焦距脑缺血模型大鼠大脑中动脉的血管内缝合闭塞

摘要

在大鼠缺血性脑损伤的手术诱导是中风的研究中被广泛使​​用的模型。在这里，我们展示了大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血诱导。还显示导致心肌梗死组织学染色和磁共振成像的可视化。

摘要

中风是导致残疾和死亡的第三大导致全世界成年人^1。在人类中风，存在一个高度可变的临床状态;局灶性脑缺血动物模型的发展，然而，实现实验诱导的梗塞体积的可重复性是必不可少的。老鼠是一个广泛应用于中风动物模型，由于其相对较低的畜牧业成本和颅^流通 2,3人类的相似性。对于人类来说，大脑中动脉（MCA）是最常见的中风综合征和马华闭塞（MCAO）的多种方法的影响已在动物模型来模拟这一临床综合征。由于血管再通，通常会出现以下在人力，再灌注的急性脑卒中后一段闭塞已包括在许多这些模型。在这段视频中，我们展示了在自发性高血压大鼠（SHR）的瞬态腔内缝合MCAO模型。灯丝与硅尖端涂层置于intraluminally马华在60分钟的起源，再灌注。需要注意的是最佳的闭塞期可能有所不同，如只Wistar或只Sprague - Dawley大鼠株，。在大鼠中风的几个行为指标显示。局灶性脑缺血是使用T2加权磁共振图像证实，与2,3,5 - 三苯基氯化MCAO后24小时（TTC）染色脑切片。

研究方案

缺血大鼠模型

术前准备工作

应使用无菌操作技术，手术过程中的所有生存。商业消毒剂与消毒手术的工作表面，并准备通过高压灭菌的无菌手术仪器，窗帘，纱布，棉签，缝合线，手术刀片包。应戴口罩，头发的帽子和无菌手套。一个Germinator干珠灭菌也可用于手术器械重新消毒程序之间，如果有多个大鼠手术将在一次会议。 Prewarm一个水套homeothermic毯和吸水垫下，为了防止在手术过程中对大鼠的低温。

1. 放入感应室自发性高血压大鼠（或其他的选择大鼠株）和诱导麻醉与5％的异氟醚（麻醉机应设置为1.0 L / min的O ₂和1.0升/分钟的N ₂ O） 。降低至1-2％异氟醚维持麻醉。
2. 应用人工泪液软膏双眼。
3. 剃须超出预期的切口，用快船队（A5＃10刀片奥斯特），喉咙和左颈部区域。
4. 优碘纱布垫和皮肤消毒，从手术区域的中心，螺旋式向外。用无菌纱布垫含有70％的乙醇冲洗，移动垫了类似的模式。重复这两个步骤，共3个周期。
5. 0.5％布比卡因沿准切口部位皮下注入0.2毫升。
6. 将大鼠在无菌stockinette或盖用无菌手术悬垂。

