本地化的蛋白质三维神经干细胞培养：一个混合的可视化方法

摘要

在这里，我们描述了如何产生，扩大，并在三维（3D）培养的immunolabel产后海马神经祖细胞（筹备）。接下来，使用混合可视化技术，我们将演示如何immunolabelled冰冻切片的数字图像，可用于重建和地图的整个3D神经球免疫阳性细胞的空间位置。

摘要

3维（3D）影响神经干细胞和祖细胞的地形的重要性（人大）的表型是广泛承认具有挑战性的研究。当从胚胎或产后脑分离，单一的NPC将悬浮液中扩散，形成神经球。这些文化内的子细胞自发地在扩张的过程中，尽管被暴露在相同的外环境采取不同的发展谱系（神经细胞，少突胶质细胞和星形胶质细胞）。本阶段的进展概括许多观察到的神经发生在产后脑gliogenesis的过程，往往是用于在受控环境中的基本​​全国人大生物学研究。然而，评估的3D地形和蜂窝定位在全国人大命运这些文化的影响是困难的。要本地化靶蛋白和免疫细胞化学法确定的全国人民代表大会的谱系，自由浮动的神经球必须在基板上镀，或连续切片。这种处理是必需的，以确保整个球体相当于细胞通透性和抗体访问。因此，冰冻切片或三维的Z -堆叠共聚焦重建的二维啶图像，只能提供关于细胞位置的空间信息在离散的物理或数字化三维切片和不完整的领域可视化的细胞位置。在这里重申的神经球文化的地形，并允许在整个文化蛋白表达的空间分析，我们提出一个孤立的协议，扩展，和产后适合啶或焦靶蛋白的免疫检测海马神经球连续切片。 Connexin29（Cx29）为例分析。接下来，使用混合图形编辑和三维建模软件严格的应用，以保持生物的细节，我们介绍了如何重新组装这些图像的三维结构定位和数字地图内标示完整的神经干细胞。这种方法使整个3D的文化地形的靶蛋白和细胞的细胞位置的可视化和分析，将有助于一个更详细的分析，对在体外的神经发生和gliogenesis过程中细胞之间的空间关系。

