;n para lograr la escisi&oacute;n de la enzima. Escote se produce m&aacute;s r&aacute;pidamente que la transferencia de metilo en la DNA no modificado. MmeI modifica s&oacute;lo la adenina en el filamento superior, 5&#39;-TCCRAC-3&#39;. MmeI actividad de endonucleasa est&aacute; bloqueada por esta metilaci&oacute;n de adenina del filamento superior y se ve afectada por la metilaci&oacute;n de la adenina en el filamento complementario, 5&#39;-GTYGGA-3&#39;. No hay ninguna modificaci&oacute;n adicional de ADN asociada al sistema de MmeI R-M, como se requiere para los sistemas de tipo IIG R-M previamente caracterizados. As&iacute;, el sistema de MmeI R-M utiliza modificaci&oacute;n en s&oacute;lo uno de los dos filamentos de la DNA para protecci&oacute;n de host. La arquitectura de MmeI representa un enfoque m&iacute;nimo para montar un sistema de restricci&oacute;n-modificaci&oacute;n en donde un solo dominio de reconocimiento de ADN dirige la endonucleasa y actividades metiltransferasa de ADN.

MmeI: un tipo II restricci&oacute;n-modificaci&oacute;n sistema m&iacute;nimo que s&oacute;lo modifica un filamento de la DNA para protecci&oacute;n de host.

MspJI &#xC218;&#xC815; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACE0;&#xC815; &#xB41C; &#xAC70;&#xB9AC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xACE0;&#xB300;&#xC758; &#xC18C;&#xC124; &#xC218;&#xC815; &#xC885;&#xC18D; &#xC81C;&#xD55C; endonuclease&#xB294; &#xC774;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xC5EC;&#xB7EC; MspJI homologs, FspEI, LpnPI, AspBHI, RlaI, &#xBC0F; SgrTI &#xB4F1;&#xC758; &#xC0DD; &#xD654; &#xD559;&#xC801; &#xD2B9;&#xC131; &#xC81C;&#xC2DC;. &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; &#xBAA8;&#xB4E0; &#xAD6C;&#xCCB4;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; DNA&#xC5D0; &#xC2DC; C5 &#xC218;&#xC815; (&#xBA54; &#xD2F8; &#xD654; &#xB610;&#xB294; hydroxymethylation)&#xC744; &#xC778;&#xC2DD; &#xD558; &#xACE0; &#xC77C;&#xC815; &#xAC70;&#xB9AC; (&#xC218;&#xC815;&#xB41C; &#xC2DC; &#xBA40;&#xB9AC; N(12)/N(16))&#xC5D0; &#xCABC;&#xAC1C; &#xB2E4;. &#xAC01; &#xD45C;&#xC2DC; &#xC218;&#xC815;&#xB41C; &#xC2DC; &#xCE21;&#xBA74;&#xC758; &#xB2E4;&#xB978; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC;&#xB97C; &#xC560; &#xC6A9; &#xC790;&#xCCB4; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xCEE8;&#xD14D;&#xC2A4;&#xD2B8; &#xAE30;&#xBCF8; &#xC124;&#xC815;&#xC774; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC644;&#xBCBD; &#xD558; &#xAC8C; &#xC218;&#xC815;&#xB41C; CpG &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xC758; &#xC591;&#xCABD;&#xC5D0; &#xACE0;&#xCC29; &#xD558; &#xC5EC; &#xC218;&#xC815;&#xB41C; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8; &#xC8FC;&#xC704; 32 &#xBCA0;&#xC774;&#xC2A4; &#xAE34; &#xC870;&#xAC01; &#xCD94;&#xCD9C; genomic DNA&#xC5D0;&#xC11C; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xD6A8;&#xC18C;&#xB294; epigenome&#xC758; &#xC9C1;&#xC811; &#xC2EC;&#xBB38;&#xC744; &#xC704;&#xD574; &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC608;&#xB97C; &#xB4E4;&#xC5B4;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; RlaI, &#xD558;&#xC9C0; (m) CpG &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;, &#xD558;&#xC9C0;&#xB9CC; &#xC120;&#xD638; &#xD558;&#xB294; (m) CWG &#xD6A8;&#xC18C; &#xC2DD;&#xBB3C;&#xACFC; &#xD3EC;&#xC720;&#xB958; &#xAC8C;&#xB188; DNA, &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; epigenomic &#xD328;&#xD134;&#xC758; &#xCC28;&#xC774; &#xAC15;&#xC870; &#xC0AC;&#xC774; &#xB2E4;&#xB978; &#xC18C;&#xD654; &#xD328;&#xD134;&#xC744; &#xC0DD;&#xC131;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC774;&#xB7EC;&#xD55C; &#xD6A8;&#xC18C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0DD;&#xC131; &#xB41C; &#xC18C;&#xD654; DNA &#xD30C;&#xD3B8;&#xC758; &#xAE4A;&#xC740; &#xC5F0;&#xC18D; &#xAC8C;&#xB188;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC218;&#xC815;&#xB41C; &#xB41C; &#xC0AC;&#xC774;&#xD2B8;&#xB97C; &#xB9E4;&#xD551;&#xD560; &#xC2E4;&#xD604; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC81C;&#xACF5; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC544;&#xC608;, &#xD6A8;&#xC18C;&#xC758; MspJI &#xAC00;&#xC871; DNA epigenetic &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBC29;&#xBC95; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xB9E4;&#xB825;&#xC801;&#xC778; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xB97C; &#xB098;&#xD0C0;&#xB0C5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Epigenetic &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC218;&#xC815; &#xC885;&#xC18D; &#xC81C;&#xD55C; endonucleases MspJI &#xC81C;&#xD488;&#xAD70;.

