突触量化：基于一个免疫细胞化学检测，以量化突触数量

摘要

该协议的细节，如何量化，在分离神经元的文化和突触数量在脑切片，用免疫细胞化学。使用车厢的特异性抗体，我们的标签突触前终端以及突触后专业化的网站。我们定义这些标记所产生的信号的共定位点之间的突触。

摘要

在神经科学中最重要的目标之一是要了解分子线索指示突触形成的早期阶段。因此，它已成为当务之急，制定客观的方法来量化突触连接的变化。从样品固定开始，这个协议的细节如何量化无论是在分离的神经元文化和在脑切片，用免疫细胞化学突触的数量。使用车厢的特异性抗体，我们的标签突触前终端以及突触后专业化的网站。我们定义这些标记所产生的信号的共定位点之间的突触。这些colocalizations量化Puncta分析器（巴里Wark，可根据要求，c.eroglu @ cellbio.duke.edu书面）使用ImageJ分析软件平台下的一个插件。在本议定书中所描述的突触检测可应用于任何神经组织或文化的准备，你有选择性的前和突触后标记。这突触法是一种宝贵的的工具，可以被广泛利用在突触发展的研究。

研究方案

准备的解决方案：

1. 抗体缓冲液：
   • 150 mM氯化钠
   • 50 mM的三基（费舍尔​​，猫编号：BP152 - 5，50毫米） - 1.21克
   • 1％BSA（Sigma公司，没有猫：A2153，1％） - 2.0克
   • 100毫米_L -赖氨酸（西格玛，猫编号：L - 1137，100毫米） - 3.65克
   • 调整pH值至7.4
   • 0.04％叠氮
   • 音量调整到200毫升，用蒸馏水H ₂ O
   • 通过0.22μm的过滤器的过滤器（Millipore公司，卡特彼勒：SCGPU02RE）。
2. 煤灰Diluant：
   • 168毫升0.5 M的NA ₂ HPO _4（二元）
   • 72毫升0.5M娜₂ HPO _4（一元）
   • 660 ml蒸馏水H _{2 O}
3. 4％PFA固定液培养的神经元（解决方案＃2）：
   • 10毫升16％煤灰的解决方案（电子显微学，猫没有：15711）
   • 30毫升4％PFA diluant（解决方案＃2）
4. 4％的PBS的PFA：
   • 4克PFA（电子Microscropy科学，猫没有：19210）
   • 100毫升PBS（Invitrogen公司，卡特彼勒：20012-027）
   • 加热至40 ° C，搅拌过夜。
   • 过滤器通过0.22μm的过滤器（Millipore公司，卡特彼勒：SCGPU02RE）
5. 封闭液（总量（24孔板）=（＃盖玻片1）×200μL）
   • 50％的抗体的缓冲液（溶液＃1）
   • 50％正常山羊血清（Gibco公司，卡特彼勒：16210）
   • 0.2％Triton X一100（罗氏诊断有限公司，猫没有。9002-93-1）
6. 30％蔗糖的PBS
   • 30 g蔗糖（MP生物医学公司，猫没有：821713）
   • 70毫升PBS（Invitrogen公司，卡特彼勒：20012-027）
   • 一个stirbar的蔗糖溶液中混合，直到。
   • 把音量高达100毫升用PBS
   • 通过0.22微米过滤器（Millipore公司，卡特彼勒：SCGPU02RE的过滤）

神经细胞培养的筹备工作：

这里描述的协议，适用于生长在12毫米的玻璃盖玻片（卡尔赫克特号Ø，猫编号：99010。）的任何初级神经元培养在24孔板（猎鹰，35-3047）。例如，在我们的实验室中，我们培养的大鼠视网膜神经节细胞（RGC的）从P5 ^- 7动物1,2收获的大鼠视网膜纯化。细胞是生长在聚- D -赖氨酸（Sigma公司，卡特彼勒：P6407）镀膜玻璃盖玻片（Cultrex，猫编号：3400-010-01）和鼠标的层粘连蛋白。我们利用这种文化的准备，在几个不同的方式为我们的突触检测。我们执行一个操纵涉及培养视网膜神经节细胞，星形胶质细胞分泌的synaptogenic因素的存在或缺乏。另外，我们还采用了这些不同的治疗方法在视网膜神经节细胞转染过表达利益的一种蛋白已的实验条件。在后一种情况下，我们共同转染细胞与细胞的标签（如GFP或tdTomato）。这些不同的实验方法的影响，如何执行某些步骤，突触的检测，我们在下面澄清。

