生活磁共振波谱果蝇</em用魔角旋转

摘要

这项技术使活的分子特征的高分辨率魔角旋转的质子磁共振波谱（1H - MRS HRMAS）果蝇

摘要

高分辨魔角旋转（HRMAS）质子核磁共振光谱（

研究方案

第1部分：准备HRMAS测量果蝇

1. 使用标准flylab程序^1，收集新eclosing 3天的苍蝇，他们转移到飞瓶含有新鲜飞食品。孵育5天收集到的苍蝇，苍蝇将成为老实验前5-8天。只有一种性别（通常是男性）是用于实验。
2. 使用健康，完整的野生型果蝇与治疗如创伤或转基因苍蝇^1。
3. 放入含有一块飞食品24小时（〜0.2毫升）实验前2毫升管单苍蝇。这些管子承受使用火焰加热的胰岛素针管杯孔。
4. 权衡的管飞采用了高精密天平插入之前和之后，并定义每个飞的体重减去后者的第一个值。一个单一的男性飞的重量一般为0.7-1毫克。

第2部分：HRMAS 转子准备。

1. 不到一分钟麻醉里面飞单管置于冰上。
2. 铺设一层铝箔置于冰上飞，飞轻轻推入使用软毛刷，以确保完成飞行的插入，同时避免飞伤害的NMR转子插入中空的半球形空间。
3. 将插入到氧化锆（ZrO _2的 ）转筒（4毫米直径，50μL），定位和转子的转子插入底部（见图1）之间的苍蝇。
4. 关闭用螺丝插入和封口膜（见图1）覆盖，以防止飞和TSP的标准溶液（TSP之间的接触：三甲基硅烷基丙酸- 2 ,2,3,3 - D4酸，MW = 172，δ = 0.00 ppm时，氘水- D _{2 O，}这两个共振化学位移和量化的参考功能）50毫米。
5. TSP的转子插入顶部的标准解决方案新增8μL。 （见图1）。
6. 安全和收紧了整个设置在顶盖与转子（见图1）。

第3部分：数据采集HRMAS

1. HRMAS探头引入转子和魔角54.7 °（见图1）的位置。
2. 在结合的BTO - 2000 MAS气动装置的单位，设置在4 ° C的温度。苍蝇都保持在4 ° C，而在光谱仪，麻醉维持。
3. 设置在2 kHz的MAS HRMAS ^{的1 H} MRS纺企。
4. MAS旋转频率稳定在2.0 ± 0.001千赫的MAS速度控制器（旋转频率）。
5. 对于磁铁的准备：调整和匹配最佳的性能和垫片质量最优的光谱磁铁线圈。
6. 采集一维^{的1 H}谱使用同步卡尔赛尔Meiboom -吉尔（CPMG）自旋回波脉冲序列^2，转子[90 ° - （τ- 180 ° - _τ）N -收购，作为T ₂过滤工程删除，以收购一维数据，对所有样品的光谱展^宽的1 H核磁共振单飞光谱。同步脉冲间的延迟（τ=500μS）的MAS旋转频率（2千赫）。设置在256 32,768（32K）数据点的瞬态。采集时间9分钟。
7. 采集二维（2D）的H - ^{1 H} HRMAS核磁共振对所有使用3绝热脉冲一个TOBSY序列样本单飞光谱。采集参数：2K数据点直接的尺寸（11 ppm的谱宽），1预饱和的水松弛延迟期间，8％的增量扫描，128个递增，2秒的总重复时间​​，搅拌时间45毫秒，总收购29分钟的时间。

第4部分：数据处理/分析

1. 分析使用MestReC的软件（Mestrelab研究，www.mestrec.com标本MRspectra）
2. 使用一个0.5赫兹扩大切趾的功能，并适用于^{所有HRMAS的} 1 H FID的傅立叶变换之前。
3. 参考尊重议员光谱​​TSP的δ= 0.0 PPM（外部标准）。
4. 手动相位谱，和应用惠特克基线估计广泛的组件前，以峰面积计算减去基准。
5. 估计使用MestReC软件的峰面积。峰高与定额TSP的每个收购频谱（TSP峰高= 1）。使用t检验（双尾，P <0.05），组内比较组之间的比率。
6. 2D TOBSY工艺参数是：在两个维度QSINE = 2的窗口函数，直接维和零填充到1K，在第二个维度，阶段中的第二个维度的尺寸和基线校正校正2K点英尺。
7. 使用斯帕克方案（TD戈达德和DG Kneller得利3，USCF， http://www.cgl.ucsf.edu/产生的二维光谱首页/得利/）

