固定体积或固定压力：失血性休克的小鼠模型

摘要

失血性休克模型已被一个可靠和可再生资源，促进与炎症和创伤后器官损害相关的信号级联反应的鉴定和了解。本文提供了相关的手术失血性休克小鼠实验过程和机械方​​面的的一步一步的说明。

摘要

这是常识，严重失血和外伤导致的不利信号事件往往造成的死亡率级联^{1，2，3，4，5，}这些信号事件也可能导致败血症和/或多个器官功能障碍（按付款当日价格计算^{）6，7，8，9，10}是至关重要的，然后进行调查，以便制定更有效的方法，以帮助遭受创伤的患者的免疫功能受到抑制和不利的信号级联的原因。这种固定式压力失血性休克（HS）程序，虽然在技术上具有挑战性，是一个优秀资源调查这些病理生理条件^{，11，12，13}在生物系统评估的进展，即系统生物学使科学界进一步了解复杂的生理网络和^蜂窝通信模式14。失血性休克已被证明是一个揭幕这些蜂窝通信模式，因为这涉及到免疫功能的重要^{工具，15，16，17，18，}可以掌握此过程！此过程也可以被用来作为一个固定的数量或固定压力的方法。我们适应这种技术在小鼠模型，以加强在先天免疫和适应性免疫功能的^{研究，19，20，21，}由于他们在小鼠体积小房协提出了独特的挑战。然而，由于许多可用的小鼠品系，这个物种的代表为研究的生物反应空前资源。 HS模型是一个重要的模型研究蜂窝移动通信的模式和系统，如激素和炎症介质系统，危险的信号，即阻尼和PAMP上调的反应，因为它会引起其他形式的冲击，从不同的^{不同的反应} 。22，23 ^，24，25转基因小鼠品系的开发和诱导生物制剂来抑制特定的信号，提出了宝贵的的机会，进一步阐明我们了解向上和向下调控的信号转导后出现严重失血^，即HS和创伤26，27 ^{，28，29，30。}

有众多的复苏方法与HS和创伤协会（R） ^{的31，32，33，34}只乳酸林格氏液（LR），等于流血量的三倍，固定体积的复苏方法是在此模型中使用研究远程器官损伤和全身性炎症，如内源性机制^{，35，36，38}这复苏的方法被证明是有效评估HS ^{和创伤38，39}影响。

研究方案

1。仪器及手术现场准备：

1。仪器准备。

所有外科手术使用的无菌技术进行。一个蓝色的手术垫和无菌战地包扎。所有的材料和工具消毒后方可使用。 6-0缝线，棉花尖端涂药，纱布，雄性3路活塞，和仪器，高压灭菌消毒。传感器，PE 50，PE - 10管，环氧乙烷灭菌。收到所有3路旋塞，注射器和针头是无菌的。

6-0缝合切成1英寸件（6件/动物），并投入小消毒袋。棉头喷头，4x4的纱布广场，雄性3路活塞投入无论是小型或中型的消毒袋和灭菌。我们的手术器械，高压灭菌消毒每天晚上。他们手术后，使用抗菌肥皂和自来水冲洗。他们被允许在一个干净的手术蓝色垫干。他们然后小心地放入灭菌袋和消毒，使用第二天。

由于传感器和油管，塑料部件，它们必须使用，即环氧乙烷气体消毒。 PE - 10管切成5寸片，摆成一个小的消毒袋。 PE - 50管被切割成18英寸的作品，并放置到中等杀菌袋。

2。手术野。

第一，要设置的手术视野，打开热珠消毒器，以确保它达到适当的温度300-350 ° F，开始手术前。然后接下来的步骤进行手术蓝色垫放在酒精抹台式。一垫，在显微镜下，其他循环加热垫的BP分析仪是位于。将无菌敷料领域的两个手术蓝色垫。填充不锈钢仪器托盘的1 / 3，用70％酒精的方式。足够使用70％乙醇，以涵盖所​​有的手术器械。使用一个单独的无菌战地包扎，并将其放置在显微镜下一个。将所有消毒，缝合线，纱布，在这个无菌领域和导管。开放消毒和缝合，不污染触摸时要小心。最好是这样做安装程序时，使用无菌手套。

2。机械设置和程序：

1。导管设置。

要设置右腿小鼠导管，用来测量BP，第一，穿上无菌手套。然后得到无菌的PE - 10油管从高压灭菌袋。抓住中间用食指和拇指留下约一英寸它们之间的油管。拉伸这只是一个位，使其直径细导管插入帮助部分油管。拉伸后的油管削减一半使用无菌剪刀。 5英寸的管材，现在应该是两件半英寸，长度约2。确保锥拉伸结束。

