器官型切片文化绿色荧光蛋白表达的实时成像周围神经生长的小鼠胚胎

摘要

我们现在准备妊娠中期的小鼠胚胎的器官切片周围神经生长的培养和时间推移成像的方法。

摘要

多种用途，小鼠胚胎体外培养器官切片是可取的。例如，我们采用了转基因小鼠线（tauGFP）在绿色荧光蛋白（EGFP）的增强版本是专门表示，在发展的中枢和外^周神经系统1所有神经元的可能性，让这两个电影的支配前肢和操纵这个过程中，药理学和基因工程技术生产^的 2 。切片文化的培育成功，最关键的参数，是这片准备的方法。多种方法进行广泛的测试后，我们发现一个vibratome设备切片胚胎等，他们经常在文化，展示了可行性的几天内，最重要的结果是最好的，在这样一个时代的发展特定的方式。对于妊娠中期的胚胎，这包括脊神经从脊髓和背根神经节，他们在外围和适当的骨骼和肌肉组织的决心目标的正常生长。

在这项工作中，我们提出了一种用于加工成300整个胚胎的胚胎一天（五）E10的E12的方法 - 种植400微米片在一个标准的组织文化的孵化器，可研究后切片准备两天。这种方法成功的关键是使用vibratome每个琼脂糖包埋胚胎切片。其次是种植后Millicell小文化膜插入后放在一个中等体积小，接口中的文化技术的切片。凋落物平均7胚胎常规生产，至少有14片（2-3片每胚胎前肢地区），由于胚胎的年龄以及切片厚度略有不同。大约80％的培养切片显示神经生长，它可以测量througout培养期^2。使用tauGFP鼠标线的代表结果表明。

研究方案

第1部分：准备切片和培养。

1. 切片培养基（DMEM培养液，25％1X HBSS中，25％胎牛血清，0.5％葡萄糖，1毫米谷氨酰胺​​，2.5毫米的HEPES，pH值7.3）和3厘米Millicell小CM 0.4微米的文化准备10厘米的组织培养板膜插入和孵化器保持在37 ° C和5％的CO _2。
2. 在微波炉中加热4％，熔点低，在PBS点琼脂糖，并继续加热板，使其保持在约37 ° C。
3. 填补10厘米的细菌培养皿中，用PBS（140毫米氯化钠，氯化钾2.7毫米，10毫米_的Na 2 HPO 4，1.8MM KH ₂ PO 4），置于冰上。
4. 设置切片机的冷却装置，或确保缓冲区托盘和冷却元件在预冷，冷冻储存。

第2部分：嵌入胚胎。

1. 解剖胚胎从子宫和审查倒置荧光显微镜检查GFP的表达。
2. 在一个倒置的10厘米的培养皿和东方他们胚胎，使用的Whatman纸条，以除去过多的PBS。
3. 应用胚胎琼脂糖固定在这个位置上。让琼脂糖巩固。
4. 限制的区域，周围用刀片切割胚胎。
5. 旋转到另一边嵌入式胚胎。
6. 应用胚胎组织的额外琼脂糖，以确保胚胎完全嵌入。
7. 准备好干净的边缘和vibratome夹头使用类似“Krazy胶”一个特殊的胶水乐泰406，装载琼脂糖块。

第3部分：切片过程。

1. 预冷的缓冲盘和冷却元件。
2. 插入粘组织夹头和添加1X的HBSS（ ^钙+镁+免费的HBSS，10毫米HEPES缓冲液pH值7.3，500 U / ml青霉素/链霉素），直到覆盖。
3. 插入和修复precleaned（70％乙醇）切片机刀片。
4. 准备350 - 450微米的薄片，他们转移到组织培养板缩短玻璃巴氏吸管不停地在冰。
5. 使用一对镊子，小心地从每个切片和转移到Millicell小文化膜琼脂糖。一个充满了6毫升培养液在10厘米的组织培养板膜，可培养约4片。
6. 在37片° C和5％的CO _2（培养基：DMEM培养液，25％1X的HBSS，25％胎牛血清，0.5％葡萄糖，1mm的谷氨酰胺，2.5毫米的HEPES，pH值7.3）。如果一个执行时间推移成像系列，应保持介质的恒定量。在很短的时间内定时成像系列的情况下，它是足够的离开的媒介，因为它是。对于较长的文化时期的变化后12-20小时，建议。

第4部分：在显微镜成像脊髓神经生长。

1. 图像放置一个10厘米的组织培养板中，含有一个堂堂正正的荧光显微镜下切片，Millicell小文化膜脊神经。
2. 标签的显微镜舞台上的Millicell小文化膜的方向，正确的位置，在未来的成像时间点。
3. 图像的脊神经生长使用的4倍（数值孔径NA] 0.1），10X（NA 0.3），或20X（NA 0.5）的目标。

图1显示了成像系列在20小时的文化与4倍和10倍的目标描绘的脊髓神经生长。

图1成像系列在横片tauGPF一个纯合子胚脊髓神经生长。 * =电机的腹侧脊髓，箭头=背根神经节神经元。背片（D）腹（五）轴表示。 Scalebars：200微米。

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讨论

在比较广泛的方法，准备妊娠中期的小鼠胚胎的胚胎切片文化（E10 - E12），我们观察到一个vibratome毫无疑问，尊重文化的整体可行性和重复性生产的最可靠的结果神经生长模式。相比之下，使用斩波器³被证明是完全inviable一个McIlwain组织切片准备。我们原任一个断头台的方法^4，在整个胚胎的垃圾可以同时缠一堑长一连续篦生产400 ^微米的第1钨丝切片准备。虽然这种技术已?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
HBSS 10x	GIBCO, by Life Technologies	14180
Dissection tools	Fine Science Tools	various
L.M.P. agarose	Invitrogen	15517-022
Whatmann paper	Whatman, GE Healthcare	3030917
Shortened firepolished pipettes
DMEM	GIBCO, by Life Technologies	41966
FBS	GIBCO, by Life Technologies	10270-106
Pen Strep	GIBCO, by Life Technologies	15140
L-glutamine 100x	GIBCO, by Life Technologies	25030
Vibratome	Microm International	HM 650 V
Fluorescent microscope	Olympus Corporation	BX61WI
analySIS	Soft Imaging System
Millicell-CM inserts	EMD Millipore	PICMORG 50
10 cm culture plates	Greiner Bio-One	633171
LOCTITE 406	Henkel Corp	142580
Razor blades	Thermo Fisher Scientific, Inc.	none
Dissecting microscope	Nikon Instruments	SMZ800
HEPES	Carl Roth Gmbh	9105.2
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
x4 objective	Olympus Corporation	PL series
x10 objective	Olympus Corporation	UPLFL –PH series
Filter	Olympus Corporation	U-MNIBA2
CCD camera	Soft Imaging System	SIS F-View II
Equipment for heated chamber	Leica Microsystems	CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171