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Method Article
分离纯化果蝇外周神经元
摘要
在这个视频文章中，我们目前的分离纯化的方法果蝇使用快速磁珠辅助细胞排序策略外周神经元。从分离的细胞获得的RNA可以很容易地用于下游应用，包括微阵列分析。
摘要
“
研究方案
果蝇外周神经元的磁性珠排序总评（共完成“议定书”的时间：2.5-3小时）
在任何时候都保持一个干净，核糖核酸酶自由的环境标准的实验室程序必须遵守，以防止RNA降解。
当解剖果蝇幼虫角质层，并放置在细胞内分解缓冲区，外周神经元是脱离角质层的细胞之一。我们必须利用这个属性，并设计了这个协议，以去除大部分从非特异性的细胞，如肌肉和脂肪隔离DA能神经元前角质层。
通过实践，可以成功地完成了整个协议，大约2.5小时内。在实验开始前，必须完成编制抗体包被的磁珠。
1。准备装订细胞磁珠：
实验开始前，必须完成这一步。可以准备准备珠和储存在4℃直至需要。
- 100μL磁珠M - 280链霉亲和素包被的磁珠在PBS的3倍，由500μL新鲜PBS resuspending制粒在一个强大的磁场，它每次清洗。
- 最后直接在未经稀释的生物素标记的鼠抗鼠CD8a抗体（抗体浓度为100微克/毫升）100μL重悬磁珠。
- 孵育1小时偶有轻度振荡，以防止沉淀冰的混合物。 [1μL磁珠M - 280可绑定0.05-0.10微克生物素抗体]。
- 珠抗体混合物洗净三次步骤1.1中所述，以除....
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讨论
这里介绍的协议优化，坚持紧紧地使用磁珠细胞分选策略果蝇三龄幼虫角质层内表面的外周神经元的分离和纯化。虽然我们已经使用了此协议专门隔离果蝇DA能神经元，此协议的应用到其他类型的细胞，角质层中的幼虫或蛹的发展阶段，坚持以隔离（如上皮细胞，肌肉，其他的外周神经元）可适应由不同的几个参数，并使用不同的GAL4，记者UAS - mCD8 - GFP转基因标签的细胞类型或类型的利益。.......
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致谢
我们感谢博士。裕农一月和韦斯Grueber提供在这项研究中所使用的飞股票。作者承认托马斯F和支持这项研究的凯特米勒Jeffress纪念信托（DNC）和乔治梅森大学教务办公室（EPRI）。
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材料
设备
- （10）钕块磁铁（K＆J磁公司，卡特彼勒。B444B），或者DynaMag™-2（Invitrogen公司，卡特彼勒。＃123 - 21D），也可使用。
- Kontes玻璃组织研磨机，2毫升的工作能力，与大间隙杵（货号＃885300-0002）
- 细胞过滤器，如磁珠预分离过滤器（美天旎生物技术公司，卡特彼勒＃130-041-407）
- 35毫米培养皿菜涂有Sylgard（道康宁公司，卡特彼勒＃3097358-1004）
- 解剖工具：两对杜蒙号5钳（精细的科学工具，猫＃11251-20。）
- Vannas春天微解剖剪刀（精细的科学工具，猫＃15000-08）
- 配有一次性尖头滴管（P - 1000 P - 100 P - 10）
- 标准血球计数细胞和估计纯度
- 与标准直径的火抛光提示巴氏吸管〜50％的标准直径，缩小和收窄至〜25％的标准直径为trituration
- 台面微型离心机（1-16,000（X）G）
- 涡旋
- 荧光立体显微镜（徕卡MZ16FA在本议定书）
参考文献
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim,, Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling o....
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