SC1（Pluripotin）使用，以支持在没有LIF的自我更新MESC

摘要

通过双抑制的Ras GAP和ERK1 SC1功能。我们SC1的功能，支持在没有LIF的小鼠ES细胞的自我更新和测试表明，SC1的是能够保持自我更新的小鼠胚胎干细胞培养。

摘要

小鼠胚胎干（ES细胞）是传统的培养与白血病抑制因子（LIF），以维持自我更新。

研究方案

1。 MEF的接驳板的制备

1. 前一天培养ES细胞，解冻之一小瓶的照射E14.5 CF - 1 MEF饲养层细胞（见我们的程序就如何解冻ES细胞）。
2. 板万细胞密度的MEF饲养层细胞/孔在12孔板。在37 ° C和5％的CO ₂孵育过夜的细胞。 MEF细胞介质：DMEM培养基辅以10％的ES - PBS，谷氨酰胺1X和1X非必需氨基酸。

2。小鼠胚胎干细胞的自我更新维护

1. 分离的ES细胞，用胰蛋白酶。种子/以及在先前准备的MEF的生长介质的接驳板（淘汰赛的MEM补充KSR 15％，4毫米L -谷氨酰胺，0.1毫米的非必需氨基酸和1X BME）在50,000个细胞的密度细胞辅以SC1所需浓度（我们使用100纳米，300纳米，和1μM）。我们还添加了一个积极的控制，以及1000μ/ ml的LIF的补充。在37 ° C和5％的CO ₂孵育过夜的细胞。
2. 培养细胞在37 ° C和5％的CO ₂在每个通道的3-4天。刷新媒体每48小时。
3. 传代细胞1:10至1:15与胰蛋白酶，以保持作为最初的播种密度相似密度。 5代后，细胞可表达典型的多能性标志物，用免疫细胞化学检查。

3。多潜能性标志物的免疫细胞化学考试

1. 清洗细胞，用PBS轻轻三次。
2. 修复细胞在室温下20分钟的固定液500μL。
3. 清洗细胞，用PBS轻轻三次。
4. 阻止非特异性结合，用500μl堵在室温下一个小时的缓冲。
5. 孵育细胞的特定抗体与250μL（我们Nanog的，SOX2，SSEA1和Oct4的使用在以下稀释1:500，1:2000，1:500，而1:500）
6. 清洗细胞，用PBS轻轻三次。
7. 两个小时在室温下，保持避光（我们用1:2000和驴驴的Alexa Fluor ® 488标记的抗兔抗鼠的共轭的Alexa Fluor ® 555 1 250μL二次抗体孵育细胞：2000）。
8. 清洗细胞，用PBS轻轻三次。
9. 添加的DAPI（终浓度为1微克/毫升）的最后一次洗涤，孵育5分钟，以可视化核。
10. 分析荧光显微镜下的细胞。

4。代表性的成果：

1。形态学结果：

LIF或SC1 MEF饲养层细胞的小鼠胚胎干细胞（ESC R1）的生长，维持自我更新，在未分化状态。分化后的第二通道，可以在细胞中观察到无LIF或SC1（阴性对照），5代后，基本上没有无差别的殖民地。 LIF（阳性对照）处理殖民地保持在未分化状态，整个5单元段落。然而，SC1的治疗浓度为300纳米或100纳米的细胞也保持未分化，5代后，细胞治疗1微米SC1的经验丰富的细胞死亡之后的第四代。应用笔记（图2）表1总结了形态学观察。

2。多能性标志物的表达

固定维持5代的小鼠胚胎干细胞和免疫细胞化学研究SSEA1，OCT4，Nanog和Sox2基因。标记表达LIF在维持细胞相似。 （图3和4应用笔记）

图1：在LIF或SC1维持细胞的形态比较。在形态上没有差异。

图2和图3：Nanog的，SSEA1，SOX2，和Oct4的SC1或LIF（图4）应用笔记维持ES细胞的染色。保持在SC1的细胞显示出类似的多能性标志物表达LIF在维持细胞。

表1

	阴性对照	LIF的积极的控制	SC1的1微米	SC1的300纳米	SC1的100纳米
第一通道	正常的胚胎干细胞的形态	正常的胚胎干细胞的形态	正常的胚胎干细胞的形态	正常的胚胎干细胞的形态	正常的胚胎干细胞的形态
第二通道	一些差异化的形态	常规e手机信号形态	正常的胚胎干细胞的形态	正常的胚胎干细胞的形态	正常的胚胎干细胞的形态
第3代	大部分细胞分化	正常的胚胎干细胞的形态	正常的胚胎干细胞的形态	正常的胚胎干细胞的形态	正常的胚胎干细胞的形态
第四通道	没有人事编制小组委员会的殖民地	正常的胚胎干细胞的形态	观察细胞死亡	正常的胚胎干细胞的形态	正常的胚胎干细胞的形态
第5代	有区别的	正常的胚胎干细胞的形态	观察细胞死亡	正常的胚胎干细胞的形态	正常的胚胎干细胞的形态

讨论

可用于小分子SC1在小鼠胚胎干细胞的未分化状态的维持与自我更新。然而，在使用一个未经考验的细胞株，它应该被滴定，以确定最佳浓度。例如，我们测试了三种浓度的小鼠胚胎干细胞株ESC R1的。 100 nm和300 nm的浓度能够维持小鼠胚胎干细胞，然而，1微米的浓度是有毒的。

SC1也可用于馈线条件下。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
SC1	Stemgent	04-0011
LIF	EMD Millipore	ESG1107
SSEA-1 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	21702
Nanog antibody	Abcam	ab21603
Sox2 antibody	Chemicon International	Ab5603
Oct4 antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-5279