1。修复游离纯化视网膜神经节细胞

1. 研资局含水井取出培养基，添加500μL（24孔板）4％多聚甲醛（PFA）预热至37 ° C，每孔。允许细胞以修复为7分钟，在室温下。
2. 录制后冲洗细胞3次磷酸盐缓冲液（PBS）（Invitrogen公司，卡特彼勒：20012-027）。重要信息：细胞应该永远不会没有在井液，一旦一个缓冲区的下一个缓冲区中删除从应及时更换。此时，细胞是免疫准备。

2。阻塞的视网膜神经节细胞的非特异性结合部位

1. 准备封闭液含50％正常山羊血清（Gibco公司，农工商超市，猫没有：16210）和0.2％的Triton X - 100（罗氏诊断有限公司，猫没有。9002-93-1）。取出后PBS从每口井，每口井和块加200μL封闭液在室温为30分钟。
2. 卸下封闭液，用PBS冲洗3次。

3。应用初级抗体溶液

1. 要点：一定要选择前和突触后的标记，从不同的物种中获得的主要抗体。
2. 准备在90％的抗体的缓冲，农工商超市10％的解决方案，包含您所选择的的前和突触后的抗体对一个主要的抗体稀释。例如兔抗synap罪（突触前的标记）（1:750，胞浆域，突触系统）和鼠抗荷马（突触后标记）（1:500，鼠标，突触系统）。重要信息：离心5分钟以最大的速度在台式离心机，以消除任何沉淀抗体的主要抗体稀释。
3. 添加200μL小学每口井的抗体解决方案。
4. 孵育4℃过夜° C。板应被放置在一个大容器，这是首要解决的加湿，以防止干燥。断点：细胞可以留在基层抗体混合物前3天，继续与协议。
5. 次日，取出从每口井的主要抗体，并用PBS冲洗井的3倍。

4。应用二次抗体溶液

1. 准备一个二级抗体溶液中含有抗体1:1000稀释在抗体缓冲液含有10％的农工商超市。重要信息：离心5分钟以最大的速度在台式离心机除去沉淀抗体的二次抗体稀释。高二级抗体背景跳过这一步结果。
   
   未转染细胞：在一个单元格标签的情况下，使用Alexa的594和Alexa的- 488标签前和突触后的标记分别的共轭二级。例如，我们使用的羊抗兔Alexa594标签反突触的抗体和山羊抗鼠标签Alexa的- 488标记的二抗荷马抗体。重要事项：使用Alexa的488信号较弱的主要抗体共轭二级。
   
   转染细胞：选择二次抗体，容纳激发发射光谱的荧光细胞标签。例如，当我们的标签与tdTomato转染的细胞中，我们使用Alexa的- 647标记的羊抗兔认识到反突触的抗体和Alexa的- 488标记的羊抗鼠认识到反荷马抗体。此外，在本议定书农工商中使用的是我们的选择山羊产生的二次抗体的结果。
2. 加入200μL二次抗体溶液到每口井。
3. 两小时后在室温下孵育，在黑暗的位置，用PBS冲洗3至4倍。

5。安装盖玻片

1. 到Vectashield山盖玻片的DAPI（矢量Laboratories公司，猫编号：H - 1200）安装介质到玻片（VWR科学，猫没有。48311-703）。
2. 轻轻适用于盖玻片边缘周围的透明指甲油，并允许至少30分钟的干燥，在干燥，避光的地方。重要事项：避免轻推或移动的盖玻片在指甲油的应用程序，因为这会导致细胞sheering。

6。成像

成像，荧光显微镜配备相机能够在4个不同的渠道拍照是要能够形象突触标记，你的单元格的填充和细胞核（DAPI /可选）。成像单元格应使用油浸63X目标。我们使用蔡司计划的复消色差透镜63x/1.4油的DIC∞/ 0.17目标蔡司AxioImager荧光显微镜下的图像。

1. 选择离他们最近的邻居，至少有两个细胞直径的细胞。为了避免偏见和确保小区选择的随机性，可视化未转染细胞，如果选择在DAPI通道的细胞，然后在所有通道的图像。如果可视化的转染细胞，选择相应的荧光标记，以确定转染的细胞（如tdTomato）在通道的细胞。
2. 获取您的图像：
   
