微阵列分析FOR酿酒酵母</em

摘要

在这个协议中，在酵母中的基因表达（酿酒酵母）是改变曝光后添加过氧化氢（H诱导的氧化应激 ₂ O ₂），氧化剂。

摘要

在这个协议中，酵母（ 酿酒酵母 ）中的基因表达改变曝光后添加过氧化氢 ​​（H _{2 O} 2），氧化剂诱导的氧化应激。在实验过程中，酵母是在1/2X YPD 3X葡萄糖肉汤培养48小时。文化是分割成一个控制和治疗组。实验文化是用0.5毫米的H _{2 O 2}汉克斯治疗的缓冲液（HBSS）1小时。控制文化是唯一的HBSS治疗。总RNA是从两种不同的文化提取和转换通过一个多步骤的过程中，以生物素标记的cRNA产品。最后的合成产品带回UVM芯片的核心设施，Affymetrix公司的酵母基因芯片杂交。由此产生的基因表达数据上传到生物信息学数据分析软件。

研究方案

1。隔离的总RNA从酿酒酵母使用酶法裂解

1. 准备一个无RNase的工作区，使用核糖核酸ZAP（Ambion公司）。
2. 加入1毫升的无RNase水直接lyticase小瓶10 U / UL的解决方案作最后的工作准备新的工作lyticase试剂。涡和颠倒几次，以确保完全混合。这10个单位/μL的解决方案是稳定的12小时。
3. 准备新鲜的DNA酶我Qiagen公司的DNA酶试剂盒和存储解决方案，使用冰。
4. 标签为1.7毫升的离心管中与您的身份信息。管转移到适当的酵母培养物1.5毫升。
5. 离心管在5000 XG（全速约3 / 4）在室温下2分钟。小心取出上清液（互不干扰颗粒）使用微量和上清液。****重复步骤4，如果颗粒大小是太小或如果由导师表示.****
6. 加入1000μLDEPC水颗粒，旋涡，离心2分钟，在5000 XG。上清液。删除从酵母颗粒尽可能多的液体。
7. 添加下面的酵母沉淀和旋涡混合。
   
8. 在室温下30分钟孵育。
9. 轻轻旋流管，每10分钟产生原生质球。原生质球轻轻必须处理。检查，在显微镜下观察完成spheroplasting酵母。虽然研究的显微镜玻片上的酵母，添加少量的0.1％SDS导致酵母膨胀，形成完美的球体（即使出芽细胞）。这表明细胞壁已被消化。
10. 添加350μLB - RLT缓冲管和涡大力 1分钟。确保您的管紧紧握住盖子封顶封闭而震荡。此过程将裂解原生质球。
11. 250μL100％的乙醇添加管，并简要涡。沉淀后形成的乙醇此外，但这不会影响RNA的集合。
收集的RNA：标签的RNeasy旋转柱与您的身份informationand仔细转移从第10步的解决方案使用微量离心柱。要小心不要碰到吸管尖端的硅膜。关闭管和全速离心15秒。样品中的RNA，将坚持以硅胶膜离心柱。
12. 从收集管中取出离心柱。吸取液体的通过（收集管中的液体）到离心柱离心一次。倒掉收集管（通过流体流动），并将其放置到一个新的2ml收集管的离心柱。
13. 添加350μLRW1缓冲区的离心柱。这个解决方案是用来洗的RNA和去除盐类和溶解的细胞碎片。关闭管和全速离心15秒。
消化的DNA：删除从离心机的离心柱，打开管盖，加80μL的DNA酶我溶液的离心柱膜的中间。这一步将消化基因组DNA样本中的任何。关闭列盖，并在室温下孵育15分钟。
14. 离心柱转移到一个新的2ml收集管。
清洁洗涤RNA：添加350μLRW1缓冲区的离心柱和全速离心15秒。
15. 弃掉收集管，并将其放置到一个新的2ml收集管的离心柱。
16. 添加500μL的RPE缓冲液的离心柱，洗上的硅膜的RNA。关闭管和离心机全速15秒。
17. 弃掉收集管，并将其放置到一个新的2ml收集管的离心柱。
18. 硅膜洗净，再增加另外500μL的RPE缓冲区的离心柱。关闭管和全速离心15秒。
19. 放置在一个新的2毫升收集管，在1分钟的全速离心离心机离心柱，以确保任何残余的液体是从硅膜中删除。
恢复的RNA：的RNeasy离心柱转移到一个新的1.7 ml离心管已标记的样品信息。请注意接下来的几个步骤的开放，将留给新的管帽。
20. 小心吸取30μL无RNase水直接到中心硅膜。不要用吸管尖端的硅膜（见图表）。仔细一看，在执行此步骤。用双手引导吸管。确保水均匀分布在膜。
21. 离心柱在室温下孵育1分钟。全速离心30秒。
22. 小心地转移30μL在1.7 ml管到上述步骤22相同的自旋列硅膜中心恢复。将列在同一1.7 ml收集管中，1分钟，在室温下孵育。离心1分钟全速。这种双重洗脱确保RNA的最大金额是从膜回收。
23. 标签两个新的1.7毫升，用您的身份信息离心管中，所有回收的RNA样品传输管。
24. 4μL此示例转移到其他标记管。此示例将运回的UVM Nanodrop定量和定性评估RNA（这是验证在现场进行，在参加研究所的核糖核酸（RNA）的定量和定性分析）。
25. 所有样品置于冰上。
RNA定量：使用的Eppendorf分光光度计，分光光度计测量RNA样品的吸光度在1到50的稀释（加入1μl样品49μlH ₂ O）。
26. 评估RNA的质量，使用的E -凝胶（Invitrogen）的1.2％，预制琼脂糖凝胶电泳。
RNA定性分析：设置的E -凝胶电泳仪。预运行2分钟的凝胶，根据​​制造商的过程。预运行后，取出凝胶梳，并添加14μL水，每口井，每个样品加入1μl。充分混匀，向上和向下吹打。在一个大小比较后（BioLine简易梯子，我大小标准或Novagen公司PCR标记），使用一个适当大小的DNA梯状。记录在每个车道的样品。运行20分钟的凝胶。
27. 凝胶的照片。

