在蚊子（埃及斑蚊）感染引起的表型测定为登革热感染病例的议定书“

摘要

一旦一个基因被确定为潜在的顽固性登革热病毒，它必须进行评估，它在防止病毒感染的蚊子作用。该协议说明登革热的蚊子感染的程度如何，可以检测。成长的文化，膜喂养蚊子人体血液中的病毒，并化验在蚊子中肠病毒滴度的技术演示。

摘要

这一程序的目的是感染登革热病毒的伊蚊，在实验室条件和研究感染病毒在蚊子的组织水平和动态。该协议是经常用于研究蚊子病毒的相互作用，特别是确定新的宿主因素，能够确定载体能力。在整个实验必须在BSL2实验室进行。类似恶性疟原虫感染，在任何时候都必须佩戴适当的服装，包括手套和白大褂。实验结束后，所接触到的病毒的所有材料需要75％的乙醇，然后再进行正常洗涤漂白处理。需要抛弃他们之前蒸压的所有其他材料。

研究方案

A.传播病毒在C6/36细胞线。

1. 细胞生长至80％，在75 ^厘米 2烧瓶汇合;
2. 删除3-4毫升的容量瓶中剩余的媒体;
3. 取0.5毫升股票病毒，到上述单元格中添加1.5％细胞的病毒颗粒的多重感染。慢慢地在室温下摇晃15分钟烧瓶。
4. 5％CO ₂和37 ° C孵育45分钟
5. 添加30毫升的媒体，孵育5天。

B.准备病毒和血液的混合物

1. 用刮板的细胞分离，细胞和媒体转移到50 ml锥形管;
2. 离心10分钟;在800克收集上清液，细胞沉淀，但保留上清1毫升;
3. 冻结上述细胞沉淀在干燥的CO _2，然后在37℃水浴，重复两到三次中解冻;
4. 800克为10分钟，离心取上清液，并结合从第3步收集上清;
5. 收集与编制配子体文化感染与恶性疟原虫的按蚊蚊子相同的步骤（步骤3）整个人类的血液;
6. 结合上述整个人体血液中病毒从第4步上清的平等，并加入人血清（整个体积的10％）。
7. 30分钟，在37℃水浴孵育上述混合物对人体血液和登革热病毒

C.喂养蚊子

此过程一直在恶性疟原虫在蚊子感染的部分描述几乎是相同的。在第7天，我们检测肠病毒感染，吸血后第14天的唾液感染。在与病毒接触的所有材料的处理，首先用75％乙醇，然后用10％漂白粉。

D.含量的蚊子组织中的病毒滴度

1. 蚊子组织清扫术前两三天，增长C6/36细胞在24孔板的细胞达到80％，在检测时进行一天的汇合;
2. 蚊子麻醉在4 ° C时，75％的乙醇浸泡1分钟，无菌牺牲浮出水面。蚊子肠或唾液腺解剖解剖显微镜下用无菌水冲洗，前两次。在此步骤中，所有下面的程序需要在无菌的环境，如生物安全柜中进行。这些组织被转移到管内含有150μL媒体和匀浆一个Kontes颗粒杵电机为90秒;
3. 10匀浆液加入到990μL媒体1:100稀释;
4. 使进一步的1：10，1:100和1:1000稀释介质，在96孔板;
5. 媒体在24孔板中删除，并添加100μL上述四个稀释，每年每个相应的井;
6. 板块缓慢摇动15分钟，在室温下孵育45分钟，然后在5％，CO ₂和37℃;
7. methycellulose叠加（1％）加1ml到每口井;
8. 板在37 ° C的5％的_CO 2为5天;
9. 从这里开始的步骤并不需要无菌的环境，但应在任何时候都采取与任何其他的病原体护理。丢弃从每个板块methycellulose覆盖和污点去除多余媒体
10. 添加甲醇/丙酮固定液（1:1）1ml到​​每口井。在4 ° C为1小时保持;
11. 倒掉固定液，用1X PBS清洗一次;
12. 1:1000稀释的5％烂醉的对抗病毒的抗体;
13. 200μL稀释高免液添加到每个井，37孵育° C为1小时;
14. 删除高免1 × PBS液和洗板
15. 准备在5％烂醉的（5G脱脂牛奶100毫升为1 × PBS）1:1000稀释的羊抗鼠共轭（嘉里建设猫＃074-1806），然后每孔加入200μl，孵育37℃1小时;
16. 准备基板如下：1 3' -二氨基terrahydrochloride片剂（西格玛猫＃D5905），添加20毫升1 × PBS，溶解后，再加入8μL30％的氢过氧化物酶
17. 每孔加入200μL上述基板。让我们在室温下站10分钟
18. 取出的基材，并停止加入蒸馏水1ml到每口井的反应
19. 倒入水和杂交板干
20. 计数的病毒粒子

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator				with 5% CO2, 37oC
50 ml conical tubes				plastic
human serum and blood				O+
pipette tip				for tissue culture
pipettman
Pasteur pipetts				glass, sterile
water bath				37C
centrifuge
parafilm
circulating water bath
glass membrane feeders				with rubber tubing to fit feeders
mosquito cups
75% ethanol
10% bleach
Tissue-culture plates				6-well, 24-well and 96-well plates
Petri dish				glass
Slides
fine-tip forceps
PBS				1X, sterile
dissecting microscope	Microscope
C6/36 cells	cells			For virus propagation
C6/36 medium				MEM with 10% heat inactivated FBS, 1% L-glutamine and non-essential amino acid and 1% (v/v) Penicillin-Streptomycin.
3’-Diaminobenzidine terrahydrochloride		Sigma-Aldrich	D5905	1 tablet in 20 ml of 1 X PBS, dissolve and then add 8 μl of 30% hydrogen peroxidase
30% hydrogen peroxidase
A. aegypti	Animal			mosquito