激活的B细胞CD40的小鼠模型

摘要

在这个视频中，我们展示的CD40从C57BL / 6小鼠的脾细胞，它可以用来作为模型抗原提呈细胞（APC）的研究免疫诱导小鼠的B细胞的活化和扩大的过程。

摘要

有研究表明，B细胞CD40的激活提高其抗原提呈能力。当白细胞介素4和CD40配体（CD40L）的刺激下，没有非常大量高纯度的CD40 - B细胞（14天之内的困难，从少量外周血的可扩展人类B细胞> 10

研究方案

协议分为两个部分：第一部分为一代小鼠CD40激活的B细胞（脾mCD40B）一个演示小鼠CD40配体（CD40L）表达HeLa细胞（tmuCD40L HeLa细胞），这将被用作板准备束缚饲养层细胞。 B部分介绍了实际的小鼠CD40 - B的文化。

A.制备饲养细胞（HeLa细胞tmuCD40L）

tmuCD40L HeLa细胞是一个附着的人类上皮细胞系，这不应该成为完全融合。因此，这些细胞被劈裂每周两次。超过6周以上的培养，不推荐。

1. 从小学文化的老媒体取出，用无菌吸管和10 mL 1X PBS中洗细胞。吸的PBS洗涤后。
2. 添加4毫升1X胰蛋白酶/ EDTA，在一个75厘米^的 2瓶10-15分钟，在37 ° C。使用温柔攻分离的细胞。
3. 野生型中添加10毫升，并轻轻旋转停止用胰酶消化。
4. 转移到50 mL试管细胞悬液，用无菌吸管和旋转265 7分钟XG的细胞。
5. 去除上清，重悬细胞沉淀在野生型中的10毫升。计数细胞悬液等分的细胞数，并准备适当数量的细胞50毫升管：
   1. 2.5 × 10 ⁶细胞对亚文化
   2. 0.4 × 10 ⁶细胞/孔照射小鼠CD40 - B细胞培养使用
   3. 其余冻结（如需要）。
6. 旋转细胞在265 7分钟XG。
7. 去除上清。
   1. 传代培养：重悬于2.5 × 10 ⁶细胞10毫升，75厘米²细胞培养瓶中的选择培养基（细胞密度为2.5 × ¹⁰ 5细胞/ mL）孵育细胞在37℃，5％的_CO 2 。每周两次分裂的细胞。
   2. 对于小鼠CD40 - B细胞文化：您需要2.4 × 10 ⁶ 6孔板细胞。在野生型中重悬tmuCD40L HeLa细胞密度0.2 × 10 ⁶细胞/ mL，他们在78 Gy的照射。板2毫升细胞悬液，每口井，并在_37℃，5％的CO 2。使用B -细胞的刺激，这准备板块tmuCD40L HeLa细胞是贴壁时（至少4个小时：用显微镜检查坚持;不要等到超过24 h开始的B细胞刺激）。 （继续与B）

B.小鼠CD40 - B细胞培养

一，制备脾细胞CD40的刺激（0天）：

请注意：在继续之前确定，饲养层细胞是贴壁。随时添加新的解决办法小鼠白细胞介素- 4，β-巯基乙醇和环孢素A的生长介质，使用前。

1. 剖析的C57BL / 6小鼠（H - 2B单体）的脾和10-20毫升的DMEM洗两次辅以庆大霉素[15μg/mL]一个10毫升吸管尖从一个管到另一个传输。避免使用鼠标的传输污染物（例如头发）。切碎脾细胞通过一个过滤器（100微米）通过，并与其他10毫升的中型冲洗过滤器。降速在室温下为7分钟在265 XG脾，重悬在7ML muCD40 - B细胞中，并Ficoll密度离心分离淋巴细胞。没有在室温下刹车，这样做的5毫升鼠标Pancoll（在室温预热）在15毫升管和离心30分钟XG 450层细胞。
2. 绘制关闭最上层，离开淋巴细胞在界面层不受干扰。淋巴细胞层转移到一个新的50 mL试管中，用30毫升，庆大霉素[15μg/mL] DMEM培养液一旦被旋转265 7分钟XG删除其他细胞。弃上清，重悬细胞mCD40 - B的清洗介质在10毫升的。确定细胞的细胞悬液分装数。确定由计数的细胞悬液等分细胞数。
3. 离心7分钟在265 XG的细胞所需的金额。对于6孔板5 × 10 ⁶细胞/孔的需要，因此30 × 10 ⁶细胞每盘。
4. 取出上清液，重悬mCD40 - B的文化与1 U /白细胞介素4毫升新鲜培养基中的淋巴细胞，在1.25 × ¹⁰ 6细胞/ mL，生长因子，100微米，β-巯基乙醇和0.63微克/毫升，环孢素A，以防止T细胞的生长（由于浓度是指一毫升培养液！）。
5. 取出从6孔板与tmuCD40L HeLa细胞预孵育中的上清。
6. 轻轻地添加4毫升的淋巴细胞悬液（1.25 × 10 ⁶细胞/ mL）以及每6孔板。
7. 板在37℃，5％的CO _2。
8. 第3天reculture细胞（二.1继续）。

