塑料嵌入和非洲爪蟾胚胎切片

摘要

塑料型材保持在薄薄的组织，可以用荧光抗体免疫染色的部分真正的组织形态，这种方法比较有用的，比许多类型的组织石蜡包埋或冰冻切片。染色，塑料包埋，切片的方法是在这个视频演示。

摘要

研究方案

固定

1. 在一个小玻璃闪烁瓶转移整个胚胎或解剖植（费舍尔猫＃03 - 339 - 25B）到MEMFA或3.7％FA + PBS。在室温孵育nutator小瓶， 只有 2个小时，而不是不止于此。不要离开2个多小时的胚胎在FA。在FA的潜伏期较长，会使胚胎组织的困难，并导致在检测过程中的抗体差渗透。
   
   
2. 吸大部分的FA和添加登特的固定液的小瓶（〜4.5毫升）顶部。轻轻颠倒几次小瓶洗登特的胚胎，用另一种新鲜的凹痕4.5毫升交流，并在-20 ° C 孵育至少48小时。隔夜不足够的。这一步使胚胎抗体的渗透性。胚胎可以保持在这几个星期的情况下。

免疫

1. 补充水分的标本。在甲醇梯度培养，如下：
   
   

   75％甲醇/ H 2 O	10分钟
   50％甲醇/ PBS	10分钟
   25％甲醇/ PBS	10分钟
   PBS	10分钟
   PBS	10分钟

   
   
2. 60毫米塑料菜1.5％琼脂糖/ PBS板。倒入琼脂糖上PBS后，它已成为固体。
   
   
3. 半胚胎切片 ：将在1.5％琼脂糖/ PBS板的胚胎。一双镊子抓住一个胚胎，并削减了一半的胚胎，用薄薄的刀片中心。选择，您已成功地削减了一半，直切平面的。
   
   
   
   
4. 平分胚胎转移到与PBT的玻璃闪烁瓶。交流4.5毫升的20％山羊血清+ PBT。在室温下孵育2小时上nutator（阻塞）。
   
   
5. 准备适当稀释，在PBT的主要抗体。这每样本0.5毫升是必要的。例如，我用1 / 200稀释的兔抗c - cadherin的多克隆研究在5mm的塑料型材的C - cadherin的亚细胞定位。
   
   
6. 吸出阻塞的解决方案，并添加稀释的抗体0.5毫升。在泡沫塑料管持有人站立位置的小瓶。在nutator 4 º C孵育过夜。
   
   
7. 将稀释的抗体（这种稀释的抗体可以保存并在未来1-2周重复使用）。与PBT的4.5毫升洗4次（每次40-60分钟）在室温下。
   
   
8. 交换的1 / 100稀释生物素标记的第二抗体在PBT0.5毫升。在nutator 4 º C孵育过夜。用铝箔盖住，以防止光素的小瓶。
   
   
9. 从这一点来说， 应采取保护光，即样品，保留下一些盖或铝箔的小瓶。
   
   
10. 删除中学生物素的抗体（这也可以在未来的1-2周重复使用）。洗或PBT4.5毫升4倍（40-60分钟）在室温。
    
    
11. 交换的1 / 200稀释的荧光标记（FITC，德克萨斯红等），在PBT链霉0.5毫升。在nutator 4 º C孵育过夜。
    
    
12. 卸下的链霉（可重复使用，这太）。与PBT的4.5毫升洗3次（15 - 30分钟）在室温下。
    
    
13. 30分钟，在室温下固定在3.7％FA + PBS4.5毫升胚胎。
    
    
14. 与PBS4.5毫升洗两次。
    
    
15. 脱水标本。孵育在乙醇分级系列，如下：
    
    

    30％的乙醇/ H 2 O	10分钟
    50％乙醇/ H 2 O	10分钟
    75％乙醇/ H 2 O	10分钟
    100％乙醇	10分钟

    
    
    
16. 试样可存储100％乙醇在4 º C具有保护盖由轻。

浸润

1. Technovit 7100渗透混合。我通常在50ml的锥形管的基液15毫升，添加固化剂150毫克的我​​，并为15分钟nutator摇摆混合。这种渗透组合，可以保持在4 ° C至一个月。
   
   
2. 渗透与渗透混合标本，通过交流与Technovit渗透的混合/乙醇组合分级系列，如下：
   
   
   1. Technovit /乙醇 - 1小时50％
      
      
   2. 100％Technovit - 1小时
      
      
   3. 100％Technovit - 隔夜
      
      
3. 该specimen可以在100％的渗透混合存储长达一个月在4 ° C。样品放在封面，以保护他们的光。

嵌入

1. Technovit 7100嵌入组合：以0.75毫升渗透在1.5毫升管组合，并添加固化剂二50毫升。颠倒几次管混合。
   
   
2. 用塑料移液管，取一个试样渗透到0.5ml薄壁PCR管中过夜。删除的大部分上清。
   
   
3. 添加在本节步骤＃1，“嵌入”，在试样上的嵌入组合0.25毫升。东方平分胚胎面临的试管底部夹层平面，轻轻地用钝尖清扫针（木处理清扫针）轻推。
   
   
4. 关闭盖子，并在黑暗的地方约四小时，孵化管允许的塑料聚合。
   
   
5. 请Technovit 3040组合。称量皿中以1克的粉末，而添加的液体0.5毫升。随即，混合粉末和液体使用bluetip。倒入硬化spacimen顶部。这黄色的Technovit 3040，防止来自管整个塑料块。

切片

1. 请用二甲苯Histoknife H（乙醇往往是不够好），并设置您的切片。角度约45 °的刀片。用二甲苯擦拭刀片前面舞台区，也因为这方面的清洁切片切片质量的关键。
   
   
2. 切管方和剥离，关闭使用的纸板刀的尖端。
   
   
   
   
3. 设置成夹头持有人的切片标本​​。
   
   
4. 一个载玻片上附加一个“按密封”绝缘体上硅，使安装节片室。用力按下绝缘体清洁台式幻灯片，从另一个侧面看，以确保该绝缘子是完全没有任何气泡附着。倒干净，温馨的_{DH 2} O（〜40℃）使用巴斯德吸管的幻灯片池，这里可以看出，水面变得平缓，没有凹或凸的形状的水平。
   
   
5. 开始节片。对于免疫的研究，我5毫米的节片。 原位杂交样品中 ，可以调整切片的厚度在〜3 - 8毫米的范围内，根据目的和信号强度。
   
   
6. 卡里的节片从刀片前面阶段的安装与水室，用一个小的画笔。一片水池上方握住画笔和降片敲钝尖清扫针水。片将扩大成圆形，尽快到达水面。
   
   
7. 当安装室内的水面面积大部分是充满节片，几乎一半的水使用巴斯德吸管吸。孵育幻灯片温暖过夜，以使样品完全干燥的幻灯片。
   
   
8. 反染色的DAPI（在TE为0.1mg/ml）1毫升五分钟。吸DAPI染色和干燥的样品。
   
   
9. 从幻灯片中删除的硅橡胶绝缘子。现在可以采取的样品图片。样品存放在4℃，避光。

材料