Imbeault和巴伦苏埃拉同等贡献，并应考虑共同第一作者。

研究方案

1。神经祖细胞的分离

隔离协议期间任何时候都保持在寒冷的组织和解决方案！

1. 开始你的文化，在此之前准备好以下的股票解决方案：
   • 解离媒体（碳酸氢钠₃ 26毫米，124毫米氯化钠，氯化钾5毫米，0.1毫米氯化钙₂ * 2H _{2 O，3.2}毫米氯化镁₂ * 6H ₂ O，10毫米D -葡萄糖，100 U / mL青霉素，100微克/毫升。链霉素的无菌过滤器和在10-15毫升分装储存于-20 ° C.准备股票细胞分解酶在双_蒸 H 2 O，无菌过滤器，并在-20 ° C存储等分浓度：神经蛋白酶（25毫克在实验当天，添加酶分解媒体15毫升以下的终浓度：1 mg / mL的蛋白酶，为0.1mg /。/毫升），木瓜（10毫克/毫升），DNAseI（10毫克/毫升）毫升0.1 mg / mL的木瓜蛋白酶，DNA酶一夹层解决方案，包含最终的酶浓度，可以保持在冰上，在解剖过程中。
   • 维护媒体：贝科改良Eagle培养基F12键（DMEM/F12），2毫米L -谷氨酰胺，100 U / ml青霉素，100μg/ mL链霉素，1X B27的补充。可以保持长达3个月在4 ° C，无B27的补充和长达一个月在4 °与B27的补充。
   • 生长因子：0.1微克/毫升重组人表皮生长因子（hEGF）和10μg/ mL的准备股票分装成纤维细胞生长因子2（FGF - 2）中的DMEM/F12 + 0.1％牛血清白蛋白（BSA）。储存在-20 ° C。
2. 要致死麻醉C57BL / 6小鼠的幼崽，被注入小鼠与Euthansol日龄0-3腹腔。
3. 小心地取出标准的清扫和储存在一个60毫米的菜，含有人工脑脊液（学联_的大脑：碳酸氢钠3 26毫米，124毫米氯化钠，氯化钾5毫米_{，2毫米氯化钙2} · 2H 2 _O，1.3毫米氯化镁₂ · 6H 2 O 10毫米D -葡萄糖，100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素）。 pH值至7.3，如果必要的和无菌过滤，储存于-20 ° C到50毫升分装
4. 通过删除到vibratome夹头Krazy胶，喙侧，背侧对着你，小脑和大脑胶水使用刀片，阻止脑。徕卡Microsystems的VT1000S vibratome是在本议定书中使用。
5. 夹头的位置vibratome添加到正确的车厢学联和冰。
6. 切割片厚度为500微米之间使用3.5-4.5和8.5频率速度。
7. 收集切片包含的菜肴，含学联海马形成。
8. 使用立体显微镜，删除前囟-1.60毫米-2.40毫米之间的海马（CA3区，直到开始腹部曲线），并在一个新的干菜地点（无学联）。徕卡MZ6解剖显微镜是用来在本议定书。
9. 一旦所有海马收集，肉用手术刀组织（直到取得的同质化和液化外观）。
10. 剁碎组织转移至15 mL聚丙烯管内含有2.5毫升含有神经蛋白酶，木瓜蛋白酶和DNase我（见溶液的制备步骤＃1）的解离媒体。注意：如果有很多源组织（例如，从6幼仔）使用2瓶2.5毫升分解媒体，以保持最佳的酶，它是一个好主意：组织的比例。在37 ° C孵育45-60分钟旋转。一个Labnet ProBlot 6杂交炉（通过曼德尔科学购买）是用来设置旋转设置4本议定书。
11. 加10毫升无菌组织培养磷酸钾缓冲液（Kpbs的：137毫米氯化钠，氯化钾2.7毫米，10毫米的磷酸盐缓冲液，pH值7.4），并在5分钟的300 XG的离心机。在本议定书中使用的Eppendorf离心机（型号5702）。
12. 5毫升的Kpbs的弃上清，重悬沉淀。
13. 通过巴斯德吸管trituration游离组织。
14. 离心5分钟300 XG细胞悬液。
15. 3毫升维持液中的悬浮细胞，计数细胞，用台盼蓝板细胞在60毫米非贴壁的菜肴（康宁超低坚持约束力的菜肴在本议定书中使用，见材料^）在2.5 × 10 5细胞密度在维持液5毫升/皿。培养皿可用于超低坚持菜的地方，但文化要求在每天上午和下午在扩大体外培养的第6天（DIV），以防止电镀和自发分化可挖。
16. 人表皮生长因子添加到终浓度为20 ng / mL和FGF - 2的终浓度为10毫微克/毫升电镀后立即。添加额外的增长因素，每两天在14上的DIV，直到收集当天的扩张阶段。 （扩大神经球视频比例尺代表100微米）。

