在分离的小鼠使用红桃心功能和能量学的评估 31 P核磁共振

摘要

离体心脏灌流的Langendorff -模式，配合 ³¹ P核磁共振光谱，结合成一个实验生物化学和生理学等领域。该协议允许动态测量高能磷酸含量和心的同时监测生理功能的营业额。当正确执行，这是一个有价值的技术评估心脏能量。

摘要

生物工程小鼠模型已成为强大的研究工具，在确定分子改变和心血管疾病的模型之间的因果关系。虽然分子生物学识别信号转导通路中的关键变化是必要的，它是不是功能意义的替代品。虽然生理功能的问题提供答案，在完整的生理生化代谢物评估相结合，跳动的心脏，使心脏功能和能量的一个完整的画面。多年来，我们的实验室已利用离体心脏灌注核磁共振（NMR）谱相结合来完成这项任务。左室功能评估的Langendorff模式离体心脏灌注，而心脏的能量是通过执行计量

研究方案

1. 对于这些实验，同时利用两个独立的系统。收购^31个P谱，布鲁克14T磁铁与AVANCE III控制台和与Topspin V2.1的软件配备计算机接口。评估心脏功能，自定义的内置心脏灌流系统接口与PowerLab系统4 / 30数据采集与数据分析软件的LabChartPro 6配备，。
2. 在实验的当天，1公升克雷布斯- Henseleit缓冲准备如下：0.5MM EDTA，5.3mM氯化钾，1.2mm _的硫酸镁，118mM氯化钠， _碳酸氢钠 3和25mm 。然后将混合物冒泡5％CO ₂ / 95％直径为2mm的_氯化钙此外前10-15分钟_2。最后，基板，在10毫米的葡萄糖和0.5mm丙酮酸形式，添加。
3. 在实验过程中的温度调节是至关重要的。加热循环器是用来保持温度之间的37.0 - 37.5 ° C，而心内的磁铁。温度监控使用光纤温度探测器实验的持续时间。
4. 灌注压和左心室压力，通过压力传感器连接到一个数据采集系统，并使用附带的软件显示监测。这些都与实验前的标准血压计校准。此外，压线刷新充分，以消除所有气泡。
5. 150 mM磷酸钠（这是等同的KH缓冲液的离子强度）的一个标准样本是使用“校准”前探头插入心脏。这有利于信号，并降低所需的时间开始收购期间，一旦心脏内的探针定位。
6. 为了减少凝血，鼠标注入200个单位的肝素的IP 5分钟后，戊巴比妥钠（175毫克/公斤）的IP。
7. 心是迅速切除（完好的肺和胸腺），在冰冷的KH缓冲被捕。
8. 虽然放在冰上，迅速取出肺。胸腺叶，轻轻去皮暴露主动脉。胸腺是删除。主动脉，然后小心删除任何周围组织分离。
9. 微缝合钳轻轻托起主动脉两个墙壁暴露管腔。主动脉小心放置到0.965毫米外径的聚乙烯管（PE50）的套管。而缝线快速主动脉周围捆绑主动脉微血管钳举行到位。剪辑被删除，使用镊子仔细检查，主动脉根部以上的套管。其他关系添加必要时举行的地方心。
10. 使用镊子和microscissors删除任何额外的组织。一个小切口进入左耳廓。通过左心房，左室腔，并通过心尖同时轻轻地捧着心，仔细插入一个0.61毫米外径的聚乙烯管（PE10）。修剪多余的油管。
11. 泄了气的充满水的气球是通过心房插入到LV，是在使用胶带或缝合的地方举行。蠕动泵的速度正在逐步增加，以提供足够的流向心脏。直到心入NMR探头的地方，心将继续与恒定流量相当于约2毫升/分钟灌注。 LV气球充气使用微米注射器验证，LV压力传感器运作的一个小体积。
12. 仔细插入心脏是一个10毫米的核磁共振管。一个大口径的“微调”，是用来帮助引导到适当的位置内的探头管。整个装置是牢固地附着在“脐带”，用胶带。
13. 脐带慢慢降低到磁铁上孔，直到心/核磁共振管内10毫米NMR探头的线圈。
14. 一旦心脏是在探头内的适当位置，蠕动泵，流量调整，从而实现了灌注压80mmHg。 （请记住，到这一点心了约2毫升/分钟的流量恒定灌注）。然后灌注压维持使泵的控制器上的“持有”机制。然后让心脏是一个15-20分钟的平衡时间。那段时间，LV的气球的体积是调整，以达到8-10毫米汞柱，舒张末期压力。
15. 在平衡期，这是必要的优化谱仪参数，以获得最好的磷信号。这是通过设置在磷原子核产生共鸣的频率（“调整”）的无线电脉冲磁场同质（“垫片”）。
16. 平衡时间后，多个^31个P NMR谱可以得到。收购期间每个频谱是依赖于T他的磁铁磁场强度的样本大小，和一个特定的实验所需的信噪比的信号。谱得到使用14 Telsa磁铁平均获得256 60度翻转角和2.0秒的延迟20微秒的无线电频率脉冲信号。本实验将需要大约10分钟。

