分析甲基化和其他 S腺苷 L同型半胱氨酸结合蛋白

摘要

捕获化合物三官能团的小分子功能可逆的光交联和净化的小分子蛋白质的相互作用，以减少蛋白质组的复杂性。在这里，我们使用捕捉化合物 S腺苷 _L同型半胱氨酸具有约束力的选择性功能，从一个孤立的甲基化大肠埃希氏菌全细胞裂解液，并确定由MS。

摘要

的方法有多种功能的小分子蛋白质的相互作用，如亲^和层析¹或2活动的蛋白质分析的基础上，以减少对蛋白质组的复杂性。三官能捕捉化合物（CCS，图^1A）3是一种通用方法的基础上，在初始均衡驱动的一个小分子探针（选择性的功能，这里的S _-腺苷- L -同型半胱氨酸，蛛网膜下腔出血，图1A）之间的相互作用和靶蛋白是不可逆转地固定在一个独立的光激活的反应功能（这里phenylazide）消委会与靶蛋白的表面之间光交联。排序功能（生物素）提供隔离的CC - 蛋白结合物从复杂生物混合物固相（这里的链霉亲和素磁珠）的帮助。实验的两个配置是可能的：“离珠^”4或目前所描述的的“珠”的配置（图1B）。选择性功能，可几乎所有感兴趣的小分子（底物，抑制剂，药物分子）。

S -腺苷_- L -蛋氨酸（SAM，图1A）是可能的，第二个ATP， ^{性质5，6，}使用最广泛的辅助因子。它是用来作为主要的甲基集团捐助SAM依赖甲基（MTases），甲基化的DNA，RNA ^的8，9蛋白质，或小^分子 10催化化学反应的所有生物体。由于甲基化反应在不同生理情况下的关键作用（基因表达调控，表观遗传学，代谢），MTases分析可以预期，成为同样重要的功能蛋白质组学分析激酶。然而，他们的分析的分析工具，没有用。我们最近推出了CC与蛛网膜下腔出血选择性组，以填补这方面的技术差距（图1A）。

蛛网膜下腔出血，SAM的甲基转移后的产品，是一个已知的一般MTase ^产品抑制剂11。出于这个原因，因为天然辅酶SAM是进一步转移的辅助因子的其他部分或启动以及自由基反应的酶， ^由于其化学不稳定12，蛛网膜下腔出血是一个理想的选择性功能，为CC目标MTases。在这里，我们报告的分析MTases和其他SAH的结合蛋白从大肠杆菌（大肠杆菌），最好的特点原核生物之一，这已作为首选机型的菌株DH5αSAH - CC和CCMS系统工具在无数的生化，生物，和生物技术研究的有机体。光活化交联，提高产量和敏感性实验，可以很容易地在竞争实验，使用免费蛛网膜下腔出血超过测试和特异性。