**注：媒体有可能成为周围10格的扩张阶段黄。如果发生这种情况，加上另1毫升麦ntenance媒体。如果媒体又是黄色的翌日，添加1毫升的另一个维修媒体 - 继续在扩张阶段，作为必要 - 记住相应的调整量的增长因素，保持正确的最终浓度。

2。串行Cryosectioning

1. 塔前轻轻固定，以确保球是在固定的时间分隔的神经球。
2. 分子级甲醛直接的文化，在室温为20分钟，慢摇（RT）的终浓度为3.7％和孵化。一个斯托维尔肚皮舞，是在此协议设置旋转速度为2.5。
3. 收集在15毫升的聚丙烯管的神经球，并旋转300 5分钟XG。
4. 倒掉上清，重悬沉淀于10 mL磷酸钠缓冲液（nPBS：154毫米氯化钠，10 mM磷酸盐缓冲液）。请注意在解决方案的使用变化，从Kpbs的nPBS。
5. 离心5分钟XG 300。
6. 悬浮在5-10毫升20％蔗糖（W / V）nPBS的解决方案。
7. 保持至少24小时的神经球cryoprotect文化，在4 ° C。
8. 填写一个最佳的切割温度（OCT）复合一次性cryomold。
9. 轻轻倒入蔗糖溶液中含有神经球成菜。
10. 使用立体显微镜下找到与机械破碎的证据，各种尺寸的代表领域。当首次执行此过程中，有些文化可能被打破或撕裂。形态将很好地保持与实践。
11. 轻轻吸出每一个神经干成1毫升枪头（保持拆下来最低的蔗糖含有解量），并放入OCT的复合。马克您在模具上的大致位置，这样你可以找到后来的领域。
12. 一旦你放置到cryomold几个领域，闪存冻结样品使用的CO _2，直到华侨城是白色的。
13. 马克在多维数据集上的位置和你的领域弹出模具的多维数据集
14. 使用预冷钳，放置到滤纸以前担保与华侨城夹头的立方体。
15. 更到位华侨城周围的立方体的化合物，并冻结坚持块包含的_领域使用的CO 2。或者放置在低温恒温器的夹头（滤纸），喷射华侨城到滤纸院内，和地方的多维数据集直接进入十月。等待，直到华侨城是白色的，硬。徕卡CM1900低温恒温器是用于在本议定书。
16. 华侨城复合一旦变为白色，您可能在卡盘上的切割块，然后等待至少30分钟的温度平衡。
17. 剪切串行10微米的部分为您的商标和经常检查显微镜下神经干节。许多路段，你可以到一个幻灯片的地方。注意：你可能不能够看到你的神经球的前几片的范围下，因此，收集所有章节，直到你看到细胞，并保持在此之前开始在你的领域年底3-5节。这些前部和后部的部分也将免疫细胞化学法处理。一个核染液因此，当执行免疫的关键，因为这将使您检测标准倒置相差显微镜下不易明显的神经球极点的单细胞。
18. 在-20 ° C的商店部分

3。免疫细胞化学

1. 从-20 ° C和解冻申请nPBS轻轻地对所有路段，并在室温下孵育5分钟，取出幻灯片。
2. 弗里克关闭多余的nPBS和立即应用的主要抗体，抗体缓冲液稀释（0.3％TRITON X - 100，0.3％的牛血清白蛋白在nPBS，pH值7.2）。您将需要〜100μL，每张幻灯片。在这个协议中，我们的本地化Cx29在离散全国人民代表大会的后代，目前在3D的神经球文化。
3. 用封口膜盖削减覆盖的部分，但抗体将抽出渗透幻灯片的封口膜达到或超过幻灯片的宽度不超过显微镜幻灯片的大小。封口膜将防止蒸发。在4 ° C孵育过夜在潮湿的腔。照顾浮动超过部分的封口膜，并没有允许它坚持到幻灯片。但是，不要删除或修改一次应用护理必须采取不适用任何路段上的剪切力，从而破坏形态的封口膜放置。
4. 〜1毫升nPBS直接添加部分和浮动的封口膜。另外，垂直放置在一个coplin JAR幻灯片直接直到封口膜浮了。不要删除封口膜，直到它浮离独立操纵的，因为你可能会破坏脆弱的神经球结构。一旦封口膜是幻灯片，在室温下孵育5分钟。弗里克关闭nPBS，并继续与3在室温下洗为5分钟。
5. 申请二级抗体稀释后在室温下，AB缓冲区，并培育1如上所述，在湿热试验箱小时。你将再次要求〜100μL/幻灯片。
6. 在第4步重复nPBS清洗。应用在5分钟3 ^路洗（Hoechst 33258荧光0.5微克/毫升在nPBS）的核染液，在室温下5分钟进行最后一次洗涤。
7. 安装在您的首选的防褪色安装媒体和盖玻片，确保盖玻片指甲油在第一个弯道，然后各地的边缘，以防止损失（如果使用甘油为基础的媒体）。
8. 使用啶或共聚焦显微镜进行图像采集。在这个协议中，我们使用徕卡DMRA2，滨松ORCA ER相机的OpenLAB v3.56软件。在这个例子中，拍摄的图像三种渠道：（1）相衬，（3）蓝紫外线（徕卡A4纸立方体：过滤器组合前四十〇分之三百六十零，迪400，SP BP470/40）和红色（徕卡Y3的多维数据集过滤组合：EX BP535/50，迪565，SP七十五分之六百一十）。拍摄每个序列的第密切关注跟踪DNA阶段的检测单细胞很难用Hoechst 33258荧光标签的两极的第一和最后部分。

