斑马鱼为基础的大型在体内小分子屏幕

摘要

斑马鱼已成为一个强大的在体内表型为基础的药物屏幕和化学遗传分析平台。在这里，我们展示了一个简单，实用的方法大规模使用斑马鱼的胚胎小分子筛选。

摘要

鉴于他们的小胚胎的大小，快速发展，透明度，繁殖力，以及众多的分子，形态和生理上的相似性，对哺乳动物，已经成为一个强大的斑马鱼

研究方案

1）斑马鱼的卵收集

1. 化学屏幕一天前的下午，成立10到20的斑马鱼的繁殖坦克。每个水箱装满水从水产养殖系统。使用渔网，将一个成年男性和一到两个成年女性在每个养殖池的内部容器。独立分频器从对方的男性和女性的鱼。标签的笼子，并把他们的盖子。
2. 在屏幕上午上，删除从养殖池的分隔，使斑马鱼进行交配。在未来1小时的课程，让受精卵通过电网秋天在每个内部容器的底部。
3. 1小时后，返回成年斑马鱼永久储存罐，取出内部容器，收集鸡蛋，使劲在每个养殖池的水通过塑料茶滤网。
4. 反转培养皿中的过滤器和冲洗过滤网轻轻培养皿中，通过使用一个洗瓶的E3媒体冲入鸡蛋。
5. 所有未受精卵，从而出现不透明的，应予删除，使用一次性塑料吸管。每次交配交应产生大约200个胚胎。

2）阵列胚胎在96孔板

1. 约5到每一个使用玻璃巴斯德吸管96孔板以及胚胎在E3介质的转移。
2. 一旦胚胎在96孔板上摆着，消除可能使用12个通道（30 - 300μL）井出的E3媒体的吸管，小心不要穿刺胚胎。使用12道移液器，可提供250μL的E3中每个含有0.5μg/ml卡那霉素以及尽快，以免使胚胎干起来。
3. 28.5 °彗星孵化器放入96孔板时要添加的化合物，直到他们达到预期的阶段。

3）转让的小分子库

而化合物转移可自动化与机器人的传输方法，我们将介绍的手动传输方式。

1. 小分子库通常在96孔板格式提供，与存储在DMSO为10毫米的股票每个化合物。约60分钟前胚胎到达时，该化合物是无以复加的阶段，解冻所需数量的96等分的小分子（源盘）板。请注意源板的串行或其他识别号码。为了尽量减少对板凝结，解冻可以发生在一个干燥室，含Drierite（WA HAMMOND DRIERITE，森雅，）。
2. 在配备多孔板适配器桌面离心机简单自旋向下的板块。
3. 从源盘取出铝箔封口胶带。使用12通道移液器，稀释浓度为0.5毫米（例如，如果250 NL等分10mm的股票开始，添加4.75μL二甲基亚砜，每孔）在源盘的化合物。
4. 当胚胎在96孔板（收件人板）达到预期的阶段，使用12个通道（2-20μL）移液器从源头上板转移到收件人板块2.5μL化合物（0.5MM）胚胎。
5. 记录收件人胚胎板源板的识别号码。现在包含有盖的胚胎和化合物包括收件人板，轻轻混匀，轻轻摇动板，并放置在28.5 ° C培养箱。
6. 封面每个源板，铝箔封口胶带和一个-80℃长期储存的冷冻含有未使用的小分子（0.5毫米）。

4）为小分子的影响，通过目视检查表型的筛选

1. 执行屏幕前，制定一个什么构成一个“打”的具体标准。
2. 在发展中所需的时间从孵化器中含有复合处理的胚胎，取出96孔板和立体显微镜下检查每口井。微妙的变化，如在循环模式的转变，对于更好的可视化，一个相衬倒置显微镜下可以使用。荧光显微镜可用于研究组织特异性启动子的绿色荧光蛋白或DsRed的蛋白表达的扰动。
3. 快速扫描以及其中至少3 5胚胎展出规定“砸”表型的96孔板。记录板，和每一个潜在的冲击以及位置的身份。
4. 再次确认由复检几个剂量（1微米，5微米，10μm和50微米）的复合型的影响，一个潜在的冲击。每个剂量，10个胚胎在0.5毫升在48孔板格式的E3媒体测试。复方此外复检的时间应该是相同的的原筛查。一击确认复检的compoun转载时引起的表型ð
5. 确定从的小分子化学库中的数据库的命中化合物。

讨论

规划斑马鱼为基础的化学屏幕时，必须特别注意​​正在审议的表型，这种表型的背景率的稳健性。诱导表型的化学抑制器的屏幕，这一点尤为重要。例如，对于引起热休克诱导转基因表型，导致表型的条件下再现，必须精确地映射出启动屏幕前，以避免不可接受的高误报率。通过精心规划，斑马鱼化工屏幕，这就需要适度的资本投资，可能会导致的细胞信号转导和生理的新型调制器的发现，以?...

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