马华的瞬态闭塞

7. 在手术显微镜下，腹正中切口进行解剖浅筋膜。
8. 下面的浅筋膜，腺体组织，形成一个三角形的胸骨，这是在气管中线;二腹肌（轻松地确定其闪亮的白色的肌腱部分）左和三个肌肉;最后，胸锁乳突肌肌肉。
9. 仔细尖锐，钝性分离内执行的三角形，以确定颈内动脉（独家钝性剥离可能是由一些首选，以尽量减少意外的组织损伤）。外部，内部，共同的颈总动脉（ECA，ICA CCA）的暴露。颈动脉是大和明显的脉冲。迷走神经是沿着双方共同和颈内动脉外侧窃喜，并大幅关闭的共同和颈内动脉解剖。
10. 两个非洲经委会分支，然后急剧解剖，标题内侧首支和第二支横向标题。烧灼和削减两个分支，这使得更易于调动较大的船只。
11. 非洲经委会现在更rostrally解剖。舌骨可能会遇到，这将限制喙清扫的程度。颈外动脉结扎尽可能远端用6-0丝线缝合。
12. 另外6-0丝线缝合与ICA分叉处经委会周围附近放置松散。确保不堵塞线栓闭塞将经历在后面的步骤船只。
13. 显微剪辑放置常见的颈内动脉分叉附近。
14. 创建一个初步的部分动脉切开术颈外动脉的缝合关系两者之间的丝绸。
15. 介绍了4-0单丝尼龙缝合2.2 -3.0厘米的长度，其浑圆，硅涂层的提示与扭结2.0厘米到非洲经委会流明，对显微剪辑所在的CCA。这些缝线市售（Doccol公司，雷德兰兹，CA，USA）。切非洲经委会的剩余部分（在网站的部分动脉切开术），自由的残端和位置非洲经委会和ICA分叉处以下的残端，这会更容易让线栓进入ICA幻灯片。
16. 丝线缝合收紧经委会残端腔内安全的尼龙缝线，防止出血，然后删除从ICA微血管剪辑。慢慢打开剪辑，再取出检查出血。
17. 继续推进尼龙缝线从ECA到ICA流明大脑中动脉（MCA）。这个长度一般为18-20毫米，是放置在缝合前扭结插入的原因。后插入一个可变长度的尼龙缝线，可能会感觉到阻力。如果发生这种尼龙缝线还在外面的船只目前，它表明，缝合很可能进入翼腭动脉（见下文附注）。拉回来，并缝合轻微，继续沿ICA，这将运行更内侧的曲线。此外，剥离的PPA的起源可能会做更好的可视化的路径腔内的灯丝。继续插入尼龙缝线，直到阻力和2厘米扭结位置后感到。此时，腔内缝合阻止马华的起源。 MCA闭塞可以确认通过监测局部脑血流减少，使用激光多普勒流量计（见一个源设备材料表）。另外还要注意的ICA翼腭动脉的起源，可以直接挂钩，如果愿意，为了避免这种船只的意外插管腔内缝合。
18. 启动定时器和记录闭塞的开始时间。
19. 删除从CCA microclip。
20. 关闭切口，用3-0丝线缝合（一个简单的连续图案，将有助于重新再灌注）（真皮，panniculus carnosus，皮下组织层）迅速和小心地在回收笼的老鼠。检查鼻子和嘴周围的笼地板的铺垫材料和监测从麻醉中复苏。

MCA的血流恢复（灌注法）

21. 前不久闭塞期应该结束，再次麻醉大鼠，用优碘和70％的乙醇（3个周期，如前）的消毒切口部位，然后重新打开删除关闭缝合切口。
22. 广场上共同国家评估microclip，像以前一样。
23. 咬合缝合中途撤回从ICA直到缝合结束是通过ICA可见不完全删除从ICA /非洲经委会缝合！
24. 广场上的ICA以上腔内缝合结束microclip。
25. 完全去除咬合缝合，并紧密配合经委会残端。闭塞再灌注开始时间记录的结束。
26. 删除从ICA microclip。
27. 删除从CCA microclip。
28. 数滴无菌生理盐水湿润的地区，并使用一个简单的中断模式用3-0丝线缝合关闭切口层（真皮，皮下组织，panniculus carnosus）。
29. 0.05毫克/公斤丁丙诺啡（以下您的机构准则或其他适当的手术后镇痛药）管理进入腹膜空间。
30. 预热生理盐水腹腔注射5CC。在恢复阶段，这将为水化。
31. 监测麻醉大鼠的复苏。
32. 大鼠后已经恢复，测试大鼠的尾巴，并观察大鼠是否可以把双方梗死的行为指示。冰壶到一边，不仅是预期。简单的评分尺度可以用来记录战后初期梗死behavorial运作（见讨论）。
33. 丁丙诺啡（如上述相同剂量）的额外注资应给予每6至8小时，24小时疼痛缓解。如果动物出现不适的迹象，延长镇痛。

代表性的成果

图1。的中间脑动脉血管腔内缝合闭塞 。咬合马华的起源与硅涂层腔内缝合的大鼠颅循环系统的简化框图。 OA和ST左经委会已结扎，并围绕非洲经委会残端缝合领带持有腔内缝合到位。 ACA，大脑前动脉; BA，基底动脉，颈总动脉CCA;非洲经委会，颈外动脉; ICA，颈内动脉;马华，大脑中动脉; OA，枕动脉，大脑后动脉PCA; PComA，后交通动脉;苯丙醇胺，翼腭动脉，ST，甲状腺上动脉。图佐佐木等 ⁴和李³适应。