   未转染细胞：对于每个选定的单元格，获得GFP和得克萨斯州的红色通道的8位图像。叠加的pseudocolored图像应该有前和突触后的标记，在红色和绿色。
   
   转染细胞：对于选定的每个细胞，获得在GFP，德克萨斯红和Cy5（或Cy5.5）通道的8位图像。叠加的pseudocolored图像应该有前和突触后的标记，在红色和绿色。伪彩色单元格的填充为蓝色。

7。图像分析和本地化合作Puncta量化

1. 我们用量化的合作本地化的突触puncta Puncta分析器程序。 Puncta分析仪插件写的是巴里Wark，并根据要求（c.eroglu @ cellbio.duke.edu）。 Puncta分析器中运行ImageJ 1.26（http://rsbweb.nih.gov/ij/ ImageJ较新版本的应用程序不能运行）。要安装Puncta分析仪简单地在“插件”文件夹在ImageJ 1.26目录下载的应用程序文件夹。
2. 打开您的使用ImageJ的图像之一。使用选择工具在IMAGEJ菜单来确定的感兴趣区域（ROI）。我们经常使用圆形选择工具选择一个区域，大约一个细胞，呈放射状围绕利益的SOMA直径。
3. 选择您感兴趣的区域（ROI），去Plugins菜单，并选择“Puncta分析仪”。
4. 在“分析选项”窗口中，选择“红色通道”，“绿色通道”，首先“​​减去背景”和“设置结果文件...."点击“OK”。你会被要求来定义一个位置来保存你的结果。这些结果可以导出到Excel作进一步分析。
5. 在出现的窗口中旁边，确保50滚动球的半径被选中和清除“白色背景”选项（这种修改是不是必需的，但往往是由用户为便于可视化的应用的首选）。点击“OK”。
6. 一个新窗口会出现相应的红色通道图像沿着口罩。调整阈值，直到你觉得红色的面具，以及尽可能对应许多分立的个人puncta，没有引入太多的噪音。这是在本议定书中最主观的步骤之一，所以要小心，制定一致的方法。点击“完成”。最低puncta大小设置4个像素，并没有其他修改。点击“OK”。
7. 重复前面的步骤，这个时间的绿色通道。
8. 一旦你完成了上一步，插件将提供量化每个通道对应puncta的分别和两个通道之间的共定位puncta。

脑切片：

突触检测可以应用于脑冰冻切片，和任何其他神经系统组织（如脊髓或视网膜）提供的是一个合适的术前和突触后的标记一双（抗体，以及在部分），可用来识别你想量化突触。突触检测可以揭示在一个特定的大脑区域中的突触形成的时间调节，并可以量化的突触连接在转基因动物，或在一个已经在一些其他的方式操纵的样品的影响。

1。摘取小鼠脑组织

所有动物的程序应与IACUC动物协议的一致性。

1. 安乐死放血和用PBS灌注小鼠。去除血液灌注用PBS是至关重要的，染色程序，并会减少背景信号。要点：不要用，如4％PFA固定剂灌注。这将产生负面影响染色结果。

2。固定

1. 在4％的PBS PFA全脑固定在4 ° C过夜。第二天冲洗3次，用PBS的大脑。
2. Cryoprotect由他们的大脑中放入30％蔗糖的PBS。组织最初将上浮。保持在4 ° C，直到组织水槽底部。在这个阶段，cryoprotection是完成。

3。嵌入/ Cryosectioning

1. 嵌入大脑切片在30％的蔗糖2:1的解决方案（如矢状或冠状）：（在所需的方向。组织TEK，猫编号：4583）华侨城在PBS。冻结干冰平坦的表面上嵌入大脑。可以放置在冷冻袋冷冻嵌入大脑前切片，并保存在-80长达一年。
2. Cryosection为12 -16μm部分组织和载玻片上安装（Sigma公司，卡特彼勒：S4651）。幻灯片可以储存在-80 ° C染色前一个星期。
3. 被染色的幻灯片，应在37 ° C干燥30分钟，PBS洗涤1X，以去除残留的OCT的。

4。阻止第

1. 座在20％正常山羊血清（NGS）的PBS在室温下一个小时的路段。要点：不要包括在这一阶段的Triton X - 100的。加入封闭液之前，您可能会造成周围使用精英的巴氏笔在幻灯片上部分的疏水性屏障（星展，猫没有：K039）

