果蝇幼虫NMJ夹层

摘要

此协议示范如何解剖果蝇幼虫免疫组织化学和/或神经肌肉接头处的成像的准备。

摘要

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研究方案

在您开始之前

1. 所有的文化应该是生长在25 ° C
2. HL3.1清扫缓冲区可能提前做好准备。以50毫升的HL3.1等份，并保持它在冰上。
3. 准备在HL3.1 15毫升新鲜的3.5％的甲醛。保持它在冰上。

幼虫解剖

1. 放一个寒冷HL3.1的夹层板的下降。这将保持干燥和眩晕的动物，使其更容易与动物。
2. 用长镊子 ，选择一个流浪的第三龄幼虫和HL3.1下降。
3. 首先，使用短钳把握minutien针 。放置后气孔之间的引脚。动物通常会试图抓取从引脚本身拉伸，使它更容易为您放置在头口附近挂钩的幼虫的一个引脚正视。纵向伸展的动物。这将有助于您最大限度地就可以实现在切割过程中暴露的体壁量。注：如果您选择引脚头，动物可能会引脚环绕其身，或使其难以引脚，它的身体上来回鞭。通常你可以反删除HL3.1，并再次把一个新鲜的冷下降惊人的动物。灵巧的科学家也可以只抓动物和举行到位。
4. 使用弹簧剪刀水平切口，只是前幼虫背侧后针。切口放入一个刀片剪刀，沿背中线对幼虫的喙的垂直切割。在动物的讲台，使针左侧和右侧横切口。注：完成的结果看起来应该像对我幼虫背侧沿rostrocaudal轴。
5. 取出的器官。开始把一些额外的下降HL3.1幼虫。这将使机关浮出来的身体，让你更容易将其删除。首先，取出气管系统。二，使用镊子抢其余的器官，并删除它们。
6. 在第3步，左瓣体壁和右瓣。引脚以顺时针为了确保横向和纵向拉伸体壁的襟翼。

固定

修正在3.5％甲醛25分钟在HL3.1，每个动物。洗两次HL3.1动物为5分​​钟。

存储

删除引脚和幼虫转移到1.5 ml管中含有1 × PBS。如果您计划NMJ使用融合荧光标记的图像，你应该在两天内的动物形象。您可能会存储一个星期的解剖幼虫在4 ° C

代表性的成果

有几个关键组件的正确解剖果蝇幼虫。首先，必须格外小心，不损伤肌肉，特别是肌肉4，6，和7。这些是最​​流行的肌肉研究，如果它们已损坏丢弃圆角的准备和解剖其他动物。其次，必须确保该动物是最大限度地伸展，使每一块肌肉和NMJ可以区分。

讨论

在此视频中演示的剥离技术可用于准备各种实验技术的果蝇幼虫。如果荧光蛋白标记，幼虫可安装和成像立即。否则，免疫，可为了纪念特定的突触车厢。此外，电可以轻松地进行解剖幼虫，以评估神经递质的运作。

果蝇 NMJ年初以来，照亮它的基本结构和功能的研究已取得大受欢迎^。1-4许多对果蝇NMJ的发展的研究中已确定的分子^在脊椎?...

材料