*请勿角度斜边太多，因为这可能会增加退出管腔的机会，通过血管壁的下部戳。

插入一个30G针头钝油管未拉伸。获取的无菌1CC注射器和一个3路阀。使用酒精擦拭消毒10CC无菌小瓶含有肝素生理盐水溶液（0.1毫升Heparin/9.9ml生理盐水）的顶部。肝素溶液0.6 - 0.7cc填充注射器。将3路，对面直接就是从男性端30G的针头和导管。填补了活塞，30G针，与肝素液管和PE - 10。确保得到系统中所有的气泡。除去所有的气泡，最有效的方法是利用重力。同时让管吊着的台式针指向地面。给手指轻弹针枢纽和气泡会浮到肝素溶液的顶部。从3路删除30G针头和消除气泡。提取液在3路到1CC注射器回，以消除任何气泡，被困在3路，3路，并重新油管。大约1CC的混合物，应留在注射器中。鼠标将收到约0.05cc 1U肝素/鼠标这种混合物约等于（冲洗导管插入时保持通畅）。完成的导管放置到与手术器械的无菌敷料领域。

要设置左腿小鼠导管遵循相同的程序与上述3路阀异常。左腿是用来绘制的血液和3路阀是不需要的。填写1CC另一个无菌注射器用肝素盐水混合物0.15 - 0.2cc。挂钩的30G针头和PE - 10 tubi吴直接1CC注射器。填写左腿导管系统与解决方案。过多的气泡，从这个系统中删除。完成导管放置到与消毒无菌敷料领域。

2。传感器设置。

挂钩无菌传感器根据微地中海规范的Digi - MED双酚A 400分析仪。将3路阀的换能器两端。乳酸林格氏液（LR）填写一个10CC的注射器，将它附加到3路，使换能器将趴在台式平。一个23G的针头插入的预切一块18英寸presterilized PE - 50管两端。 10CC的注射器连接的PE - 50管的一端连接到3路。填写三路与LR和PE - 50设置。确保所有气泡在上一节所描述的系统。重新装上传感器和3路，填补传感器和^第二 LR 3。最后，将金属雄性leur锁活塞附件右腿小鼠导管管材PE - 50 23G针。

*流体传感器仍然在运转时，它是至关重要的。

*校准和零程序，根据微MED协议。

3。手术和实验程序：

1。外科手术。

首先管理Pentobarbitol钠腹腔注射（Nembutol）（70mg/kg @ 1:10稀释）。完成此过程，首先，从它的笼子里使用它的尾巴的基地（最近端）采摘鼠标。接下来，放在笼子顶部的动物，同时仍持有它的尾巴。鼠标，仅仅落后的前爪两侧用大拇指和中指抓住鼠标的颈背。食指是用来拉头/颈部皮肤对颈背固定头部。鼠标的尾部，然后包裹，和小指和无名指之间举行无名指同时按下鼠标的脊椎腰椎地区。鼠标应在5分钟之内睡着了。后动物麻醉到手术的金属板到位，在仰卧位。宽松循环磁带技术是用来固定用胶带其四肢的动物。宽松的循环技术需要简单地切细条状的磁带和松散的环绕着每个脱颖而出四肢伪劣的爪子，和周围的劣势后肢足跖每个磁带。磁带，然后停留本身超过磁带的左侧连接到电路板。这使得小鼠的四肢，以承担更自然的解剖位置。动物的腹部和腹股沟区，然后使用奥斯特A5的快船大小40刀片剃。一个4x4纱布浇上用优碘，然后消灭无菌手术区。

固定和灭菌后，与异氟醚1CC的鼻锥放置了几秒钟，然后才作出最初的切口对老鼠的鼻子。鼻锥由一个50CC的锥形管，用纱布填充。切出的试管底部的一半是创建一个鼠标的鼻子内休息无接触的空间。 50CC锥形年底被放在一个上限（组织储存容器的底部），以确保异氟醚蒸气，不逃避。一旦动物的呼吸开始放慢，是一个4 - 5mm的小切口，在皮肤平行内部的左腹部和左横abdominus肌斜肌。股静脉和动脉夹层如下。确保不破坏周围的肌肉或触摸神经。要开始剥离，单独从斜肌和腹横肌，抓住与腹部连接dumonts的脂肪组织的脂肪组织。这个组织拉离肌壁。然后，生硬的解剖一起戏弄了筋膜和脂肪组织中，使用其他dumonts对腹肌​​。仅仅在于脂肪组织下这股静脉，股神经和动脉。