MspJI &#x662F;&#x65B0;&#x578B;&#x6539;&#x6027;&#x4F9D;&#x8D56;&#x9650;&#x5236;&#x6027;&#x5185;&#x5207;&#x9176;&#x5728;&#x4FEE;&#x6539;&#x7F51;&#x7AD9;&#x7684;&#x56FA;&#x5B9A;&#x8DDD;&#x79BB;&#x539F;&#x5219;&#x6027;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x76EE;&#x524D;&#x751F;&#x5316;&#x7279;&#x6027;&#x7684;&#x51E0;&#x4E2A; MspJI &#x540C;&#x6E90;&#xFF0C;&#x5305;&#x62EC; FspEI&#x3001; LpnPI&#x3001; AspBHI&#x3001; RlaI&#x3001; SgrTI&#x3002;&#x6240;&#x6709;&#x7684;&#x9176;&#x4E13;&#x95E8;&#x5728; DNA &#x4E2D;&#x627F;&#x8BA4;&#x80DE;&#x5627;&#x5576; C5 &#x6539;&#x6027; (&#x7532;&#x57FA;&#x5316;&#x6216;&#x7F9F;&#x7532;&#x57FA;&#x5316;&#xFF09; &#x4E91;&#x5E06;&#x6D4E;&#x5728;&#x56FA;&#x5B9A;&#x7684;&#x8DDD;&#x79BB; (N(12)/N(16)) &#x4ECE;&#x6539;&#x6027;&#x80DE;&#x5627;&#x5576;&#x3002;&#x6BCF;&#x4E2A;&#x663E;&#x793A;&#x5176;&#x81EA;&#x8EAB;&#x5E8F;&#x5217;&#x4E0A;&#x4E0B;&#x6587;&#x9996;&#x9009;&#x9879;&#xFF0C;&#x503E;&#x5411;&#x4E8E;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x4FA7;&#x7FFC;&#x6539;&#x6027;&#x80DE;&#x5627;&#x5576;&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x53CC;&#x65B9;&#x5B8C;&#x5168;&#x4FEE;&#x6539;&#x4E2D;&#x592E;&#x4EBA;&#x6C11;&#x653F;&#x5E9C;&#x7F51;&#x7AD9;&#x5288;&#x5F00;&#xFF0C;&#x4ED6;&#x4EEC;&#x5141;&#x8BB8; 32 &#x57FA;&#x5730;&#x957F;&#x7247;&#x6BB5;&#x4E2D;&#x7684;&#x63D0;&#x53D6;&#x5468;&#x56F4;&#x7684;&#x4FEE;&#x6539;&#x540E;&#x7684;&#x7F51;&#x7AD9;&#x4ECE;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4; DNA&#x3002;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x9176;&#x7684;&#x8868;&#x89C2;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x76F4;&#x63A5;&#x5BA1;&#x8BAF;&#x63D0;&#x4F9B;&#x529F;&#x80FD;&#x5F3A;&#x5927;&#x7684;&#x5DE5;&#x5177;&#x3002;&#x4F8B;&#x5982;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x663E;&#x793A; RlaI&#xFF0C;&#x4F46;&#x4E0D;&#x662F; (m) &#x4E2D;&#x592E;&#x4EBA;&#x6C11;&#x653F;&#x5E9C;&#x7F51;&#x7AD9;&#x9996;&#x9009; (m) CWG &#x7684;&#x9176;&#x751F;&#x6210;&#x4E4B;&#x95F4;&#x690D;&#x7269;&#x548C;&#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4; DNA&#xFF0C;&#x7A81;&#x51FA;&#x5176; epigenomic &#x6A21;&#x5F0F;&#x4E4B;&#x95F4;&#x7684;&#x533A;&#x522B;&#x4E0D;&#x540C;&#x7684;&#x6D88;&#x5316;&#x6A21;&#x5F0F;&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x8868;&#x73B0;&#x51FA;&#x6DF1;&#x6D4B;&#x5E8F;&#x751F;&#x6210;&#x4ECE;&#x8FD9;&#x4E9B;&#x9176;&#x6D88;&#x5316; DNA &#x7247;&#x6BB5;&#x63D0;&#x4F9B;&#x53EF;&#x884C;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x6765;&#x6620;&#x5C04;&#x5728;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x4E2D;&#x7684;&#x4FEE;&#x6539;&#x7684;&#x7AD9;&#x70B9;&#x3002;&#x603B;&#x5171;&#x6709;&#x9176; MspJI &#x5BB6;&#x5EAD;&#x4EE3;&#x8868;&#x5438;&#x5F15;&#x529B;&#x5DE5;&#x5177;&#x7684; DNA &#x8868;&#x89C2;&#x9057;&#x4F20;&#x5B66;&#x7814;&#x7A76;&#x65B9;&#x6CD5;&#x53D1;&#x5C55;&#x7684;&#x9009;&#x62E9;&#x3002;

