RNAi的干扰双链RNA注射到果蝇胚胎

摘要

RNA干扰已被证明非常有效的分析基因功能果蝇气管发展。说明了一个详细的协议，由江实验室用于注入飞胚胎击倒基因表达的dsRNA。这种技术的组织和器官的发育需要筛选基因的潜力果蝇。

摘要

遗传筛查是为获得到复杂的生物过程的见解¹最有力的方法之一。多年来许多改进和基因操纵的工具已成为在 ^果蝇 2 。后不久^，3 Frie和梅洛的初步发现，双链RNA可以用来击倒的单个基因的线虫，RNA干扰（RNAi）是提供了强大的反向基因的方法来分析果蝇的器官发育基因的功能活动^4，5。

许多器官，包括肺，肾，肝，和血管系统，是由支管网络，运输至关重要的液体或气体^6，7。 果蝇气管形成的分析提供了一个极好的模型系统^研究等8管状器官的形态发生。伯克利果蝇基因组计划已经发现了数百个，气管系统中表达的基因。要研究管形成的分子和细胞机制，面临的挑战是了解这些基因的作用在气管发展。在这里，我们描述了详细的双链RNA注射到果蝇胚胎敲除个别基因的表达方法。我们成功地撞倒内源性dysfusion（DYS）基因表达的dsRNA注射。 DYS是BHLH - PAS气管融合细胞表达的蛋白质，是气管的^{分支融合9，10}所必需的。 DYS - RNA干扰完全消除DYS表达，并导致气管融合缺陷。这种相对简单的方法提供了一种工具来识别tissure 在果蝇的器官发育requried的基因。

研究方案

1。胚胎收集

1. 设立了25笼° C使用2-4日龄瓦特¹¹¹⁸ flies.Grape汁板被改变白天每隔一小时同步前1-2天期间收集的鸡蛋收集
2. 收集胚胎为1小时25 ° C
3. 切一块长方形的葡萄汁琼脂，用刀片轻轻切在中间，一条线留在琼脂
4. 使用一个金属探针胚胎从葡萄汁板转移到您的葡萄汁琼脂片，线在胚胎长在45度角，在琼脂中轴线的直线。获取胚胎约50直线。确保所有的胚胎点在同一方向，指向行结束后。
5. 剪下一块长方形的双节棍磁带，并将其放置到18x18mm盖玻片。
6. 拿起双节棍带盖玻片上的胚胎
7. 将载玻片盖玻片，干燥空气中约10分钟的胚胎。
8. 盖一层薄薄的700卤烃油的胚胎，现在的准备注射。

2。拉针

拉玻璃毛细管微量注射针。从世界精密仪器（型号的Pul - 1），我们使用一针的车夫。针拉马程序规范是：热量：1，延迟4。

3。灌装针头

回到负荷针使用的Eppendorf Microloader提示安装的Eppendorf P20移液器，通常负载1.5-2μL的双链RNA

4。打破针

1. 才打破针，放到幻灯片盖玻片。
2. 准备幻灯片，在幻灯片中的油下降
3. Picospritzer三picopump转到调整空气压力
4. 打破对盖玻片边缘的充满针，创建一个尖点。
5. 当针尖被打破，踩脚踏Picospritzer三picopump，一些dsRNA的会泄漏出来针尖。
6. 取出盖玻片的幻灯片。
7. 下在油价下跌前的准备幻灯片中插入针。
8. Picospritzer三picopump调整设置100 - 200pl双链RNA，当你脚踏一步。双链RNA可以被看作是一个小液滴。

5。注塑

1. 针尖到同一焦平面第一胚胚胎后部和偏离中心注入胚胎蛋的长度在30-50％左右。
2. 之后Picospritzer三picopump脚踏一步，会出现少量的dsRNA在注射部位的小圆点。

6。表型分析

1. 注射后，放入有盖湿盒内（塑料培养皿中）在​​18 ° C的幻灯片，直到胚胎发育所需的萌芽阶段。
2. 使用探针删除双面胶带的胚胎，并将其推到盖玻片边缘。
   洗掉的幻灯片，在尼龙网收集瓶底部使用庚烷的胚胎，与PBT洗3次。
   与PBT Dechorionate胚胎在50％漂白水5分钟，洗3次。
   胚胎从收集瓶转移到一块尼龙网，然后浸入固定液（5毫升庚烷，4.5毫升PBS，0.5毫升37％的甲醛）释放胚胎的尼龙网。修复胚胎在固定液为30min。
   用甲醇Devitellinize胚胎，胚胎转移到Eppendorf管中，并使用标准协议，免疫染色的胚胎。
3. 胚胎也可以发展到适当的幼虫阶段。
4. 准备幻灯片，在中间的卤烃700油下降
5. 一个幼虫的幻灯片，把顶部盖玻片
6. 亮视野显微镜下观察幼虫。

7。代表性的成果：

的dsRNA的一个例子击倒dysfusion Drosophlia胚胎（DYS）基因是在图1所示。绿色荧光蛋白的双链RNA注射的胚胎是阴性对照。 DYS是一个BHLH PAS气管融合细胞表达的转录因子。 GFP -双链RNA注射胚胎正常显示气管的融合，DYS蛋白融合细胞（图1A）。另一方面，DYS -双链RNA注射的胚胎失败的分支融合，DYS蛋白融合细胞（图1B）不存在。当双链RNA注射胚胎发育到幼虫阶段，注入DYS - dsRNA的幼虫呈分支融合失败（Fig.1D）相比，GFP -双链RNA注入了阴性对照（图1C）。这些结果表明，有效的击倒的内源性DYS基因表达的双链RNA注射到果蝇胚胎

图1。DYS功能去除DYS - RNAi技术揭示了气管融合ð烹调。注射使用GFP -双链RNA（阴性对照）或DYS - dsRNA的胚胚胎（W ^1118）和气管缺陷检测。 （一）第一阶段16胚胎注射GFP - dsRNA的α- DYS和单克隆抗体2A12污渍气管管腔的染色。集中反映的是横向干线，其中有融合。箭头指向侧主干DYS积极的融合细胞。 （二）第一阶段16胚胎注射双链RNA DYS -α- DYS和单克隆抗体2A12的染色。胚胎表明缺乏横向主干融合（星号表示在控制胚胎的横向主干融合的正常位置）。没有DYS -阳性细胞进行观察，表明DYS - RNA有效地取消DYS蛋白。 （C到D）二龄幼虫与GFP -双链RNA或DYS - dsRNA的气管缺陷的明场显微镜研究。 （三）融合的地点是在GFP -双链RNA注射控制幼虫的星号表示。 （四）横向干线失败保险丝在DYS - RNA注入幼虫，（*）表示横向主干融合的正常位置。

讨论

双链RNA注射方法在座使一个非常敏感和快速的分析，在果蝇的基因功能的气管发展。这种方法有可能被应用到其他组织和器官的发育的基因功能分析。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898
Picospritzer III picopump	Parker Hannifin Corporation	051-0500-900
Micro-pipettes	Fisher Scientific	21170M
Microloaders	Eppendorf	930001007