图2。代表24小时大鼠脑冠状切片的磁共振成像后1小时短暂缺血 。伴随局灶性脑缺血脑水肿在T2加权MRI图像的可视化。梗死区出现高信号（亮）在T2图像。类似梗死模式可以看出，用更先进的磁共振成像技术，如扩散加权成像和表观扩散系数映射^5。

图3。染色与TTC 24小时后1小时短暂缺血。TTC染色显示白色（未染色）在如图2所示的相同大鼠大脑皮层和纹状体梗死区域，大鼠脑组织的代表冠状切片。请注意，局灶性缺血性病变的一般模式是在MRI T2加权像看到类似，虽然最后确定组织梗死面积可能略比T2病变。

讨论

脑缺血啮齿动物模型可分为全球性或局灶性和可逆或不可逆的。我们使用一个可逆的局灶性脑缺血模型，以模仿人类的​​中风患者可以出现在下面的血管再通再灌注损伤。虽然大鼠股类似颅流通的人力，广泛颅内侧支循环，由于威利斯和软脑膜吻合结果不一致梗死^卷 6圈的优势。我们使用的自发性高血压大鼠（SHR）的菌株，因为梗死面积^比 7-10血压正常大鼠局灶性脑缺血的高血压。高血压中风感应也比较一致，可能会产生较少的死亡率比其他常用菌株^11。此外，生理参数进行监测，在整个手术，因为波动可以添加到脑梗死体积的变化，这些参数包括血压_，动脉_氧和二氧化碳含量，低温，和高血糖，可加重缺血^性损伤2,12 。低温是特别关注，因为它可以减少神经元缺血性损伤的程度，因此，放置在体温的加热垫的大鼠在手术过程中是必不可少的。

我们聘请商业化准备，企图以增加梗死面积^13-15的一致性，在此过程中硅涂层缝合。传统上，用于闭塞马华的腔内缝合已准备火焰围绕3-0尼龙缝线尖或使用热胶枪大衣与缝合的小胶^珠 16提示。这些程序产生不同的尖端直径，从而缝线，可能需要多次尝试在闭塞前找到相匹配的一个给定的大鼠血管直径的一期缝合。在这个视频中所描述的缺血方法上的其他变化包括更远端闭塞，为了有一个^纯皮质梗死17，MCA及同侧颈总动脉同时闭塞^减少侧支血流6,9不遗余力豆纹分行。

可以使用多种行为测试，在赤字的具体任务是体现在一个简单的评分量表评估中风的功能效应。例如，Bederson 等¹⁸开发的一个神经功能评分分级大鼠前肢屈曲程度升高身体的位置，不对称性横向推，和开放的领域，盘旋行为。大鼠升高，表现出没有其他的赤字时，两个前肢扩展到地板被评为“正常（0）”，而对侧前肢屈曲大鼠只与“温和的赤字（1）”分类。 “严重级”老鼠显示对侧阻力下降到侧向力和“严重级”老鼠另外，在盘旋的行为。总是观察到，在未来更高档次低年级的行为缺陷（例如，2级和3只动物，也显示前肢屈曲），这些成绩是在预测梗死^面积的18差异。因此，这样一个简单的评分系统，可以快速，一致的半定量评估中风的功能赤字。

通常是通过使用TTC，甲酚紫（尼氏染色）或苏木精和曙红的组织损伤的组织学染色测量脑梗死的程度。磁共振成像技术，包括扩散加权MRI可视化在早期的时间点梗死闭塞后，允许在每一个人的大鼠梗死体积的决心没有收获组织的需要。旨在确定神经保护治疗中风后的疗效的研究，这是特别有价值的成像MCAO后大鼠，但之前的治疗管理，使研究者的信心，所有实验组和对照动物都经历过类似的招启动，减少变异的混杂影响中风的感应。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Nylon suture	Doccol Corporation		2-3 mm silicon coating length, 0.39 mm tip diameter
Spontaneously hypertensive rats	Charles River Laboratories		290-300 g, male
Gaymar T/Pump thermoregulatory pump and pads	Gaymar Industries
Vetroson V-10 bipolar electrosurgical unit	Summit Hill Laboratories
Germinator 500 glass bead sterilizer	CellPoint Scientific
Vasamedics Bpm2Laserflo blood perfusion monitor	TSI Inc.