研究方案

1）E 的制备大肠杆菌 DH5α中的细胞裂解液

1. 2ML文化（LB培养基，在试管中接种大肠杆菌） 大肠杆菌 DH5α菌株直接从甘油和孵化，在37 ° C和250 RPM为8小时使用高压灭菌的LB培养基（10克/升的细菌用蛋白胨，5 g / L酵母提取物，10 g / L的氯化钠，pH值7.5）。
2. 250毫升LB培养基接种1升摇床瓶在夜间2 mL培养和孵化挡板在37 ° C和166 RPM在与轨道摇床的孵化器。
3. 接种4个5升挡板摇床烧瓶各含250毫升文化（50毫升每个烧瓶），并培育文化，在37 ° C和166， _直到 OD 600 rpm的0.8达到2.5升LB培养基。
4. 收获的细胞在4 ° C 3000X克离心20分钟。在0-4 ° C或在冰上进行进一步的处理。
5. 重悬在Milli - Q水收获细胞的物质，结合在一个离心桶和离心机6000x克，另有30分钟和4 ° C。
6. 造成20克电池材料存放在-20 ° C或-78 ° C。
7. 重悬的细胞，在100毫升冰冷的细胞开放缓冲液（6.7 mM的MES，6.7 mM的NaOAc，6.7毫米HEPES，1毫米EDTA，10毫米β-巯基乙醇，200毫米氯化钠，pH值7.5，10％（W / V）甘油; PMSF 0.2毫米）和超声三次，四个25毫升冰使用sonifier（如SONOPULS HD 2070 BANDELIN电子有限公司＆CO。KG，最大振幅，连续输出）部分为1分钟。
8. 晚上2370x g和2 ° C，离心裂解液
9. 14毫升浓缩上清液超滤2370x g和2 ° C（例如，使用图标集线器，7 mL/9K，从皮尔斯）
10. 消耗从SAM或凝胶过滤SAH 2小分子的粘性集中℃（如则巴脱盐离心柱，10毫升，从皮尔斯;四列;存储缓冲区，在2分钟的1000倍克拆除;四次平衡，用5 mL冰冷的细胞开幕缓冲区和缓冲区中删除在2分钟的1000倍克，分别适用于3.5毫升集中每一列; 24X克45 min离心，然后两次2分钟1000倍克）
11. 补充13毫升冰冷的甘油和罗氏迷你蛋白酶抑制剂鸡尾酒片，EDTA的自由造成13毫升裂解液。混合和溶解的片剂。
12. 储存在-20 ° C的裂解
13. 确定由Bradford法（21毫克/毫升在本案中）的总蛋白浓度。布拉德福德试剂：100毫克考马斯亮蓝G - 250 50 ml 95％乙醇，加100毫升85％（W / V）磷酸溶液，稀释至1 L时，染料完全溶解，并过滤通过的Whatman＃1纸只是后方可使用。