5。申请初级抗体

1. 在PBS稀释0.3％和10％的海卫农工商您的主要抗体。
2. 在脑切片中，我们使用的PSD - 95（Zymed公司，兔，1:500）标签谷氨酸突触后车厢和VGlut1或VGlut2（1:2500，豚鼠，Chemicon公司）标签谷氨酸突触前终端。初级抗体稀释在台式离心机离心去除沉淀抗体，如果目前的最高速度为5分钟。
3. 孵育节在36-60小时的初级抗体溶液在4 ° C

6。应用抗体

1. 抗体洗净浸泡在PBS的3倍，每次15分钟的幻灯片。这一步后，确保直射光，以保护您的幻灯片。
2. 稀在1:200稀释的二级抗体在同一缓冲区描述的主要抗体。 VGlut/PSD95染色的例子，我们使用的羊抗豚鼠Alexa的488（Vglut）和羊抗兔Alexa的594（PSD - 95）（Invitrogen公司）。
3. 二次抗体溶液中孵育2小时在室温下，在黑暗中的部分。
4. 洗净，浸泡在PBS的4倍，每次15分钟的幻灯片幻灯片关闭未绑定的二级抗体。

7。安装

1. 添加Vectashield小滴，用DAPI（矢量Laboratories公司）安装到玻片（VWR科学）中等，然后盖上盖玻片（VWR科学，1.5号，48393 241）的幻灯片。应用指甲油抑制运动的盖玻片。

8。成像

重要信息：一个至少有3个通道共聚焦显微镜是这里所描述的成像所需的。我们的Leica SP5的使用63X的油浸物镜的激光扫描共聚焦显微镜图像。

1. 突触的大脑区域的利益，应选择部分之间始终进行扫描。例如，在我们的视网膜神经节细胞到卓越的丘神经元突触的突触检测，我们的形象外上级丘地区相邻的下丘，其中包括突触层^接收 retinocollicular码头7,8,9。我们的形象和量化，在高150微米的视网膜神经节细胞是已知的建立突触^联系 9的上丘突触区突触。
2. 对于每个板块，在488和594频道，我们的形象串行以上的共15倍光学部分为5微米的总深度为0.33微米间隔的光学部分。至少有3节必须从每个动物进行成像和至少3只动物，必须从一个给定的实验条件下的。
3. 连续3个部分，产生5 MIPS代表深入每个1μm的群体产生最大强度的预测（MIPS）。这些精神上无行为能力的量化。

9。图像定量分析

1. 可以执行RGC的描述完全一样，但投资回报率的形状和大小会发生变化作为一个量化的图像，你想哪个区域的功能。

成功的关键：

纯净RGC的：

1. 固定纯化的视网膜神经节细胞（或其他分离文化）之前一定要预温4％PFA水浴设置为37 ° C的约20-25分钟（在所有其他的时间储存在4 ° C，不使用煤灰稀释7天以上）。
2. 尤其是对培养的神经元，最好是在清洗不使用真空抽吸冲洗步骤。温和的方法，如使用巴斯德吸管和吸球明显提高染色质量。
3. 小心不要让你的细胞干在您的冲洗步骤。
4. 避免轻推或移动您的盖玻片在指甲油的应用程序，因为这样做可以导致细胞的剪切您的盖玻片上。
5. 离心所有小学和中学的抗体，以消除任何沉淀抗体，将产生负面影响染色。
6. 一定要选择前和突触后的标记，在不同物种中提出的主要抗体。如果不这样做，会消除你的能力来区分应用二次抗体后的两个信号。

脑切片：

1. 不要你的小鼠与煤灰，如固定剂灌注。
2. 不要你阻止脑切片的解决方案，包括TRITON - X 100。这样做损害突触前的标记，特别是突触前与突触囊泡相关标志物的染色质量。
3. 一个共聚焦显微镜成像的使用需要进行图像采集足够的质量，良好的执行突触分析。

代表性的成果：

上文所述突触测定是用来捕捉在体外和体内的突触连接的变化。在我们的实验室，我们利用突触的检测，以确定无论是单个或多个星形胶质细胞分泌的突触形成的分子的影响。我们通常执行纯化视网膜神经节细胞突触的检测，我们在体外培养。

