人CD40激活的B细胞的生成

摘要

在这个视频中，我们目前的体外的产生和扩大人CD40激活的B细胞（CD40 - B）从外周血单个核细胞（PBMC）的刺激与CD40配体和IL - 4。

摘要

CD40激活的B细胞（CD40 - B细胞）已被确定为肿瘤免疫治疗的免疫刺激抗原提呈细胞^（APC）1-3的替代来源。树突状细胞（DCs），最好的APC，CD40 - B细胞有几个不同的生物和技术性能相比。与区议会，B细胞的MHC和共刺激分子（图1b）的表达增加，表现出强烈的的迁徙能力和目前的T细胞抗原提呈效率，刺激白细胞介素4和CD40配体（CD40L）。然而，在不成熟或成熟的DCS相比，CD40 - B细胞表达完整的淋巴结归巢CD62L，CCR7/CXCR4组成的黑社会，和白细胞功能抗原-1（LFA1，CD11a/CD18），归巢到次级淋巴器官所必需的（图^1a）3。 CD40 - B细胞可以产生而没有从非常小，它可以进一步扩大在体外大量高纯度CD40的B细胞^（> 10 9细胞每名患者）从健康的捐赠者以及癌症金额外周血困难患者（图1c，d）项^1,4。

在这个协议中，我们演示了如何获取充分激活的人PBMC CD40 - B从细胞。细胞培养的关键分子CD40配体，白细胞介素4（IL - 4）和环孢素A（CsA），这是在3-4天养殖周期的补充。 CD40的刺激对于实验室的目的是提供NIH/3T3细胞表达重组人CD40配体（tCD40L ^{NIH/3T3）5。}为了避免污染与非转染的细胞，表达人CD40配体的转染，定期进行检查（图）。

CD40 - B细胞培养，经过14天，包括95％以上的纯B细胞和CD40 - B细胞超过65天的扩张是没有^任何损失的^{功能：1，4}经常可能。 CD40 - B细胞的有效占用，过程和目前T细胞抗原^6。他们不只有总理naϊve，而且还扩大记忆性T细胞^7,8。 CD40激活的B细胞可用于研究B细胞的活化，分化和功能。此外，他们代表一个有前途的治疗或预防接种抗肿瘤⁹工具。

研究方案

PBMC的人CD40激活的B细胞产生的协议分为两部分：A部分演示NIH/3T3细胞，将用于板约束的饲养层细胞表达CD40配体的准备。 B部分介绍了各种实际的CD40 - B的文化。

A.制备饲养细胞（N​​IH/3T3 tCD40L）

tCD40L NIH/3T3壁小鼠成纤维细胞系，这不应该成为完全融合。因此，这些细胞被劈裂每周两次。超过6周以上的培养，不推荐。

1. 从小学文化的老媒体取出，用无菌吸管和10 mL 1X PBS中洗细胞。吸的PBS洗涤后。
2. 添加4 mL的胰蛋白酶/ EDTA在75厘米^的 2瓶5-10分钟，在37 ° C。使用温柔攻分离的细胞。
3. 野生型中添加10毫升，并轻轻旋转。
4. 转移到50 mL试管细胞悬液，用无菌吸管和旋转5分钟在225 XG细胞。
5. 去除上清，重悬沉淀在野生型中的10毫升。计数细胞悬液等分的细胞数，并准备适当数量的细胞50毫升管：
   1. 1.5 × 10 ⁶细胞传代
   2. 0.2 × 10 ⁶细胞/孔的CD40 - B细胞培养用于照射
   3. 其余冻结（如需要）。
6. 旋转细胞在225 5分钟XG。
7. 去除上清。
   1. 传代培养：重悬于1.5 × 10 ⁶细胞10毫升，75厘米²细胞培养瓶中的野生型中（细胞密度为1.5 × ¹⁰ 5细胞/ mL），加入的G - 418 [0.7毫克/毫升]和孵化细胞37℃，5％的_CO 2 。每周两次分裂的细胞。
   2. 对于CD40 - B细胞培养：您需要1.2 × 10 ⁶ 6孔板细胞。在野生型中重悬的细胞密度0.1 × 10 ⁶细胞/ mL，他们在78 Gy的照射。板2毫升细胞悬液，每口井，并在_37℃，5％的CO 2。使用B -细胞的刺激，这准备板块tCD40L NIH/3T3细胞是贴壁时（至少4个小时：坚持用显微镜检查;不要等到超过24 h开始的B细胞刺激）。 （继续与B）