2）捕捉含量（一），比赛控制（C），下拉（PD），竞争下拉（CPD）的控制，并结合捕获含量加下拉（通过A + PD）

1. 为捕获实验，蛛网膜下腔出血caproKit（caprotec bioanalytics有限公司），其中包括作为竞争对手，免费蛛网膜下腔出血的蛛网膜下腔出血 - CC，直径为1微米（MyOne链霉亲和素磁珠C1，Dynal公司），5X捕获缓冲区链亲​​和素包被的磁珠（5X CB，含100毫米HEPES，醋酸钾250毫米，50毫米醋酸镁和50％的甘油），和5倍洗涤缓冲液（5X世界银行，含250毫米的Tris盐酸，pH值7.5，5毫米EDTA，5 M氯化钠，42.5 μM辛基-β- _D -葡萄糖苷）。
2. 建议准备一个主水混合的几个平行实验，捕获缓冲区和 E 大肠杆菌裂解液和200μLPCR管带内执行不同的管反应（建议0.2毫升热地带，Thermo Scientific的，AB - 1114）。在这里，一个反应管的数量。 ，这是捕获法（一），竞争对照组（C），下拉（PD），竞争下拉（CPD）的控制，并结合捕获检测加下拉（通过A + PD）的五个不同的实验结果将提交。
3. 对于每一个反应，准备加入0.3毫升5X世界银行1.2毫升Milli - Q水1.5毫升1X WB。
4. 在200μL的PCR管条准备SAH - CC装的链霉菌涂层（caproBeads）磁珠。因此100微米SAH - CC 25μL，50μL10 mg / ml的链霉亲和磁珠涂每个等份混合，大力摇晃2分钟产生的悬浮物，使生物素基团的结合在室温下蛛网膜下腔出血抄送链亲和素磁珠表面，并收集使用（如使用caproMagTM磁性器件，caprotec bioanalytics公司的PCR管条上限）一个强有力的磁铁珠。丢弃上清液，再暂停200微升世界银行产生的caproBeads，磁收集caproBeads（PCR管带的帽子），并丢弃supernating世界银行。关闭管，以避免干燥的珠子。
5. 大肠杆菌DH5α整个准备等分在新的PCR管中的细胞裂解液在0-4℃使用一个主结构（见2.2）。对于一个反应，补充为一个最终的反应混合体积100μL与20μL5X CB Milli - Q水的体积。混合，加0.26毫克E。大肠杆菌裂解液，轻轻混匀颠倒。只有C和CPD，添加20μL，10毫米蛛网膜下腔出血竞争对手的解决方案，轻轻颠倒混合（Milli - Q水，而不是蛛网膜下腔出血解决方案添加一个，PD，并通过A + PD的）。绘制一个从1μL样品作进一步的分析（见下文）。
6. 暂停的caproBeads在各自的裂解液和孵育3小时，4 ° C轮流保持悬浮液中的珠子允许SAH的结合蛋白可逆结合蛛网膜下腔出血的蛛网膜下腔出血，消委会的选择性功能。
7. 将悬浮液A，C在caproBoxTM通过A + PD（照射紫外线，同时冷却，caprotec bioanalytics公司生化样品设备），并在0-4之间的封闭管的总时间为30分钟照射° C SAH - CC的反应蛛网膜下腔出血的结合蛋白的功能，形成共价交联。因此，除去悬浮液后2.5分钟的照射间隔，分别从caproBoxTM，在冰水中冷却〜15秒（尤其是眼皮），颠倒混合数次，很快（2）离心机除去悬浮其余在盖，和未来的照射间隔成的caproBoxTM。
8. 添加20微升10毫米SAH的解决方案，或20微升Milli - Q水，PD，持续专业发展，并通过A + PD的孵育暂停10分钟，在4 ° C至取代，在A，蛛网膜下腔出血未交联蛋白SAH - CC。悬浮液中保持旋转或间歇性的手动重悬珠。
9. 收集的悬浮液，用一个强有力的磁铁（如caproMagTM）caproBeads，弃上清，洗珠六倍 - 200μL1X世界银行和一次用200微升Milli - Q水 - 再悬浮和收集。
10. 珠子可以存储几个星期在4 ° C，在Milli - Q水替代协议存在进一步处理捕获的蛋白质和他们的身份（见讨论）。
11. 洗磁珠200μL60％乙腈（ACN）的3倍和10分钟在室温下用200μL的60％ACN/0.2％三氟乙酸（TFA）的大力摇晃孵化释放从磁珠捕获的蛋白质（准备新鲜） 。使用LC - MS级试剂和水。
12. 防磁收集珠子，分离，上清液蒸发干燥，使用离心式蒸发器（如MiVac GeneVac公司，英国的DNA浓缩）。丢弃的珠子。

3）捕获蛋白的SDS - PAGE

1. 进行SDS - PAGE，溶解在20μLSDS上样缓冲液（50毫米的Tris盐酸，320毫米β-巯基乙醇，2.5％SDS，0.05％溴酚蓝（蒸发乙腈/ TFA的解决方案，从步骤2.12）从磁珠捕获释放的蛋白质10％甘油，pH值6.8）。混合1μL样品（见步骤2.5）19μL的SDS样品缓冲绘制; 5μL此解决方案用于SDS - PAGE分析（0.25％）含量测定​​。在SDS样品缓冲液10分钟的样本加热至95 ° C，并让让冷却到室温。
2. 经SDS - PAGE（通用设置：OLS ® ProPage 4-20％的Tris /甘氨酸预制凝胶; OLS的OMNIPAGE迷你凝胶电泳系统; SDS电泳缓冲液：Tris碱25毫米200毫米甘氨酸，0.1％SDS，pH值8.3分析运行在180 V恒压冰下的SDS电泳缓冲液的冷却时间90分钟）。
3. 银染凝胶使用的MS兼容的银染方法（如ProteoSilver银染色试剂盒购自Sigma）。一个代表性的结果如图2所示。