星形胶质细胞条件培养基中纯化研究资助局文化（ACM）的一种慢性的应用效果很好的描述是在RGC的^3,4,5,6之间形成的突触数量多倍。图1A和1B显示，无论是基础的增长与ACM媒体或治疗视网膜神经节细胞未转染纯化的代表图像。为兴奋前和突触后的标记，在S ACM诱导增加染色后ynapse形成质明显（图1A，1B）。事实上，这一发现已使用电表明ACM诱导突触功能和电子显微镜显示，突触超微结构正常^3,4,6的几项研究证实。其他工作在我们的实验室已确定的钙离子通道亚基α2δ- 1作为一个星形胶质细胞分泌的强烈synaptogenic的分子，血小板^反应蛋白3的神经受体。在这里，我们包括在纯化，以确定是否α2δ- 1水平的提高，进一步增强ACM诱导突触的形成（图3）的视网膜神经节细胞的实验结果。

视网膜神经节细胞共转染空载体或与建构编码构造一个独立的编码后，在体外（DIV5）5天tdTomatoα2δ- 1 。与ACM或GM治疗慢性乙型肝炎，视网膜神经节细胞固定和DIV的11染色。以下我们看到一个定性突触数量明显增加纯化的视网膜神经节细胞表达空载体（质粒pcDNA3.1）或α2δ- 1（图1C，1D）的兴奋性突触前和突触后标记免疫标记。我们量化的ACM使用Puncta分析仪计数至少15个神经元突触的数量（图2）从每个条件synaptogenic效果。这种规模的样本，使我们能够计算平均每个神经元突触的数量和找到一个显着的，〜10倍，在ACM治疗神经元表达空载体（图3，灰色长条）形成的突触增加。此外，我们表明，α2δ- 1导致的过度表达ACM诱导突触的形成（〜20倍。图3，黑网吧）的一个显着程增强。

除了培养的神经元，大脑在不同的地区使用这种技术，我们可以量化的突触密度。上丘是接收retinocollicular的预测，从视网膜神经节细胞在视网膜上^7,8,9的大脑结构。在出生后的发展，到他们的目标在上丘形成由视网膜神经节细胞的兴奋性突触的数量显着增加，从P7 ^到 P21的7,8,9。

使用我们的定量方法，我们将展示retinocollicular突触的数量在上丘增加P7到P14的形成。要做到这一点，我们在P7的量化突触密度，并再次在P14的。我们污渍PSD - 95（突触后）和VGlut2（研资局在上丘突触特定标记突触前）的上丘。上丘突触的外地区成像（图4A）和合作本地化VGlut2/PSD-95突触进行了量化动物至少3％的部分，和至少3个时间点动物（图4B，4C）。由此产生的数据的量化，清楚地表明了一个P7和P14之间的突触数量显着增加三倍以上。这些结果与先前公布的结果利用电子显微镜（图^4D）9协议。

总之，我们在这里描述的突触数量的量化方法是一种有用的工具，以确定突触的数量和在文化和神经组织的密度，使我们能够学习操纵在体外或体内的突触形成的影响。

图1：代表在纯化视网膜神经节细胞突触染色。 （一）（A和B）3天在体外 （DIV），视网膜神经节细胞培养在基底生长介质（GM）或（二）亲synaptogenic小鼠星形胶质细胞条件培养基（ACM）的一个额外的6天。细胞，然后标大管（突触前，红色）和荷马（突触后，绿色）。鼠标ACM强烈刺激之间的合作本地化大管和荷马puncta数量的增加决定的视网膜神经节细胞形成突触。 （C和D）5DIV视网膜神经节细胞的钙离子通道亚基α2δ- 1过表达质粒转。转染细胞与tdTomato单元格的填充（蓝色）和已染色标记突触的突触前和突触后标记荷马。箭头指示突触。比例尺代表20微米。

图2：使用Puncta分析器这里显示的突触数量的量化（一）纯化的视网膜神经节细胞高表达的血小板反应蛋白受体α2δ- 1和原始图像是染色标记突触的突触前和突触后标记荷马的例子。 （二）在分析Puncta分析器puncta时，每个通道创建面具图像。 （三）Puncta Analzyer将创建一个图像，如这里显示puncta其中小的黑点（插图）表示一个。此外SHOWN是（D）数字输出puncta连同其他几个参数是文本/数字形式（粗体字强调添加）提供的应用程序。

图3：代表突触的检测结果表明这里是synaptogenic的星形胶质细胞条件培养基在转染视网膜神经节细胞表达空载体（质粒pcDNA3.1，灰色长条）或血小板反应蛋白受体α2δ- 1（ACM），视网膜神经节细胞治疗慢性乙型肝炎的效果。误差棒代表教育统筹局局长。 GM =生长介质。 ACM =（鼠）星形胶质细胞Contitioned媒体。