&#x8868;&#x89C2;&#x9057;&#x4F20;&#x5B66;&#x7814;&#x7A76;&#x4FEE;&#x6539;&#x76F8;&#x5173;&#x9650;&#x5236;&#x6027;&#x5185;&#x5207;&#x9176; MspJI &#x5BB6;&#x5EAD;&#x3002;

MspJI is a novel modification-dependent restriction endonuclease that cleaves at a fixed distance away from the modification site. Here, we present the biochemical characterization of several MspJI homologs, including FspEI, LpnPI, AspBHI, RlaI, and SgrTI. All of the enzymes specifically recognize cytosine C5 modification (methylation or hydroxymethylation) in DNA and cleave at a constant distance (N(12)/N(16)) away from the modified cytosine. Each displays its own sequence context preference, favoring different nucleotides flanking the modified cytosine. By cleaving on both sides of fully modified CpG sites, they allow the extraction of 32-base long fragments around the modified sites from the genomic DNA. These enzymes provide powerful tools for direct interrogation of the epigenome. For example, we show that RlaI, an enzyme that prefers (m)CWG but not (m)CpG sites, generates digestion patterns that differ between plant and mammalian genomic DNA, highlighting the difference between their epigenomic patterns. In addition, we demonstrate that deep sequencing of the digested DNA fragments generated from these enzymes provides a feasible method to map the modified sites in the genome. Altogether, the MspJI family of enzymes represent appealing tools of choice for method development in DNA epigenetic studies.

The MspJI family of modification-dependent restriction endonucleases for epigenetic studies.