4）在凝胶胰蛋白酶的蛋白质和肽的提取精华，从凝胶带

1. 洗银染凝胶至少三次100毫升的Milli - Q水10分钟后，银染一站式解决方案是删除。
2. 切出的凝胶带（例如，使用一个干净的手术刀和转移到0.5 mL Eppendorf管）并储存在-20 ° C或直接处理。洗为15分钟的凝胶带，分别与100μL水，100μL50％乙醇，100μL水，100μL，50％的乙醇和纯乙醇为5分钟。再次重复这个洗涤过程。
3. 重新水合物与10μL凝胶消化解决方案的凝胶带（12.5 ng /μL的测序级胰蛋白酶在50 mM的碳酸氢铵，准备在1毫米的盐酸中加入7.5μL，0.5μg/μL的胰蛋白酶溶液292.5微升50毫米碳酸氢铵）在4 ° C 45分钟去除上清液，并取代20μL50 mM的碳酸氢铵其次是潜伏期在37℃以上的晚上，一阵晃动（不含胰蛋白酶）。
4. 收集上清。肽的提取，孵育20微升5％甲酸（FA）的凝胶带为15分钟，而晃动，加20μL的乙腈和另外15分钟的孵育一阵晃动。结合以前的上清上清，再次重复肽的提取过程。
5. 结合三个上清蒸发至干，溶解在10μL5％FA，而晃动和应用超声检查（超声浴，例如从Bandelin Sonorex，德国）和进行脱盐（5.2步骤和进一步）。

5）捕获蛋白的胰蛋白酶解的LC-MS/MS肽的制备和

1. 捕获磁珠在10μL50 mM的碳酸氢铵，使用超声波浴和震荡（蒸发的乙腈/ TFA的解决方案，步骤2.12）公布的蛋白质溶解，添加在1毫米盐酸1μL为0.5μg/μL的胰蛋白酶和孵化的解决方案37℃过夜。
2. 脱盐液中含有的捕获采用C18材料的蛋白质的胰蛋白酶肽（如2-10μLStageTips，20μL的提示，Proxeon生物系统公司的A / S，欧登塞，丹麦，制造商的过程：10μL，50％甲醇/ 5的先决条件足总杯％，平衡与10μL的5％FA，捕获蛋白肽负载，用10μL的5％FA，洗脱10μL，50％甲醇/ 5％FA）的两倍。
3. 在50％甲醇/ 5％FA干燥蒸发脱盐肽，溶解在5.5μL0.1％FA一阵晃动和应用超声（超声浴），并通过nanoLC-MS/MS分析样品。

6）NanoLC-MS/MS分析

1. 到纳米流液相色谱系统（nanoLC）（如易NLC液相色谱系统; Proxeon生物系统公司的A / S公司，丹麦），转移到样品板和地方板块样本。
2. 使用0.1％足总杯水为流动相A和0.1％的乙腈作为流动相B.只有使用的LC - MS级溶剂足总杯。
3. 直接到预柱负载5μL肽溶液（如纳流生物圈C18，5微米，120 A，20 × 0.1毫米; NanoSeparations，荷兰）耦合分析柱（如纳流生物圈C18，5微米，120 100 × 0.075毫米; NanoSeparations，荷兰），使用5％ACN/0.1％FA。
4. 在立法会，在80分钟从5％ACN/0.1％FA到40％ACN/0.1％的足总杯，2分钟到100％ACN/0.1％FA和100​​％ACN/0.1％的剩余的线性梯度洗脱肽足总杯另一个控制流量的400 NL /分钟8分钟。
5. 执行洗脱肽质谱（MS）的一个高准确度的国家的最先进的质谱仪（例如的LTQ Orbitrap XL质谱仪分析;热FisherScientific，德国，配备nanoelectrospray离子源为电喷雾电离（ESI）; Proxeon生物系统公司的A / S公司，丹麦）。
6. 执行的质谱分析数据依赖模式之间自动切换的Orbitrap - MS（情景模式）和LTQ-MS/MS（质心模式）收购。
7. 控制设置自动增益控制的注射时间质谱仪占空比。
8. 收购调查全扫描MS谱（从m / z 300〜2000）在与分辨率R = 60,000（积累目标值的50线性离子阱收费后）在m / z为400的Orbitrap。
9. 仪器设置顺序隔离最激烈的线性离子碰撞诱导解离（CID），在目标值10000收费陷阱的碎片离子（最多5个，根据信号强度）。记录在LTQ产生的碎片离子。
10. 对于在MS模式的精确质量测量，单电荷polydimethylcyclosiloxane背景离子（四_{（CH 3）2 O 6} ^H）+（M / Z 445.120025）锁的质量，从周围空气中的电过程中产生内部使用实时重新校准。
11. 动态目标离子排除在外已经大规模的CID选择的持续时间为60秒
12. 将未分配的负责CID离子充电状态的筛选和拒绝。
13. 进一步的质谱设置如下：设置喷雾电压1.6千伏，设定温度毛细管加热转移至200℃，和规范化的碰撞能量是35％的^MS 2 。为MS ²所需的最小信号是500计数。应用激活Q = 0.25和MS ²收购的激活时间为30毫秒。
14. 要干净的液相色谱系统，执行一个连续两次测量CCMS的空白运行。