4。对齐

1. 当冰冻切片显微镜上线的解冻安装，他们会非常轻微的移动和旋转。必须纠正这些偏差。此外，每个串行部分是成像时，每幅图像的中心可能无法在屏幕上的同一位置。因此，每一个数字化的串行部分，必须仔细地保存准确的形态与上一节重新。这种一致性要求，以谨严的细胞结构和地形的细节关注。
2. 10微米和50微米（成立的OpenLAB v3.56软件）每个通道和居民比例尺的序列图像保存为单个TIFF文件导入到Photoshop CS4，使用标准的3300 x 2550像素的画布大小和分辨率的72像素/英寸。在此导入必须采取认真注意画布大小，保持一个准确的规模。画布的大小和分辨率随后在Maya建模的关键。比例尺，作为一个单独的图层在Photoshop中保存，应使用，以验证在Photoshop中的对齐过程中发生的XY尺寸没有改变。
3. 下一步，连接三个（或更多）层对应到相同的部分（即，链接的每个阶段，紫外线，Cy3标记的图像系列，并为每个部分）。这可以保证，一层是一致时，与该节相关的其他层也同时对齐。或者，您可以一次锁定相层在适当的位置（见下文），然后对准该节中的相关层相层。
4. 首先，请通过点击图层“窗口中的”眼睛“图标的无形的所有层。
5. 通过点击在图层窗口上的“眼睛”图标，打开第一和第二阶段的神经球连续切片对比度的图像。增加的第二部分的透明度。在“图像”标签，打开“图像旋转”，然后选择“任意的。”旋转的第二部分，直到你能够识别图像之间的几何和结构毗连点。来回比较UV通道（赫斯特33258标记的部分），它是有帮助的。
6. 重复所有比较“近邻”（即，立即眼前后节的前一节），直到所有的部分，所有的通道都准确地对准随后连续切片。
7. 创建Photoshop文件相同的比例是在玛雅V10飞机。

5。细胞类型学

1. 从Maya的用户界面的状态栏，菜单栏改变其默认的动画设置的表面。
2. 使用原始的细分领域创建的细胞体。
3. 选择神经球，开始操纵它的顶点，在对象上单击鼠标右键并从标记菜单中选择顶点。通过改变从标记菜单中的显示级别，进一步阐述球体的表面。
4. 从细分曲面的主菜单“选项卡，打开折叠层次选项框，设置的级别数为2。关闭球体。
5. 更改菜单栏从表面为多边形。
6. 选择球体，打开网主菜单“选项卡，从造型的几何工具。
7. 完善其最终形成用人造型的几何工具集，从“工具设置”选项卡细胞的表面。
8. 重复此过程，以创建不同的细胞组织，以模拟各种NPC和NPC在神经球的后代目前。在这个演示中，10个不同的细胞组织形成的神经球的基础上。
9. 选择的细胞类型和冷冻转换。
10. 随着类型学的细胞建立，两个表面着色器的设计，将代表都表达蛋白（Cx29阳性细胞在我们的例子），其中的蛋白质是不存在的细胞。在这里，任何与Cx29免疫细胞被指定Cx29阳性。在这个例子中，亚细胞定位是不为蓝本，虽然这样的分析是可能的修改的着色器。
11. 从“窗口”>“渲染编辑器主菜单中的选项卡打开Hypershade窗口。
12. 从表面材料“选项卡上选择一个斜​​坡着色器。
13. 打开属性编辑器，并设置颜色的着色器，白炽灯，环境色，凹凸贴图和镜面反射颜色属性。
14. 环境色节点和一个二维的分形纹理的凹凸贴图节点分配一个布朗3D纹理。
15. 选择所造成的着色器输入和输出连接和出口选定的网络。
16. 选择单元格类型和打开导出选择选项框。
17. 选择文件类型mayaAscii和取消选中“包含这些输入框。出口的选择。