MspJI est une endonucl&eacute;ase de restriction de modification d&eacute;pendant roman qui s&#39;attache &agrave; une distance fixe du site de la modification. Nous pr&eacute;sentons ici la caract&eacute;risation biochimique de plusieurs MspJI homologues, y compris FspEI, LpnPI, AspBHI, RlaI et SgrTI. Toutes les enzymes sp&eacute;cifiquement reconnaissent modification C5 de cytosine (m&eacute;thylation ou hydroxymethylation) dans l&#39;ADN et s&#39;attacher &agrave; une distance constante (N(12)/N(16)) loin de la cytosine modifi&eacute;e. Chacun affiche sa propre pr&eacute;f&eacute;rence de contexte s&eacute;quence, favorisant les diff&eacute;rents nucl&eacute;otides flanquant la cytosine modifi&eacute;e. Par clivage des deux c&ocirc;t&eacute;s des sites de CpG enti&egrave;rement modifi&eacute;s, ils permettent l&#39;extraction de fragments longs 32-base autour des sites mis &agrave; jour le de l&#39;ADN g&eacute;nomique. Ces enzymes fournissent des outils puissants pour l&#39;interrogation directe de l&#39;&eacute;pig&eacute;nome. Par exemple, nous montrons que RlaI, une enzyme qui pr&eacute;f&egrave;re (m) GTC mais pas les sites de CpG (m), g&eacute;n&egrave;re des patrons de digestion qui diff&egrave;rent entre la plante et l&#39;ADN g&eacute;nomique chez les mammif&egrave;res, en soulignant la diff&eacute;rence entre leurs patrons &eacute;pig&eacute;nomique. En outre, nous d&eacute;montrons que profond de s&eacute;quen&ccedil;age de fragments d&#39;ADN dig&eacute;r&eacute;s produit de ces enzymes fournit une m&eacute;thode possible pour cartographier les sites mis &agrave; jour le dans le g&eacute;nome. Au total, la famille MspJI d&#39;enzymes repr&eacute;sente des outils attrayants de choix pour le d&eacute;veloppement de m&eacute;thode en &eacute;tudes &eacute;pig&eacute;n&eacute;tiques de l&#39;ADN.

La famille MspJI des endonucl&eacute;ases de restriction de modification d&eacute;pendant d&#39;&eacute;tudes &eacute;pig&eacute;n&eacute;tiques.

MspJI ist eine neuartige &Auml;nderung-abh&auml;ngige Beschr&auml;nkung Endonuclease, die in einem festen Abstand vom Standort &Auml;nderung spaltet. Hier pr&auml;sentieren wir die biochemische Charakterisierung der verschiedenen MspJI UCP1, einschlie&szlig;lich FspEI, LpnPI, AspBHI, RlaI und SgrTI. Alle Enzyme spezifisch Cytosin C5 &Auml;nderung (Methylierung oder Hydroxymethylation) in der DNA zu erkennen und cleave in einem konstanten Abstand (N(12)/N(16)) Weg von der ver&auml;nderten Cytosin. Jede zeigt eine eigene Sequenz Kontext Pr&auml;ferenz, Bevorzugung verschiedener Nukleotide Flankenangriff der modifizierten Cytosin. Durch Splei&szlig;en auf beiden Seiten v&ouml;llig ver&auml;nderten CpG-Sites, erm&ouml;glichen sie die Extraktion von 32-Base lange Fragmente um die ge&auml;nderten Seiten von genomic DNA. Diese Enzyme versehen leistungsf&auml;hige Werkzeuge f&uuml;r direkte Befragung des die Epigenome. Zum Beispiel zeigen wir, dass RlaI, ein Enzym, das aber nicht die CpG Websites (m), (m) CWG bevorzugt Verdauung Muster, die Unterschiede zwischen Pflanzen und S&auml;ugetieren genomischer DNA erzeugt, Hervorhebung des Unterschied zwischen ihrer epigenomischen-Muster. Dar&uuml;ber hinaus zeigen wir, dass Ultratiefe Sequenzierung der verdauten DNA-Fragmente, die aus dieser Enzyme erzeugt eine machbare-Methode, um die ge&auml;nderten Seiten im Genom Karte bietet. Insgesamt repr&auml;sentieren die MspJI Familie der Enzyme ansprechend Werkzeuge der Wahl f&uuml;r die Methodenentwicklung in DNA epigenetische Studien.

Die MspJI Familie der &Auml;nderung-abh&auml;ngige Beschr&auml;nkung Endonucleases f&uuml;r epigenetische Studien.