7）通过自动序列数据库检索鉴定多肽和蛋白质

1. 使用一种蛋白质识别算法分析MS / MS数据，如SEQUEST BioworksBrowser 3.3.1 SP1（FisherScientific热，德国）和X!串联（全球蛋白质组机组织实施（在本案中，存储在原始文件中）;版本2007.01.01.1）实施中的SCaffold 3软件（版本Scaffold_3_00_03，蛋白质组软件公司，美国）。
2. 执行自动化的数据库，对调查的有机体（本研究使用的数据库：大肠杆菌K12菌株，释放57-11）最近UniProtKB / SWISS - PROT数据库发布www.expasy.org搜索。
3. 使用自动搜索数据库内SEQUEST的以下设置：5 ppm的易制毒化学耐受性，1阿木碎片离子宽容，允许最多两个错过了分裂和全胰蛋白酶特异性。允许变量修改丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸磷酸化; methionines氧化; deamidation在天门冬和谷氨酰胺，赖氨酸和丝氨酸乙酰化;在赖氨酸甲酰化;甲基精氨酸，赖氨酸，丝氨酸，苏氨酸，和天冬酰胺。不要使用固定的修改，在数据库中搜索。
4. 负载SRF或DTA和脚手架3，执行SEQUEST和X!串联数据库检索相结合的肽分配和蛋白鉴定评估的概率SEQUEST产生出的文件。脚手架是有用的，容易比较和可视化的几个样品中的蛋白质列表（在本案中的A，C，PD，CPD和A + PD）。
5. 内支架3软件中设置的参数来考虑≥95％的肽先知算法（ref.13）指定的概率只有肽。设置多个肽任务≥95％，根据蛋白质的先知^算法 13的蛋白质鉴定的概率。任意设定单肽蛋白鉴定，蛋白质的概率≥50％，手动检查相应的肽MS / MS谱图。不能单独的MS / MS分析的基础上有所区别，包括类似的肽和蛋白质组成的软件，以满足简约的原则。估计肽识别虚假的发现率可逆转的蛋白数据库的方法，并应<1％。
6. 代表CCMS的实验结果列于表1，2，和补充表S1（记住，蛋白质的数据库是不是最新一些蛋白质，如PrmB（又名YfcB）或RsmH（又名MraW）），以及如图3。

