需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。
Method Article
这个视频演示从后期果蝇蛹大脑中的主要神经文化的准备。生活文化的视图显示突起生长的钙水平使用FURA - 2和成像。
在这段视频中,我们展示了从后期果蝇蛹大脑中的主要神经文化的准备。程序开始在70-78小时puparium形成后,从动物的大脑去除。木瓜蛋白酶,在无血清生长介质中的几个洗短暂的潜伏期后孤立的大脑。在盖玻片上一个媒体下降5 UL每个大脑的机械分离的过程说明。在解离附近的SOMA的有丝分裂后神经元的轴突和树突sheered但神经细胞开始再生电镀的几个小时内进程。图像显示,在2天的现场文化。神经元继续阐述在第一周在文化进程。使用GAL4线驱动组织特异性表达GFP或RFP,如荧光标记,可以识别特定的神经元的人口文化。全细胞记录已经证明,培养的神经元形成胆碱能和GABA能突触的功能,自发主动。一个简短的视频段说明使用FURA - 2作为钙指示剂监测自发性钙瞬变和一碟培养的神经元的尼古丁诱发的钙反应的培养神经元的钙动态。这些蛹脑文化是一个有用的模型系统,在其中的遗传和药理工具可以被用来确定中央突触的形成和功能的内在和外在因素影响。
培养前一天的准备工作:
在培养一天
一,准备在层流罩酶解决方案(ES)
二。请DDM2媒体
天的培养:添加下面的补充,使DDM2
到10毫升的DMEM添加补充,只是前培养:
注 :所有计划中的文化(镀在一个单独的35毫米培养皿盖玻片,1.5毫秒/文化媒体每个大脑足够DDM2)
步骤III - VI族可以在完成非无菌实验室工作台上,并应在45分钟或更少完成。
三。蛹收集
注 :从蛹之间,我们一般使用55-78小时后puparium形成(APF)的大脑。它是从蛹年轻的脑解剖稍硬因为头部胶囊趋向崩溃,而突起生长的整体水平,是从最古老的蛹略有下降。在广- S的野生型菌株,这些阶段是公认的色素浅棕色,略微泛红的眼睛,其他地方很少颜料。
四。斩首显微镜下解剖
五,去除头部的大脑解剖显微镜下
六。视叶和酶处理去除
其余的步骤在层流罩内应该做的无菌层流罩 - 所有的地方组织暴露于空气中的步骤。
七。洗涤
八。解剖显微镜下Trituration和电镀
九。喂养细胞
收获胚胎/产后的啮齿类动物的大脑的神经细胞可以生长在原代细胞培养,他们延长突起,形成功能性突触连接。这些文化的编制方法是建立在啮齿类动物的神经元文化的研究起到了关键作用,在确定基因和环境因素参与调节突触的形成和功能的银行家和Goslin,(1991)。虽然从各种不同的物种昆虫的神经元也可以培养,从果蝇(Rohrbough等,2003)所示,形成文化功能的突触连接的唯一的昆虫神经元。神经母细胞收?...
这项工作是由美国国立卫生研究院授予NS27501 DKOD支持。授予加州大学欧文分校在霍华德休斯医学研究所教授计划通过DKOD支持这项工作提供了额外的支持。
涂布盖玻片:放置在一个60毫米的培养皿灭菌盖玻片。吸取5 UL CON /层粘连蛋白混合到每个盖玻片中心。在37℃培养箱中培养2小时。 100 UL的蒸压水冲洗3倍盖玻片。使用连接到无菌巴斯德吸管的真空。在最后一次冲洗,用血管钳拿起盖玻片和干燥双方。将盖玻片的35mm培养皿。在室温下储存长达一个月。
请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形
请求许可This article has been published
Video Coming Soon
版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有,本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。