*请务必不要损坏股intermedius，内侧和外侧肌肉，股四头肌或股直肌。实在是没有必要抢，甚至触摸这些肌肉。

*不要触摸股神经

敛在于它旁边的脂肪组织，神经解剖走。这个组织的横向拉的静脉和动脉和神经，因为它是在这个组织中。由于神经横向拉，钝性解剖筋膜，点向下放置其他dumonts，对动脉开放和关闭它们。船只是非常肤浅的，所以一定不要深入底层的肌肉。神经分离后，使用的dumonts分离筋膜肌肉血管。保持dumonts封闭滑dumonts背船只。 dumonts的尖端出现在另一侧的静脉，打开他们生硬的解剖筋膜。保持dumonts背的船只，并抢了先缝合。放入dumonts缝合和拉之间的血管和肌肉底层的开放缝合。同样，也没有必要以损害任何周围的肌肉。

共3，6-0缝线周围放置的静脉和动脉。缝合1是最近端腹肌。打结，但离开它松散和止血。凹边缘的止血钳，应由动物的腹腔。缝合2位置最远端。这种缝合线可连接立即结扎血管和hemostated，凹侧再次下跌。远端和近端的缝合线是用来拉绷紧的船只（防止失血），并解除他们有点帮助导管插入。缝合3是一个导管支持缝合。把这个之间的远端和近端缝合的缝合。把一个松散的结，将导管插入血管内后用于保护。后缝合是安全的，确定由厚血管壁的动脉。这是很白。制作一个小切口动脉顶端用microscissors。请远端缝合关闭这个洞，所以有充裕的金额最初的导管插入动脉。使用dumonts打开放到动脉血管管腔的dumonts的一端，并关闭在血管壁孔。可以肯定的中间缝合，因此它可以用来装到位后首次插入导管的近端动脉孔。按住动脉管壁，管腔推入导管，在导管的拉动船只。轻轻地配合了中间支撑的缝合固定到位导管。释放近端止血。这个版本将放松近端缝合，重新缝合血管周围。此时，动脉血压应推回血进入导管。应在导管中可见的血液脉动。杜蒙一个导管周围的血管和使用其他导管推入约4 - 5mm的船只。控股导管周围的血管，有助于防止动脉撕裂。导管尖端下方内部的倾斜和横向abdominus肌肉休息。预防血液凝块在动脉线，撤出导管进入血液，并把它放回鼠标多次注入肝素液。为双侧股动脉插管的另一条腿重复此过程。钩动物的生理参数监护仪，即双酚A - 400分析仪和冲洗动脉行。手术开放，保持周围组织湿润放入无菌生理盐水1或2滴。一定要保持这方面的整个过程中饱和。将动物的整个过程，以帮助保持无菌敷料，无菌领域。

手术器械放入70％酒精，并用无菌纱布。放入热珠〜20秒的灭菌消毒与动物之间。取出手术器械，并用70％酒精喷洒，以帮助他们冷静下来。放置到无菌垫。确保有左无酒精的文书，将滴灌进入下一个动物。

2。失血性休克。

超过15分钟。时间表，约1 / 2鼠标的血容量被撤回，实现了平均2832毫米汞动脉压。

*对于2527克鼠标的初始音量，以达到所需的压力撤回血液约0.6cc

此过程是一个固定的压力的方法，而不是一个固定的量。这些程序可以，但是应遵循固定的压力和固定量的出血。虽然始终被​​监控，动物将保持在1.5 -3小时失血性休克。由于动物试图弥补和平均动脉压开始略有回升（通过BP /人力资源分析仪可见）撤出更多的血液，以达到所需的压力。虽然很少在房协的过程中需要补充（0.05cc Nembutol IP），动物的呼吸，运动晶须，反射测试，和数字的BP / HR阅读，将有助于确定何时需要动物麻醉的补充。动物保持灯泡和循环加热垫，以帮助保持温度36-37 ° C到失血性休克过程。温度是通过直肠探头检查。

3。复苏。

后震荡时间elapsES，动物复活（R）的使用乳酸林格（LR）在一个固定体积的3倍每个动物的流血量的解决方案。土地注册处卷管理，通过设置，免除注射泵，以恒定速率，超过15分钟的量。间隔。取下导管结扎3缝线使用的船只。刚刚过去的近端缝合拉导管和配合这个缝合完全关闭。这将防止任何失血。侧支循环，防止缺血后肢。