8）代表性的成果

表1：

蛋白质	ORF	兆瓦/ kDa的	说明	基板	一	彗星	PD	持续专业发展	通过A + PD
DCM	b1961	53.5	DNA胞嘧啶MTase	DNA（M5C）	1	0	0	0	1
RlmI	b0967	44.4	23S rRNA的m5C1962 MTase	rRNA基因（M5C）	17	0	17	0	20
RlmL	b0948	78.9	23S rRNA的m2G2445 MTase	rRNA基因（M2G）	12	0	0	0	10
TRMB	b2960	27.3	（鸟嘌呤- N（7） - ）的tRNA - MTase	tRNA（上M7G）	11	0	0	0	13
CmoA	b1870	27.8	（cmo5U34）的tRNA - MTase	tRNA（上mcmo5U）	7	0	0	0	4
RsmG	b3740	23.4	16S rRNA基因M7G MTase	rRNA基因（M7G）	6	0	1	0	5
RsmH	b0082	34.9	16S rRNA基因m4C1402 MTase	rRNA基因（M4C）	5	0	0	0	7
RsmD	b3465	21.7	16S rRNA基因m2G966 MTase	rRNA基因（M2G）	2	0	0	0	2
RsmB	b3289	48.3	16S rRNA基因m5C967 MTase	rRNA基因（M5C）	1	0	0	0	0
MnmC	b2324	74.4	双功能蛋白的tRNA（MNM（5）S（2）U34）MTase	tRNA（上mnm5s2U）	1	0	0	0	0
PrmB	b2330	35.0	50S核糖体蛋白L3 Gln150 MTase	蛋白（GLN）	13	0	0	0	15
雪儿	b1884	32.8	趋化蛋白MTase	蛋白（GLU）	0	0	0	0	1
终审法院	b1661	44.9	环丙烷-酰基磷脂脂肪酸合成酶	小分子	15	0	0	0	14
谭	b1519	29.0	跨aconitate 2 MTase	小分子	2	0	0	0	3
CysG	b3368	50.0	Siroheme合酶包括尿卟啉原三号丙MTase	小分子	1	0	0	0	2
SMTA	b0921	29.8	蛋白质SMTA	（？à）	7	1	0	0	8
MtnN	b0159	24.4	5' - Methylthioadenosine /蛛网膜下腔出血nucleosidase	小分子 B	36	0	0	0	39
GlnA	b3870	51.9	谷氨酰胺合成酶	小分子 C	90	0	0	0	97
RplK	b3983	14.9	50S核糖体蛋白L11	蛋白质MTase PRMA ð	2	0	0	0	2

^一个不能（完整）的特点

^b没有甲基化，但SAH糖苷键的裂解

^c没有甲基化，但约束力的ATP结合位点的SAH CCMS的实验作为竞争对手与ATP（数据未显示）所示

^ð基板的50S核糖体蛋白L11的MTase PRMA;重现特定的标识CCMS系统（数据未显示）

表1：MTases和其他选定的CCMS的实验确定的蛋白质。给定的数字表示未加权肽每个蛋白质谱计数。样品SDS-PAGE/silver分析的重复染色图2。更MTases和其他蛛网膜下腔出血的结合蛋白相比下拉（PD）和蛛网膜下腔出血的特异性是由这些蛋白质几乎完全没有在竞争中控制（C）所示CCMS的检测（一）确定。

表2：

	一	彗星	PD	持续专业发展	通过A + PD
一	111（64）
彗星	65（41）	107（46）
PD	25（15）	23（13）	61（17）
持续专业发展	23（13）	22（12）	20（14）	47（14）
通过A + PD	87（61）	64（41）	23（14）	22（12）	124（67）

表2：在CCMS系统的运行和蛋白质之间的运行重叠确定蛋白质的总数。括号内确定至少2肽的蛋白质的数量。该方法的重复性高，可以推断出高蛋白重叠（主要的非特异性蛋白）之间的可比性实验（A对 C，尤其是A与A +的 PD 也 PD 与CPD）的，特别是与强劲确定的蛋白质与至少2肽。参见图3维恩图和所有已鉴定的蛋白质列表的补充表S1。