代表性的成果

从数据采集的硬件和LabChart软件，可以测量心脏功能的几个参数，在整个实验的协议。典型的测量心脏功能，左心室发展压（LVDevP），是通过减去舒张末压（EDP）的收缩压（图1）。这项措施可以改变鼠标的应变和心脏的条件（即压力超负荷）而定。然而，在一个正常C57BL6小鼠心脏LVDevP通常固定舒张末期8-10毫米汞柱的压力在100-110毫米汞柱之间。此外，LabChart程序允许基于LV压力波循环测量心率的测量。同样，这一措施可以有所不同，但典型值350-400 BPM时，心中都允许击败内在率。然而，心可使用心率保持在420 BPM的起搏系统标准化。此外，收缩（+ DP / DT）和放松（-dP/dt）的措施，可使用的LV压力波的一阶导数估计。在实验的协议，很容易评估纳入一个压力 - 体积关系德裕机制。这是通过在LV气球体积逐渐增加，并注意到LVDevP以及电算化。这些值可以被绘制成图2所示。虽然德裕曲线是最优的，注意到量要达到8-10毫米汞柱的EDP可以给一个低压室尺寸的间接的想法。这可以用来肥大心中绑扎主动脉模型中，通常需要一个气球体积较小，而扩张型心需要一个体积较大，与对照组相比。表1显示了代表心脏功能灌注协议中获得的数据。

^31个P核磁共振波谱仪将提供信号的磷酸（PCR）和ATP（γ- ATP，α- ATP和β- ATP）以及无机磷（PI），如图2所示的三个磷酸盐。每个峰的分析提供了价值曲线下的面积。 ATP的量估计平均γ- ATP和β- ATP的地区。 （α- ATP不使用NAD分子作出贡献，因为一个总信号的未知部分）。 PCR和ATP地区（PCR：ATP的比例）的商数，是由心脏的充满活力的状态。该值通常为1.5 - 1.7葡萄糖作为主基板提供了一个小鼠心脏。 ^{31 P} NMR虽然不提供直接ATP或PCR措施，峰的面积是含有样品中的化合物磷的量成正比。这些信号的估计值可以通过使用其他方法。例如，可以产生ATP的直接措施，高性能液体色谱法（HPLC）在心中的队列的平均浓度。这个值可以被用来校正光谱中观察到的平均ATP领域。 PCR的浓度可以计算基于PCR的ATP区面积的相对。它也可以通过分析信号（PI）的无机磷的相对化学位移PCR信号估计的pH值。使用不同的无线电脉冲序列，肌酸激酶反应速度或ATP的合成反应速度还可以^进行测量2。

表1。基准从离体心脏的心脏功能。 LVDevP：左心室发展压力; LVEDP：左室舒张末压; HR：心率; RPP：利率的压力产品; + DP / DT：一阶导数的LV压力积极; -dP/dt：第一个衍生LV的压力负，PP灌注压; CF：冠脉流量。

图1。代表LV LabChart Pro软件的压力波。

图2：从控制（实线）和主动脉带状（虚线）小鼠的代表德裕曲线。一）确定的LV气球的体积收缩功能，提高左室容积LVDevP代表。二）舒张功能，提高左室容积电算化代表由LV的气球的体积决定。 LVDevP：左心室发展压（收缩压减去舒张压pressure）;电算化：舒张末压。