MspJI &egrave; una romanzo endonucleasi di restrizione modifica-dipendente che fende a una distanza fissa lontano dal sito di modificazione. Qui, vi presentiamo la caratterizzazione biochimica dei diversi omologhi MspJI, compresi FspEI, LpnPI, AspBHI, RlaI e SgrTI. Tutti gli enzimi specificamente riconoscere modifica di citosina C5 (metilazione o hydroxymethylation) in DNA e fendere a distanza costante (N(12)/N(16)) lontano dalla citosina modificato. Ciascuno consente di visualizzare la propria preferenza contesto di sequenza, favorendo diversi nucleotidi fiancheggianti la citosina modificato. Da fendendo su entrambi i lati dei siti CpG completamente modificati, permettono l&#39;estrazione dei frammenti lunghi 32-base intorno ai siti modificati da DNA genomic. Questi enzimi forniscono potenti strumenti per l&#39;interrogazione diretta dell&#39;Epigenoma. Per esempio, mostriamo che RlaI, un enzima che preferisce (m) CWG ma non luoghi di CpG (m), genera schemi di digestione che differiscono tra pianta e DNA genomic mammifero, evidenziando la differenza tra i modelli di epigenomic. Inoltre, dimostriamo che deep sequencing dei frammenti del DNA digeriti generati da questi enzimi fornisce un metodo fattibile per mappare i siti modificati nel genoma. Complessivamente, la famiglia MspJI di enzimi rappresenta interessanti strumenti di scelta per lo sviluppo del metodo negli studi di epigenetici del DNA.

La famiglia MspJI di endonucleasi modifica-dipendente per studi epigenetici.

MspJI &#x5909;&#x66F4;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x56FA;&#x5B9A;&#x8DDD;&#x96E2;&#x3067;&#x5207;&#x65AD;&#x3059;&#x308B;&#x3001;&#x65B0;&#x898F;&#x5909;&#x66F4;&#x4F9D;&#x5B58;&#x5236;&#x9650;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC;&#x3067;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;FspEI&#x3001;LpnPI&#x3001;AspBHI&#x3001;RlaI&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073; SgrTI &#x3092;&#x542B;&#x3080;&#x3044;&#x304F;&#x3064;&#x304B;&#x306E; MspJI &#x540C;&#x65CF;&#x4F53;&#x306E;&#x751F;&#x5316;&#x5B66;&#x7684;&#x7279;&#x6027;&#x3092;&#x63D0;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x3059;&#x3079;&#x3066;&#x5177;&#x4F53;&#x7684;&#x306B; DNA &#x306E;&#x30B7;&#x30C8;&#x30B7;&#x30F3;&#x306E; C5 &#x306E;&#x6539;&#x8CEA; (&#x30E1;&#x30C1;&#x30EB;&#x5316;&#x307E;&#x305F;&#x306F; hydroxymethylation) &#x3092;&#x8A8D;&#x8B58;&#x3057;&#x3001;&#x30AF;&#x30EA;&#x30FC;&#x30D6;&#x4E00;&#x5B9A;&#x8DDD;&#x96E2; (&#x5909;&#x66F4;&#x30B7;&#x30C8;&#x30B7;&#x30F3;&#x304B;&#x3089; N(12)/N(16))&#x3002;&#x5404;&#x5909;&#x66F4;&#x30B7;&#x30C8;&#x30B7;&#x30F3;&#x306B;&#x4E26;&#x3076;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x3092;&#x512A;&#x9047;&#x72EC;&#x81EA;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9; &#x30B3;&#x30F3;&#x30C6;&#x30AD;&#x30B9;&#x30C8;&#x306E;&#x30D7;&#x30EA;&#x30D5;&#x30A1;&#x30EC;&#x30F3;&#x30B9;&#x3092;&#x8868;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5B8C;&#x5168;&#x4FEE;&#x6B63; CpG &#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306E;&#x4E21;&#x5074;&#x3092;&#x5272;&#x65AD;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x5F7C;&#x3089;&#x306F; 32 &#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x306E;&#x9577;&#x3044;&#x30D5;&#x30E9;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;&#x62BD;&#x51FA;&#x5468;&#x308A;&#x5909;&#x66F4;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8; genomic DNA &#x304B;&#x3089;&#x8A31;&#x53EF;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x306E;&#x30A8;&#x30D4;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x76F4;&#x63A5;&#x5C0B;&#x554F;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x5F37;&#x529B;&#x306A;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x305F;&#x3068;&#x3048;&#x3070;&#x3001;RlaI (m) CWG &#xFF08;m&#xFF09; CpG &#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x304C;&#x306A;&#x3044;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x597D;&#x3080;&#x9175;&#x7D20;&#x304C;&#x690D;&#x7269;&#x3068;&#x305D;&#x306E; epigenomic &#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x306E;&#x9055;&#x3044;&#x3092;&#x5F37;&#x8ABF;&#x3059;&#x308B;&#x54FA;&#x4E73;&#x985E;&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0; DNA &#x306E;&#x9593;&#x3068;&#x306F;&#x7570;&#x306A;&#x308B;&#x6D88;&#x5316;&#x30D1;&#x30BF;&#x30FC;&#x30F3;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x304B;&#x3089;&#x3053;&#x308C;&#x3089;&#x306E;&#x9175;&#x7D20;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x6D88;&#x5316;&#x306E; DNA &#x306E;&#x30D5;&#x30E9;&#x30B0;&#x30E1;&#x30F3;&#x30C8;&#x306E;&#x30C7;&#x30A3;&#x30FC;&#x30D7; &#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x306E;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x4FEE;&#x6B63;&#x306E;&#x30B5;&#x30A4;&#x30C8;&#x306B;&#x30DE;&#x30C3;&#x30D7;&#x3059;&#x308B;&#x53EF;&#x80FD;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3059;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x5B8C;&#x5168;&#x306B;&#x3001;&#x9175;&#x7D20;&#x306E; MspJI &#x5BB6;&#x65CF;&#x6CD5;&#x958B;&#x767A; DNA &#x30A8;&#x30D4;&#x30B8;&#x30A7;&#x30CD;&#x30C6;&#x30A3;&#x30AF;&#x30B9;&#x7814;&#x7A76;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x306E;&#x9B45;&#x529B;&#x7684;&#x306A;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3092;&#x8868;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x5909;&#x66F4;&#x4F9D;&#x5B58;&#x5236;&#x9650;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30A2;&#x30FC;&#x30BC; &#x30A8;&#x30D4;&#x30B8;&#x30A7;&#x30CD;&#x30C6;&#x30A3;&#x30AF;&#x30B9;&#x7814;&#x7A76;&#x306E; MspJI &#x30D5;&#x30A1;&#x30DF;&#x30EA;&#x3002;