图1A：三官能捕捉化合物（CC）的化学结构。选择性功能框架与液滴，与明星的反应功能，和一个半月形的排序功能。化学性质稳定的 S -腺苷- _L -同型半胱氨酸（SAH）是由SAM依赖MTases组，SAH作为产品抑制剂后，甲基转移（SAM）的辅助因子的S -腺苷_- L -蛋氨酸产品。

图1b：CCMS的“上珠“的工作流程。，其排序功能（一）CC是在磁珠上的约束，所以形成caproBeads培养与复杂的蛋白质混合物（B），在那里建立一个可逆的结合平衡（C）之间的选择性功能CC和靶蛋白。（D），经紫外线照射的反应性功能形成了共价交联。清洗后的轴承磁珠捕获蛋白（E），CC -蛋白质交联复合物的磁珠的断裂（F） ，（G）和胰蛋白酶消化，捕获的蛋白质可以识别的胰蛋白酶肽的质谱分析。

图2：SDS-PAGE/silver捕获的蛋白污渍的分析（步后，在图1B f） 。车道介绍凝胶的顶部（MW：分子量标记与相应的分子量非常正确的标记带，L：0.25％的样品从大肠杆菌DH5a全细胞裂解液前加入的caproBeads绘制答：除了免费蛛网膜下腔出血过多紫外线照射后在图1B步骤d测定; C：检测控制，包括作为竞争对手的免费蛛网膜下腔出血超过图1B在步骤c和d（基本图1B;在步骤b ，以确定任何非特异性捕获蛋白质）; PD：下拉式的意义在图1B中没有紫外线照射步骤d并没有免费的蛛网膜下腔出血此外的;持续专业发展：作为竞争对手的蛛网膜下腔出血下拉的控制;通过A + PD的：意思是没有另外的联合检测加下拉在工作​​流程的自由蛛网膜下腔出血）。 MS鉴定后切出的蛋白凝胶带凝胶胰蛋白酶消化的蛋白质是非常leftt。很明显，光交联，提高了产量和实验的灵敏度，特异性，可以很容易地在竞争实验，使用免费蛛网膜下腔出血超过测试。 MTases和其他在本图所示的重复样本CCMS的实验确定的蛋白质，请参阅表1。

图3：维恩图explaning CCMS的检测鉴定蛋白质的重叠（一），竞争对照组（C），和下拉（PD）。左：MTases和蛛网膜下腔出血nucleosidase，只有数量，参考表1。右：确定指表2和补充表S1蛋白的数量。括号内确定至少2肽的蛋白质的数量。

讨论

以下的预防措施和意见，以下所述的协议时，可能是有用的：一）CCS的主要优势在于形成一个共价键之间的CC和MTase，因为这允许随后的严格​​的洗涤条件。共价交联是通过紫外线（310纳米以下）。引发一个光化学反应。正常开销的光线中含有的紫外线只有一小部分，但是，从较长的曝光开销甚至太阳的光控制和冷却照射在caproBox保护性SAH - CC的。 B）从中MTases被孤立的生物样品中可能含有蛋白质容易变性，因而它是强制性的，以保持冷却样品，并避免在任何时候都起泡。 C）caproBox冷却的样本，以0-4 ° C，在紫外线照射下发光的灯，然而，也放出热量。因此，这是必要的照射前的短暂离心瓶，所以坚持帽或小瓶墙壁的蛋白质不能形成降水种子。 d）如果再悬浮磁珠（如在清洗解决方案）可能不用手，在短期内申请样品放入超声波浴超声。 E）新鲜准备的0.2％TFA/60％乙腈溶液。我们发现，否则捕获的蛋白质可能无法从珠裂解。 F）归根到底是捕获的蛋白质进行的LC-MS/MS。质谱是一个高度敏感的方法。它是需要使用专门的LC - MS级试剂，在最后一个步骤（步骤2.11和进一步）。避免外部的蛋白质来源，例如角质，灰尘或从实验者的实验污染。尤其是在最后的消化步骤，它是建议要注意一个干净的工作空间，要戴手套和一个白大褂，可能一毛净，或理想的执行下一个洁净工作台的最后一个步骤。准备50毫米铵碳酸氢缓冲区LC MS级的水用于胰蛋白酶消化，过滤通过0.22μm的过滤器，分装，于-20 ° C存储，并使用每个等份，只有一次，以避免污染。胰蛋白酶溶液（测序级，罗氏，准备一个为0.5μg/μL的解决方案，通过增加1毫米盐酸冻干胰蛋白酶），可以储存在4 ° C几个星期。 G）为了获得可靠的质谱是必须有一个稳定喷雾ESI-MS/MS分析。 h）对于其他的LC-MS/MS比在本研究中所使用的系统，测量参数和肽识别算法必须单独调整。