图4：在鼠标上丘突触密度的量化（一）要确定在视网膜神经节细胞到其优越的啮齿动物脑丘目标设立的谷氨酸突触的发展变化，我们对突触前从鼠脑冰冻切片染色抗体VGlut2标记（绿色）和突触后的标记，PSD - 95，（红色）。我们成像鼠标上丘（SC）的相应的视网膜神经节细胞突触的目标区域，通过使用激光扫描共聚焦显微镜外150 × 150μm的区域。一个Z - ​​Stack的每个SC部分收集的总深度为5微米（15 × 0.33微米的光部分）。最大图像预测（MIPS）产生连续3光学部分群体产生5 MIPS /条每个代表1微米的深度。下面显示的是从一个P14的WT鼠标丘采取有代表性的MIP。 VGlut2，突触前的标记，显示为绿色和突触后的标记，PSD - 95，以红色显示。 （C）的数值输出Puncta分析器。 （四）动物至少3％的部分，与3个时间点（误差棒代表SEM）的动物突触的数量分析的量化。比例尺代表50微米。

讨论

上文所述突触检测是基于在我们的实验目标，其中主要集中于视网膜神经节细胞兴奋的预测中，无论是在纯化的文化，或在大脑部分。我们提供了一个参考表中列出的标签（见表1）兴奋性突触的抗体，工作。

这种突触的检测，可适应量化任何神经元的人口或任何其他的突触亚型，这是有选择性的前和突触后标记的突触数量。例如，突触实验描述在这里可以应用到研究的GABA - ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
	抗原	物种	单克隆/多克隆	供应商	产品编号	稀释	文化工程	可在第
突触前	突触	兔	多克隆	突触系统	106004	1:750	Ÿ	ND
	突触	鼠标	单克隆抗体	突触系统	106001	1:500	Ÿ	Ÿ
	巴松管	鼠标	单克隆抗体	检测设计	VAM - PS003F	1:500	Ÿ	Ÿ
	巴松管	豚鼠	多克隆	突触系统	141004	1:1000	Ÿ	ND
	突触结合蛋白1	兔	多克隆	突触系统	105002	1:750	Ÿ	ñ
	Synaptobrevin 2 （C1.69.1）	鼠标	单克隆抗体	突触系统	104211	1:500	Ÿ	Ÿ
	突触 （C1.7.2）	鼠标	单克隆抗体	突触系统	101011	1:500	Ÿ	Ÿ
	VGlut1	鼠标	单克隆抗体	Millipore公司	MAB5502	1:2500	ñ	Ÿ
	VGlut1	豚鼠	多克隆	Millipore公司	AB5905	1:2500	ñ	Ÿ
	VGlut2	豚鼠	多克隆	Millipore公司	AB2251	1:2500	ñ	Ÿ
突触后	PSD - 95 （6G6 - 1C9克隆）	鼠标	单克隆抗体	亲和生物试剂	MA1 - 045	1:750	Ÿ	ñ
	PSD - 95	兔	多克隆	Zymed公司	51-6900	1:500	ñ	Ÿ
	荷马	鼠标	单克隆抗体	突触系统	160011	1:500	Ÿ	ND
	荷马	大鼠	多克隆	Millipore公司	AB5875	1:500	Ÿ	Ÿ
	Gephyrin	兔	多克隆	突触系统	147003	1:500	Ÿ	Ÿ
	Gephyrin	鼠标	单克隆抗体	突触系统	147	1:200	Ÿ	Ÿ

试剂	公司	猫。号
PBS	Invitrogen公司	20012-027
聚- D -赖氨酸	西格玛	P6407
层粘连蛋白	Cultrex	3400-010-01
TRITON X - 100	罗氏诊断有限公司	9002-93-1
正常山羊血清	Gibco公司	16210
VectaShield用DAPI	媒介实验室	H - 1200
华侨城	组织Tek的	4583
三基地（50毫米）	费舍尔	BP152 - 5
牛血清白蛋白	西格玛	A2153
L -赖氨酸	西格玛	L - 1137
16％PFA解决方案	电子显微镜科学	15711
颗粒煤灰	电子显微镜科学	19210
24孔培养板	鹘	35-3047
羊抗鼠Alexa的共轭抗体	Invitrogen公司	---
供应	公司	猫。号
12MM，0号盖玻片	卡尔赫克特有限公司	1105209
1.5玻璃盖玻片（片）	VWR科学	48393241
载玻片	VWR科学	48311-703