MspJI es una endonucleasa de restricci&oacute;n novela dependiente de modificaci&oacute;n que hiende a una distancia fija del recinto de modificaci&oacute;n. Aqu&iacute;, presentamos la caracterizaci&oacute;n bioqu&iacute;mica de varios hom&oacute;logos MspJI, incluyendo FspEI, LpnPI, AspBHI, RlaI y SgrTI. Todas las enzimas espec&iacute;ficamente reconocen modificaci&oacute;n de C5 de citosina (metilaci&oacute;n o hydroxymethylation) en el ADN y unirse a una distancia constante (N(12)/N(16)) de la citosina modificada. Cada uno muestra su propia preferencia de contexto de secuencia, favoreciendo diferentes nucle&oacute;tidos que flanqueaban la citosina modificada. Por unirse a ambos lados de sitios totalmente modificados de CpG, permiten la extracci&oacute;n de fragmentos largos 32-base alrededor de los sitios modificados del ADN gen&oacute;mico. Estas enzimas proporcionan herramientas poderosas para el interrogatorio directo del epigenoma. Por ejemplo, mostramos que RlaI, una enzima que prefiere (m) CWG pero no los sitios CpG (m), genera patrones de digesti&oacute;n que difieren entre la planta y el ADN gen&oacute;mico mam&iacute;fero, destacando la diferencia entre sus patrones epigen&oacute;mica. Adem&aacute;s, demostramos que profundo secuenciaci&oacute;n de los fragmentos de ADN digeridos generados a partir de estas enzimas proporciona un m&eacute;todo viable para asignar los sitios modificados en el genoma. En conjunto, la familia MspJI de enzimas representa atractivas herramientas de elecci&oacute;n para el desarrollo del m&eacute;todo en estudios epigen&eacute;ticos de la DNA.

Theodore Davis

Applications and Product Development

New England BioLabs

High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

Theodore Davis

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High Sensitivity 5-hydroxymethylcytosine Detection in Balb/C Brain Tissue

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