B. CD 40 - B细胞培养

一，制备外周血CD40的刺激（0天）：

请注意：在继续之前确定，饲养层细胞是贴壁。随时添加新的解决办法白细胞介素4和环孢素A培养基中，使用前。

1. 取外周血，新鲜或适当解冻。悬浮外周血1X PBS毫升，两次把它们洗干净，和自旋向下第一时间为7分钟，第二次在7分钟190 XG删除其他细胞在265 XG。弃上清，并在20毫升的PBS重悬细胞。确定细胞的细胞悬液分装数。
2. 离心5分钟在225 XG所需的细胞量。对于6孔板4 × 10 ⁶细胞/孔的需要，因此24 × 10 ⁶细胞每盘。
3. 去除上清，重悬CD40 - B的文化与50 U /白细胞介素4毫升新鲜培养基中的外周血单个核细胞在1 × 10 ⁶细胞/ mL，作为一种生长因子和0.63微克/毫升环孢素A到防止T细胞的产物（给定的浓度是指一毫升培养液）。
4. 去除上清从6孔板前培养与tCD40L NIH/3T3细胞。
5. 每孔2 mL的PBS第一和第二步在2毫升的CD40 - B的清洗介质，清洗附着tCD40L NIH/3T3细胞。
6. 轻轻添加4毫升的外周血单个核细胞悬液（1 × 10 ⁶细胞/ mL），每孔6孔板。
7. 细胞在37 ° C的5％的CO _2。
8. 第7天，reculture细胞（3.2继续。）

二。复垦的CD40的B细胞（7天，然后每隔3-4天）：

1. 从6孔板CD40 - B细胞10毫升到50毫升管的移液器和池他们resuspending收获集群。
2. 离心7分钟在225 XG，并完全取代CD40 - B的清洗介质的上清。虽然计数细胞数量的等分，5分钟旋转225 XG细胞。悬浮CD40的B细胞CD40 - B的培养基中，在浓度为1 × ¹⁰ 6细胞/ mL 。
3. 在50 U / mL的浓度和0.63μg/ mL的环孢素A的中期添加新鲜的白细胞介素4的解决方案。
4. 从6孔板与tCD40L NIH/3T3细胞预孵育取出上清。
5. 每孔2 mL的PBS第一和第二步在2毫升的CD40 - B的清洗介质清洗贴壁细胞。
轻轻每6孔板以及添加4毫升（1 × 10 ⁶细胞/ ml）CD40 - B的悬挂。
6. 孵育板在37℃，5％的CO ^2。
7. 再次传代培养细胞每隔3-4天，结束与高纯度的人CD40 B细胞激活后，共14天。

C.故障排除 - CD40 - B细胞，如果不增长？

1. 你有检查饲养层细胞的CD40的配体表达？
2. 板势必给料机，用于刺激细胞不应超过24h以上吗？
3. 支原体可能是一个污染？
4. 白细胞介素4的解决方案，为补充新鲜解冻，并有适当的生物活性？
5. 环孢素A中添加正确的浓度？

图1，请点击这里为图1的放大版本。

图2，请点击这里为图2的较大版本。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
直属细胞野生型中		馈线小区选择培养基
试剂	集中	试剂	集中
DMEM - HAM / F12		DMEM - HAM / F12
L -谷氨酰胺	365微克/毫升	L -谷氨酰胺	365微克/毫升
胎牛血清	10％	胎牛血清	10％
HEPES	10毫米	HEPES	10毫米
庆大霉素	15微克/毫升	庆大霉素	15微克/毫升
		G - 418	0.7毫克/毫升

CD40 - B的清洗介质		CD40 - B的培养基
试剂	集中	试剂	集中
IMDM		IMDM
L -谷氨酰胺	584微克/毫升	L -谷氨酰胺	584微克/毫升
HEPES	25毫米	HEPES	25毫米
庆大霉素	15微克/毫升	庆大霉素	15微克/毫升
		RH转	50微克/毫升
		RH胰岛素	5微克/毫升
		AB - Humanserum	10％

试剂	公司	订单号
DMEM / HAM的F12	临时机场管理局	猫编号：E15 - 813
IMDM	Invitrogen公司Gibco公司®	楼盘21980-032
贝科的PBS（10X）	临时机场管理局	猫没有H15 - 011
AB人血清	Invitrogen公司	CAT无34005100
全息转人类	西格玛	CAT没有T0665
胰岛素人类	西格玛	CAT没有I2643
Gencin ®	三角洲选择	货号7395800
重组人白细胞介素- 4	Immunotools	CAT无11130045
环孢素A	诺华公司	猫没有NDC 0078-0109-01
胎牛血清	龙沙	猫没有DE14 - 802C
HEPES缓冲液	临时机场管理局	猫没有S11 - 001
G - 418硫酸盐	临时机场管理局	猫没有P02 - 012
胰蛋白酶/ EDTA（10X）	Invitrogen公司Gibco公司®	楼盘15400-054

试剂	公司	订单号
无菌移液器	Sarstedt
6孔板	NUNC	CAT没有140675
50毫升锥形管	BD猎鹰™	CAT没有352070
组织培养瓶	SARSTEDT	CAT没有83.1813.002