KLRG1四聚体的生产协议

摘要

这个协议描述KLRG1四聚体的生产，这是一个强大的工具KLRG1配体的分析。

摘要

杀伤细胞凝集素样受体G1（KLRG1）是II型跨膜糖蛋白抑制性受体，属于C型凝集素样超家族。 KLRG1存在单体和二硫键相连的二聚体。这种保守的受体上最成熟，最近激活NK细胞，以及效应/记忆性T细胞的一个子集。

使用KLRG1四聚体，以及其他的方法，E，N，和R -钙粘素被确定为KLRG1配体。这些CA ^{2 +}依赖的细胞，细胞粘附分子由胞外域包含五个cadherin的细胞间的相互作用，跨膜结构域和细胞质域与肌动蛋白细胞骨架的重复。

KLRG1四聚体的生成，是必不可少的KLRG1配体的识别。 KLRG1四聚体，也是一个独特的工具，以澄清在调节免疫反应和组织的完整性的作用cadherin和KLRG1发挥。

研究方案

包涵体的制备

1. 接种4 × 500毫升烧瓶结核病每个过夜培养的细菌，表达KLRG1质粒构建含有50微克/ ml的羧苄青霉素和氯霉素。当外径达到0.6 A，在600 nm与0.4 M IPTG诱导，并在37孵育一个附加的4小时晃动文化° C。
2. 中提取的干细胞重悬在再悬浮缓冲液的pH值= 8.0（50 25％（W / V）蔗糖，1 mM的EDTA，MM的Tris - HCl，10 mM的数码地面电视）。注：颗粒可以在这个阶段被冻结。
3. 池不超过60毫升细菌resuspensions的聚丙烯烧杯。如果有必要调整到60毫升，用TE缓冲液pH值8.0，并在半速搅拌混合。
4. 以搅拌混合添加下降明智的：溶菌酶（终= 1毫克/毫升），氯化镁（终= 5毫米），2毫克DNA酶我包含在50％的甘油75毫米氯化钠，TRITON - X100（最终= 1％），数码地面电视（最终= 10毫米）。
5. 超声冰1.5分的解决方案，并在10分钟5000转离心裂解液在4 ° C。
   1. 倾倒上清液。
   2. 添加15毫升的洗涤缓冲液的pH值= 8.0（50毫米的Tris - HCl，0.5％Triton X - 100的的氯化钠，100毫米，1毫米EDTA，1 mM的数码地面电视）。
   3. 在冰上，超声1.5分钟的解决方案，直到沉淀完全重悬。
   4. 10分钟5000转离心样品在4 ° C。
   5. 重复洗5次。
6. 洗没有TRITON X - 100，离心机和4毫升TE缓冲液中的悬浮缓冲液重复5B。
7. 以湿重包涵体浆在30至100毫克/毫升的浓度，并存储在TE缓冲液。

复性KLRG1

1. 1 L复性缓冲液pH = 8.0（0.4 M精氨酸盐酸的0.1 M Tris pH值8-8.3，2毫米EDTA，0.2毫米PMSF，EDTA - 免费蛋白酶抑制剂药片，5毫米GSH和0.5毫米的GSSG）和寒意到4 ° C，边搅拌。
2. 准备注入折叠混合物包涵体：这是非常理想，使每5 10注射用0.25 0.5微米的浓度，使终浓度的蛋白质将于2 3微米。
   1. 融化10毫米的β-巯基乙醇50毫克包涵体浆量在7米GnHCl。
   2. 保持包涵体/ GnHCl混合物在37 ° C为30 - 40分钟和涡每5分钟，以确保完全融化（完全融化时，泥浆就会清楚）。
   3. 离心机最大速度离心30分钟在4 ° C，将上清转移至15 mL离心管。做不转让任何黑色的小颗粒。
3. 注射缓冲液（3米GnHCl，10毫米NaAcetate mM的EDTA，pH值4.2,10），调整音量。
4. 注入1毫升稀释后的包涵体每隔一小时。注射时，在高速搅拌，添加1毫升稀释包涵体下降，下降2秒之间每下降。当注射完成后，在低速搅拌。
5. 隔夜继续低速搅拌，在4 ° C。

浓度的复性反应

1. Millipore公司S协议，集中1升的预过滤（0.22μm的过滤），复性反应使用Amicon搅拌细胞和YM10 NMWL 10K超滤膜（Millipore公司）〜10毫升。
2. 集中≤2毫升，使用一个Centriplus YM - 10 10K截留分子量（Millipore公司）。

KLRG1四聚体的纯化

1. 安装在4 ° C，符合GE医疗手册的AKTAFPLC。
2. 使用Sephacryl S - 200 16/60高分辨率柱（通用电气医疗集团）在20毫米的HEPES和150 mM氯化钠尺寸排阻色谱纯化单体形式存在的KLRG1。 （见图1）。
3. 浓缩至1 ml，使用Centriplus YM - 10 10K截留分子量（Millipore公司）。
4. 根据以亲和力S协议，使用比拉酶biotinylate KLRG1单体。
5. 免费素是体积排阻色谱2淘汰。
6. KLRG1分子tetramerized KLRG1单体与4倍超额摩尔聚乙烯共轭链霉亲和素（BD Biosciences公司）混合。

代表性的成果

AKTA FPLC尺寸排阻色谱图1。代表从积极的成果复性KLRG1。图表显示分离（83.52毫升）的单体，二聚体（56.36毫升），和multimer（36.26毫升）的复性KLRG1形式。 94.25毫升峰代表缓冲区交换。

讨论

在这个协议中，它是如何净化，biotinylate，tetramerize KLRG1。 KLRG1四聚体可以用来标记流式细胞仪KLRG1配体。虽然复性条件进行测试，每个蛋白质的经验，其他的C型凝集素可tetramerized使用了类似的协议。使用tetramerized蛋白作为探针，对孤儿的C型凝集素受体的配体可能被确定。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BirA Enzyme and Buffer	Biotinylation Kit	Avidity	BIRA500
Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free	Reagent	Roche Group	11 836 170 001	or equivalent
Amicon Stirred Cell	Equipment	EMD Millipore	Model #8400	or equivalent
YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane	Filtration Supply	EMD Millipore	13642
15 ml YM10 concentrator	Filtration Supply	EMD Millipore	4411
AKTAFPLC	Equipment	GE Healthcare	18-1900-26
Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column	Equipment	GE Healthcare	17-1166-01
Strepavidin PE	Reagent	BD Biosciences	554061	or equivalent