6。胞映射

1. 打开对齐的序列在Photoshop CS4中的部分文件。
2. 建立一个关键的铅笔笔触来标记每个祖细胞在连续切片的位置。在这个演示中，一个三杆的关键 - 实心正方形，正方形虚线，和一个正方形跨 - 将被用来表明一个细胞是否位于一个，两个或三个部分。这招的关键是进一步定义颜色 - 在这个例子中，红色代表表达我们的兴趣，Cx29的蛋白质，而白色代表细胞不表达Cx29。
3. 打开相层和开始标记每个白色铅笔中风的祖细胞的中心。使用一个单独的层内的部分文件夹，用以建立你的地图。
4. 部分之间进行切换，确保正确表示多个节细胞定位细胞的位置。
5. 随着Cx29层打开时，选择的细胞中Cx29阳性表达的区域。
6. 从Photoshop的主菜单栏的“编辑”选项卡中选择“填充”命令，改变的白色笔画为红色。
7. 随着地图的完成，作为一个单独的JPEG图像中的玛雅项目sourceimages文件夹中保存的每个部分。要做到这一点，一个新的Maya项目将首先被创建。

7。导入和装配的三维地图

1. 从Maya的用户界面的状态栏，菜单栏改变其默认的动画设置为多边形。
2. 从项目的场景文件夹中导入planes.mb scaleBar.mb文件。
3. 选择飞机，在对象上单击鼠标右键开放分配新材料“选项卡分配一个兰伯特着色。
4. 在属性编辑器，单击方格框材料的颜色属性的权利。
5. 从弹出式菜单中，选择“从2D纹理部分的文件。
6. 根据文件属性，在属性编辑器，单击文件图标，图像的名称属性的权利。
7. 选择“从sourceimages文件夹中的第一部分。
8. 从这个角度视图默认正交顶视图开放小组“选项卡切换工作区窗口的摄像头。
9. 网主菜单“选项卡中选择创建多边形工具，并跟踪部分的轮廓。
10. 选择“从sourceimages文件夹中的第一张地图，并建立创建多边形的平面步骤将其分配给新创建的多边形平面。
11. 选择对象，选择在飞机上点击鼠标右键，从标记菜单中的紫外线。
12. 选择所有飞机的紫外线点，并从主菜单中的Windows“选项卡中打开UV纹理编辑器。
13. 缩放比例的紫外线，以适应部分平面。
14. 重复这个过程中，每一节的神经球，确保每节之间的空间对应比例尺的高度。

8。在三维定位的祖细胞类型学

1. 从Maya的用户界面的状态线，从它的默认动画设置，以动态改变菜单栏。
2. 只留下第一部分的神经球可见，从主菜单的“显示”选项卡上，通过改变显示设置隐藏所有其他部分。
3. CV曲线工具的选项框打开时，选择1 CV曲线设置线性。
4. 从顶视图摄像头查看现场，开始分配点创建一条曲线Cx29阴性细胞和Cx29阳性细胞的细胞地图。
5. 由此产生的曲线是平坦的，当从一个侧面视摄像头观看。建立曲线的点在Y轴转向使用进口比例尺为指导显微镜图像的部分厚度。
6. 重复这个过程中，每节神经球。
7. 从该项目的幕后文件夹导入的cellTyoplogy.ma文件和重复负Cx29和Cx29阳性细胞内的神经球的细胞类型。
8. 从“窗口”>“渲染编辑器主菜单中的选项卡打开Hypershade窗口。
9. 导入以前内置的着色器，将它们分配给类型细胞。
10. 从Outliner中的窗口，从开始导入的对象中删除的文件名。在建模过程的后期阶段，这将成为重要的的。
11. 从主菜单中选择粒子标签，并创建一个粒子发射器的第一个CV曲线。
12. 打开particleShape1选项卡，并根据排放属性从-1到您的第一条曲线上的点的数量变化最大计数。
13. 在Render Attributes选项卡改变粒子渲染类型Blobby表面（S / W）。下面对当前渲染类型“框中单击，并改变粒子0.010的半径。
14. 首先选择的颗粒，然后转向选择曲线，曲线的顶点将粒子。打开的主菜单中的颗粒“选项卡内的目标的选项和设定的目标重量为1。点击“创建”。
15. 在Outliner窗口中选择，以便从数字1到10个细胞，并从主菜单颗粒“选项卡中打开Instancer（替换）选项框。在实例对象框，所有10个细胞，应顺序列出。
16. 选择正确的particleShape名称，从下拉粒子的对象实例“选项卡列表下降。点击“创建”。
17. 默认情况下，只选择第一个单元格，将取代沿曲线的粒子。为了让所有十种类型的出现和循环颗粒之间的随机，表达是必要的。第二个表达式将确保细胞以同样的方式发出随机每个范围滑块重新定位的时间。
18. 选定的发射器，打开属性编辑器。在particleShape选项卡上，单击“添加动态属性一般框。在长名称写random_index。添加在从标量到每个粒子（阵列）和命中属性类型开关。
19. 在每个粒子（Array）的属性选项卡，random_index框已被添加。在空白处点击鼠标右键，选择创建的表达... ...从下拉框中。
20. 在表达式中键入文本框 - particleShape1.random_index = RAND（10）;（particleShape1.particleId == 1）种子（1）;
21. 要完整的表达，打开属性编辑器，并在常规选项>对象索引从下拉列表中选择random_index Instancer（几何更换）标签。把时间滑块移动到第一帧，点击播放，现在的细胞类型是随机分布的粒子之间。
22. 重复这个过程中，每节神经球。确保每一个新的发射器，instancer，随机指数有区别的名称和组织在Outliner窗口适当。