二。 mCD40B细胞传代培养的（第3天，然后每周两次）：

1. 收获mCD40B大力移液10毫升到50毫升管的移液器和池他们向上和向下的细胞群。
2. 离心7分钟在265 XG，并完全取代mCD40 - B的清洗介质的上清。虽然计数细胞数量的等分，旋转265 XG细胞为7分钟。 mCD40B悬浮细胞mCD40 - B的培养基中，在0.75 × ¹⁰ 6细胞/ ml的浓度。
3. 小鼠白细胞介素4的新鲜的解决方案中添加一个1 U /毫升，100μMβ-巯基乙醇和0.63μg/ mL的中期环孢素A的浓度。
4. 取出从6孔板与照射tmuCD40L HeLa细胞预孵育中的上清。
5. 轻轻地添加4毫升每6孔板以及mCD40B细胞悬液（0.75 × 10 ⁶细胞/ mL）。
6. 孵育板在37℃，5％的CO _2。
7. 再次传代培养的细胞，每隔3-4天，以高纯度的小鼠CD40的B细胞激活后的14天总。

C.故障排除：CD40的B细胞，如果不长呢？

1. 你有检查饲养层细胞的CD40的配体表达？
2. 板约束馈线用于刺激超过24h以上的细胞？
3. 是否有支原体污染吗？
4. 是白细胞介素- 4解决方案，为补充新鲜解冻，并有相应的生物活性？
5. 是β-巯基乙醇和环孢素A中添加正确的浓度？

图1a。

图1b。

图1d。

图2。

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讨论

本协议的修改是可能的，尤其是关于CD40的刺激和使用的小鼠品系类型的起源，也高产高效代小鼠CD40激活的B细胞。艾哈迈迪等人。表明小鼠CD40的配体转染小鼠成纤维细胞类似的结果。可以肯定地排除在这种异种抗原的背景下演示，但在体内的安全性和毒性的深入研究了在此设置使用人类转染的HeLa细胞的炎症或自身免疫反应的迹象。然而，最好的替代代表与激活和增殖活动在同一时间，这?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
直属细胞野生型中	馈线小区选择培养基
试剂	集中	试剂	集中
RPMI 1640培养		RPMI 1640培养
L -谷氨酰胺	300微克/毫升	L -谷氨酰胺	300微克/毫升
胎牛血清	10％	胎牛血清	10％
HEPES	10毫米	HEPES	10毫米
庆大霉素	15微克/毫升	庆大霉素	15微克/毫升
		潮霉素B	0.2毫克/毫升。

mCD40 - B的清洗介质	mCD40 - B的培养基
试剂	集中	试剂	集中
D - MEM		D - MEM
L -谷氨酰胺	580微克/毫升	L -谷氨酰胺	580微克/毫升
血糖	4.5毫克/毫升	血糖	4.5毫克/毫升
HEPES	10毫米	HEPES	10毫米
庆大霉素	15微克/毫升	庆大霉素	15微克/毫升
		纪念	0.1MM（1X）
		胎牛血清	10％

试剂	公司	订单号
RPMI 1640培养	Invitrogen公司Gibco公司	楼盘21875
D - MEM	Invitrogen公司Gibco公司	楼盘41965
Dulbeccos PBS（10X）	临时机场管理局	猫没有H15 - 011
Gencin	三角洲选择	货号7395800
胎牛血清	龙沙	猫没有DE14 - 802C
HEPES缓冲液	临时机场管理局	猫没有S11 - 001
MEM NEAA	Invitrogen公司Gibco公司	楼盘11140
潮霉素B	临时机场管理局	猫没有P02 - 015
重组小鼠白细胞介素4	Immunotools	CAT无12340045
环孢素A	诺华公司	猫没有NDC 0078-0109-01
胰蛋白酶/ EDTA（10X）	Invitrogen公司Gibco公司	楼盘15400-054

试剂	公司	订单号
无菌移液器	Sarstedt
6孔板	NUNC	CAT没有140675
50毫升锥形管	BD猎鹰™	CAT没有352070
组织培养瓶	Sarstedt	CAT没有83.1813.002