下列修改可能与所描述的协议：A）或者释放ACN/0.2％TFA的60％（步长2.11）珠蛋白，这种蛋白质可以直接tryptically消化内珠悬浮（相同卷在步骤5.1），或进行SDS - PAGE，蛋白质可以公布的暂停和加热后收集到的95步骤2.9珠° C的SDS样品缓冲液中10分钟（两个，整个悬挂或只取上清液可装载进入凝胶的口袋）。我们发现的珠子珠胰蛋白酶消化过程中缓慢释放少量的聚合物水溶液的胰蛋白酶消化解决方案，即使经过多次水溶液洗涤步骤。聚合物污染的干扰MS肽识别，可以关闭使用80％乙腈（至少三次）珠洗净。珠80％的乙腈洗涤步骤后，应一次洗涤水前珠胰蛋白酶消化。 B）使用的链霉菌horseraddish过氧化物酶和ECL底物的免疫印迹，也可用于可视化的生物素含有消委会成功交联的蛋白质。因此，无论是步骤3.2后得到的凝胶可以被涂抹或，因为灵敏度比银染凝胶较高的约10倍，10步后，2.7μL的样品也可能是由免疫印迹分析。心灵endogeneously生物素蛋白，在后一种情况下，也可除了SAH - CC人为生物素的蛋白质检测。 c）我们发现，它取决于特殊的系统（裂解，解决靶蛋白，选择性和反应性的功能，他消委会），是否“离珠”的配置，交联反应之间自由CC和蛋白质在溶液中⁴或目前所描述的“珠”的配置（图1B）的性能更好。

在一般情况下，该方法也应兼容任何国家的稳定同位素的蛋白质或肽标签技术，2D凝胶电泳或捕获样本的评估。在“离珠”的配置，也可以捕捉到在整个细胞（未发表结果）的蛋白质。此外，药物或辅助因子的蛋白质结合位点，可概述MS肽测序的蛋白质序列内确定消委会紧密交联的位置。一种小分子的结合模式，以一种蛋白质，可以探索通过使用不同的C在选择性的功能和不同的连接器长度hemical附件立场。在目前的研究显示，还蛋白的蛋白质具有约束力的合作伙伴解决的选择性功能（PRMA基板RplK）或未知的小分子蛋白质相互作用（蛛网膜下腔出血来GlnA），可以识别。归纳总结，CCS，光交联反应的附加功能，允许从低丰度蛋白质或功能的蛋白质家族，具有灵敏度高的复杂的蛋白质混合物的分离和识别，并为科学家提供额外的工具，为研究小分子 - 蛋白质相互作用。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
SAH caproKit™	caprotec bioanalytics GmbH	1-1010-050 (50 reactions) 1-1010-010 (10 reactions)	Includes the SAH-CC, SAH competitor, streptavidin coated magnetic beads, capture buffer, and wash buffer
caproBox™	caprotec bioanalytics GmbH	1-5010-003 (110 V) 1-5010-004 (230 V)	For reproducible photo-activation while cooling the samples
caproMag™	caprotec bioanalytics GmbH	1-5100-001	For easy handling of magnetic particles without pipetting