9。渲染/合成

1. 在渲染设置窗口中使用的部分渲染，改变从Maya软件的mental ray渲染器。
2. 打开“质量”选项卡，并根据光线追踪的改变设置为零的思考。开放的framebuffer的选项卡并更改从原料到Alpha，并取消选中Premultiply Colorclip。
3. 打开通道盒/层编辑和更改显示渲染层编辑器设置。
4. 选择进口的细胞类型，然后单击“创建新层，并指派选定对象的图标。
5. 重命名层环境闭塞。
6. 在新创建的图层点击鼠标右键，从菜单中选择属性。
7. renderLayer框的右侧，点击“预设”按钮，并选择从下拉列表中闭塞。
8. 选择mib_amb_occlusion1选项卡，改变从16到256个样品。
9. 重新打开通道盒/层编辑器下的“选项”选项卡，打开层层渲染所有的选项框。
10. 选择“综合”和保持层。
11. 随着ambientOcclusion选定图层，从正常乘以从下拉框中上面层列表下拉。
12. 渲染传递神经球，一旦打开，一旦与masterLayer打开ambientOcclusion层。保存为图像文件夹的项目中的IFF文件的图像。
13. 在Photoshop CS4中打开两个图像。 masterLayer顶部ambientOcclusion层，并将其设置为正片。创建背景和扁平化的形象。

讨论

该协议描述了一个程序，以文化和串行c​​ryosection产后海马的NPC，本地化免疫检测蛋白的表达，并最终重建和分析免疫阳性细胞在整个三维神经球的地形位置。通过结合细胞生物学文化和加工技术，显微成像（的OpenLAB，即兴创作和其他图像分析软件），图形编辑软件的能力（Adobe Photoshop的），三维动画和合成软件能力（Autodesk Maya中），我们提出了一个方法，重建整个细胞成分允许蜂窝整个神经球文化的地位和蛋白表达的忠实重建序列的二维图像的三维文化。此协议可结合登记和重建啶薄连续切片或通过较厚的连续切片，共聚焦ž栈具有同等的效力。因为单一的NPC在神经球以上的神经发生在产后脑gliogenesis过程中所观察到的许多阶段的文化概括克隆扩增，其三维结构的影响的重要全国人大代表在后代的命运的决定因素， ^暴露在相同的实验环境1。血统和蛋白表达的核心和外围串行神经干节的分歧表明，多个物理因素，包括单元格的位置，机械应力和剪切力，发挥重要的作用，在^调节全国人大生物学2。此外，缝隙连接蛋白的表达，分析在这里，已经显示出更改后，当NPC的3D神经球悬挂或层粘连蛋白与功能连接蛋白介导的通信的改变是否在塑料基板或3D免费培养细胞的基板上镀培养浮动文化^3。蜂窝位置全国人大命运的影响仍不清楚。这在技术上是具有挑战性的，在3D的文化血统和信号蛋白的抗原性评估需要破坏的3D架构，使所有细胞的细胞通透性和抗体访问的全国生物学分析空间位置的影响。在这里，我们显示，混合的可视化方法提供了一个确定的某些蛋白质是否表现出3D的文化独特的位置本地化的手段，可用于推断和蛋白质的功能和调节神经球内区域本地化测试，以及，也许是最重要，提供了需要研究的三维地形和蜂窝定位在三维培养全国人大命运的影响定位数据。

材料