4。邮政Rescitation。

后ř两个后肢开口缝起来使用无菌4-0 PDSII缝合。宽松循环磁带被删除，动物被放置到一个干净的笼子里，这是保存在几个小时后恢复循环加热垫。动物开始从麻醉中唤醒，妥善管理疼痛，镇痛，必须管理。丁丙诺啡（为0.1mg/kg）皮下注射动物开始的体力活动，但不前，所以不会危及呼吸功能。使用积极的手术后监测IACUC批准的协议，动物个体的行为，和目前的医疗条件保证的建议。

4。成功的秘密：

1. 当解剖的船只，可千万不要触摸股神经
2. 注意不要损伤股直肌，腹直肌外侧，股内侧肌肉。实在是没有必要抢，甚至触摸这些肌肉。
3. 不要使导管太锋利，因为这锥角会导致退出管腔导管和不受控制的出血
4. 请一定要采取额外的努力，保持尽可能无菌。
5. 确保有任何导管或传感器系统无气泡。
6. 确保有LR在传感器的液体，而它在操作。试运行可能会损害您的BP系统。
7. 使小动脉孔。
8. 使动脉孔关闭远端缝合。
9. 推同时拉动船只超过它，以避免翻录动脉导管插入导管。
10. 一定要保持在饱和用无菌生理盐水，以防止不受控制的组织损伤或液体流失腿手术开口。
11. 耐心和技巧是至关重要的。
12. 整个实验过程中密切注意动物的生理。

5。发布执行的担忧：

1. 检查中腿部缺血。虽然抵押品的流动应防止这种情况。
2. 动物可能有麻烦，手术操作及相关炎症的结果作为使用后肢。管理适当的疼痛。
3. 触摸和随后破坏的神经可能会导致动物无法调动。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
仪器	制造商	目录编号
Dumonts（SS/45 °角0.2x0.12mm尖，13.5厘米长度）	精细科学的工具	11203-25
手术剪（直- 12CM）	精细科学的工具	14068-12
止血（曲12.5厘米）	精细科学的工具	13009-12
Microscissors（春季剪刀直- 8CM）	精细科学的工具	15000-00
钳（0.8毫米尖，弯- 10CM）	精细科学的工具	11050-10
缝合卷轴6-0	精细科学的工具	18020-60
缝合4-0 PDSII	宾夕法尼亚大学兽医	ETHZ304H
纱布的4x4	可以通过购买任何全球供应商
棉花尖端涂药	可以通过购买任何全球供应商
30G针	可以通过购买任何全球供应商
23G针	可以通过购买任何全球供应商
3CC针筒	可以通过购买任何全球供应商
5CC针筒	可以通过购买任何全球供应商
10CC的注射器	可以通过购买任何全球供应商
50CC锥形管	可以通过购买任何全球供应商
1CC注射器W / 25G针	Fisher Scientific则	14-826-88
100 10聚乙烯管材（PE - 10）	Fisher Scientific则	14 - 170 - 12P
50聚乙烯管材100`（PE - 50）	Fisher Scientific则	14 - 170 - 12B
3路阀	Fisher Scientific则	NC9779127
手术蓝色垫	Fisher Scientific则	50-7105
无菌区敷料	Fisher Scientific则	NC9517505
磁带卷1“	公司快递	MMM26001
直边宽口罐（用于鼻锥帽）	VWR	159000-058
不锈钢托盘8“× 11”	VWR	62687-049
雄性leur锁3路	VWR	20068-909
消毒袋3“X8”	VWR	24008
消毒袋5“X10”	VWR	24010
野生M650显微镜W /热潮立场	徕卡
徕卡IC D数字相机/实时图像	徕卡
从DIGI - MED双酚A - 400分析仪及系统集成商	微地中海	SYS - 400
TXD - 310（从DIGI - MED传感器）	微地中海	TXD - 300
电脑	戴尔
热珠仪器消毒柜	VWR	18000-45
奥斯特A5的快船瓦特尺寸40刀片	VWR	10749-020
循环heatin克垫18x26	哈佛	py872 - 5272
直肠温度计	肯特科学	RET - 3

试剂	集中	制造商	目录编号
戊巴比妥钠（Nembutol钠溶液）	70mg/kg	鼓掌
丁丙诺啡盐酸	为0.1mg/kg	贝德福德实验室
乳酸钠林格注射液250毫升输液袋	巴克斯特
Aerrane（异氟醚）	99.9％	NLS动物健康	105996
肝素钠	1000U	Abraxis药厂
氯化抑菌钠	0.9％	Hospira公司
乙醇	70％	药物AAPER
Triadine聚维酮碘（优碘）		三合会一次性