图3，代表^31个P NMR谱的离体小鼠心脏。请注意相对较小的PI峰。除了葡萄糖丙酮酸或脂肪酸提供的有氧灌注心脏，这个峰值应该不大。在缺血期间，此峰的增加，而PCR高峰下降。注意肩膀α- ATP的峰权。这是NAD分子的贡献。 PI：无机磷; PCR：磷酸，三磷酸腺苷三磷酸腺苷。

讨论

^31个P核磁共振光谱的Langendorff灌注的离体小鼠心脏提供可靠和可重复性^{的数据。3，4}然而，当务之急是完成主动脉插管和LV的球囊插入正确等，让心脏功能稳定，而里面的核磁共振管。此外，温度调节，以达到适当的基线功能是最重要的的。取得了良好的，分析的核磁共振光谱中的一个重要因素是提高信噪比。要做到这一点，确保最佳的“调整”和“垫片”的样本。在协议文本中提到，使用的标准样品前插入心脏，可以促进这项工作。这也有利于有足够规模的“样品”。心称量小于100毫克，通常提供较低的PCR和ATP的信号，所以采集时间的增加，将要获得良好的磷谱。

有几种方法可以修改现有的协议，以争取更多的信息，对心脏功能和能量。在我们的实验室，我们灌注混合衬底缓冲区，其中可以包括不同的组合（低，高浓度的）的脂肪酸，乳酸，酮体，和胰岛素的存在心中。稳定同位素在灌注缓冲区的使用（即^，13 C标记的基板），我们所拥有的能力估计基质利用TCA循环标记的乙酰辅酶A的相对^贡献 。5-7对于这种应用，我们执行isotopomer ¹³的C3 - ¹³的C4 -谷氨酸与¹³ C - NMR谱分析。这就要求冻结夹紧在灌注协议结束的心脏和执行冰冻组织提取。这将是一个额外的实验分析，需要使用不同的探头具有独立设置参数。其他应用包括缓冲区脱氧葡萄糖替代，同时监测随时间变化的2 -脱氧葡萄糖磷酸中^使用的31 P核磁共振光谱的心脏的积累。这种方法允许^{7 8}此外，我们的实验室分析心脏功能和能量灌注缺血/再灌注和高工作量的挑战组成的协议^{。，6，8-10}心肌对葡萄糖的摄取测量。

总之^{，31 P} NMR光谱在小鼠离体心脏是一个技术上具有挑战性的过程，需要使用先进设备。然而，它产生的数据是非常宝贵的研究人员希望分析生物工程小鼠模型的功能和能量。我们的实验室，这些技术已在心肌功能，能量和新陈代谢的各种压力所带来的后果的认识^{至关重要。1，11} ，12

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Magnesium Sulfate	Reagent	Sigma-Aldrich	M7506
EDTA	Reagent	Sigma-Aldrich	E1644
Potassium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	P4505
Sodium bicarbonate	Reagent	Sigma-Aldrich	S6297
Sodium chloride	Reagent	Sigma-Aldrich	S7653
Calcium chloride dihydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	C5080
D-Glucose	Reagent	Sigma-Aldrich	G7528
Sodium Pyruvate	Reagent	Sigma-Aldrich	P2256
Bruker Ultrashield 600WB Plus	Equipment	Bruker Corporation
PowerLab 4/30	Equipment	ADInstruments	ML866/P
LabChart 6 Pro	Equipment	ADInstruments	MLS260/6
Quad Bridge Amp	Equipment	ADInstruments	ML224
STH Pump Controller	Equipment	ADInstruments	ML175
Minipuls 3 Peristaltic Pump	Equipment	ADInstruments	ML172
Disposable BP Transducer	Equipment	ADInstruments	MLT0699
10mm NMR Sample Tube	Equipment	Wilmad LabGlass	513-7PP-7
Polyethylene tubing PE10	Equipment	BD Biosciences	427401
Physiological Pressure Transducer	Equipment	ADInstruments	MLT844
Polyethylene tubing PE50	Equipment	BD Biosciences	427411
Micrometer syringe	Equipment	Gilmont Instruments	GS-1101
McPherson Forceps	Equipment	Miltex Inc.	18-949
Castraviejo microscissors	Equipment	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5650
Neoptix Signal Conditioner	Equipment	Neoptix, Inc.	Reflex - 1