第5部分：从Live 果蝇代表光谱苍蝇

上述程序允许收集活果蝇苍蝇重现光谱。图2和图3显示了在野生型（WT）俄勒冈州- R代表致辞光谱收购苍蝇。图2给出了1D ^{的1 H} HRMAS CPMG光谱。主要脂质成分[C H _3（0.89 ppm）的_，（2）C H N（1.33 PPM），C H _2架C - CO（1.58ppm），C H ₂ C = C（2.02 PPM），C H ₂ C = O（2.24 PPM），C H = C H（5.33 PPM），甘油（1,3 - C H 4.10 PPM，4.30 PPM; 2 - CH ₂ 5.24 PPM），和小的代谢物：β-丙氨酸（β-丙氨酸，2.57 PPM），醋酸乙烯酯（AC，1.97 PPM），phosphocholine（PC，3.22 PPM）和phophoetanolamine（PE，3.23ppm）进行检测，并根据与以前的报告4，第5指派。 2.02 PPM信号被分配到的 C H2 - CH = CH基团的单不饱和脂肪酸（如棕榈油）亚甲基质子。不饱和脂肪酸被确定在5.33 PPM - CH = CH -基团的质子产生的信号。无法分配或使用1D的频谱不可见的小代谢产物^检测 2D 1 ^{H -} 1 H TOBSY HRMAS（见图3）。

图1。实验设在体内 HRMAS 1H MRS 14.1 T.外标三甲基硅丙酸- 2 ,2,3,3 - D4氘水酸（TSP / D _{2 O）}的活果蝇调查。在广场：在HRMAS探头魔角转子位置。

图2 在体内 1D HRMAS ^{的1 H} CPMG的一个活的果蝇重飞光谱。脂质成分：C H _3（0.89 ppm）的_，（2）C H N（1.33 PPM），C H ₂ C - CO（1.58ppm），醋酸（AC），C H ₂ C = C（2.02 PPM），C H ₂ C = O（2.24 PPM），β-丙氨酸（β- ALA），phosphocholine（PC）和phophoetanolamine（PE），甘油（1,3 - C H，4.30每分钟4.10; 2 - C _H 2 5.22 PPM ） C H = C H（5.33 PPM）。

图3。 体内 2D 1H - 1H TOBSY HRMAS现场果蝇重 14.1吨小代谢产物和脂质成分飞的光谱进行了鉴定。代谢物：丙氨酸（ALA），β-丙氨酸（β- ALA），精氨酸（Arg），谷氨酰胺（Gln），谷氨酸（Glu），PC phosphocholine（电脑），phophoetanolamine（PE），牛磺酸（头），α-葡萄糖（α- GLC）和甘油。血脂组件：C H _{3（0.89 PPM），（2）C} H N（1.33 PPM），C H ₂ C - CO（1.58 PPM），C H ₂ C = C（2.02 PPM），C H ₂ C = O （2.24 PPM），C H = C H（5.33 PPM）。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

随着最近在体内 MRI水果中的可行性报告的^异常苍蝇6，在果蝇体内MRS研究尚未报道。在本议定书中，我们描述了在体内^HRMAS 1 H - MRS检测生物的重要分子方法的小说实施。具体来说，我们检测血脂和小活果蝇的代谢产物在14.1 T苍蝇在约45分钟，它允许有足够的采集时间，同时实现零飞死亡率。使用转子同步WURST 8绝热脉冲（C9 ^1月 _15日 ）在TOBS...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Deuterium oxide	Reagent	Sigma-Aldrich	7789-20-0
3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 acid	Reagent	Sigma-Aldrich	24493-21-8
agar, sucrose, yeast, cornmeal	Food	Genesee Scientific		http://www.flystuff.com/
Oregon RS or Canton-S flies	Adult fly lines	Bloomington Stock center		http://flystocks.bio.indiana.edu/
Paintbrush	Equipment			(size 0)
2ml tubes	Equipment	Fisher Scientific	K749521-1590
Fly incubators	Equipment			high humidity capacity (60-75%), adjustable temperature, and a 12 h:12 h light: dark cycle.
Bruker Bio-Spin Avance NMR spectrometer (600.13 MHz) 4mm triple resonance (1H, 13C, 2H) HRMAS probe	Equipment	Bruker Corporation
BTO-2000 unit in combination with a MAS pneumatic unit	Equipment	Bruker Corporation
4mm zirconium oxide rotor (capacity 50 ul)	Equipment	Bruker Corporation	B3829 (Bruker store)
MestReC (Mestrelab Research)	Software			1D NMR spectra analysis http://mestrelab.com/
SPARKY 3, USCF	Software			2D NMR spectraanalysis http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/