2。第一链cDNA合成

1. 标签0.5 ml PCR管中，用您的身份信息。从上述实验确定从RNA的浓度，计算出样品的体积，以获得3.0微克。这一数额转移到管。加入足够的无RNase水带来的体积11.0 UL。
2. 添加1.0μLT7以oligo（dT） ₂₄试剂管。请一定要特别注意在这一步吸管尖卷，以确保所有的试剂转移。涡旋管和离心5秒的全速。管放置在一个热循环在70 ° C 10分钟。
3. 虽然70℃孵化过程中，准备在一个新的管的第一链主组合。一定要添加下列试剂为了，涡和全速离心5秒和管置于冰上。
   

SGbuffer	10μL
Lyticasesolution（10u/μl）	30μL

28. 经过70 ° C在孵化第2步完成后，在42 ° C 8μL第一链主在第3步混合添加一个热循环管和孵育60分钟。当第一链合成孵化完成后，将管上的冰。在此孵化，准备第二链主结构。

3。第二链cDNA合成

1. 请在一个新的管下面的第二个组成部分预混。保持它在冰上。涡和离心机的所有试剂使用前。在列出的顺序添加试剂。
   

第一链主的组合：
FirstStrandBuffer5X	4μL
0.1MDTT	2μL
10mMdNTP	1μL
SuperscriptII	1μL

大肠杆菌大肠杆菌 DNA聚合酶I（10U/ul）大肠杆菌
29. 旋涡全速管和离心5秒。
30. 在结束2个小时的潜伏期，而样品仍然是在16 ° C，加入2μLT4 DNA聚合酶试剂管。简言之涡和离心管和孵化在16℃，不超过5分钟。孵化长5分钟，可能会减少的cDNA的T4聚合酶3'to 5'exonuclease活动的质量。
31. 在5分钟的孵化结束时，加入10μL0.5 M EDTA停止T4 DNA聚合酶反应。存放于-20 ° C的管

4。沉淀的cDNA

1. 离心一分钟全速阶段锁凝胶管，以确保凝胶在试管底部。不涡锁相管。
2. 添加162μL底层从pH 8.0 Tris缓冲5秒酚/氯仿/异戊醇（PCI）的第二链cDNA合成反应管和涡的内容混合的内容（从上述实验中的总体积的cDNA合成步骤162 UL PCI步骤需要等量的水相和有机混合物）。
3. 所有的cDNA PCI混合物转移到锁相凝胶管使用micropipet。不要旋涡振荡锁相硅胶管。
4. 离心2分钟的全速。
5. 标记一个新的1.7 ml离心管。使用micropipet锁相硅胶管从顶层转移的新标记的1.7 ml管。尝试尽可能收集到的一层。
6. 添加以下的1.7毫升离心管和旋涡。
   

第二个组成部分预混
DEPC水	91 UL
5X第二链缓冲	30 UL
dNTPs（10MM）	3 UL
1 UL
4 UL
1 UL

DNA连接酶（10U/ul）
32. 放置在离心管与管面临的铰链和全速离心20分钟，在室温。
33. 轻轻取出小心，不要去打扰的cDNA颗粒的离心管。颗粒应该是粉红色，约一粒盐和上管下的铰链一边的大小。置于冰上，并立即进行下一步。

5。清洁的cDNA颗粒

1. 使用P1000的micropipet，小心地从管中删除所有的上清液。要小心不要去打扰颗粒。记住，沉淀是你的样品！
2. 加入500μL80％冷乙醇（-20℃保存 ^° C冰箱）管。轻轻盖管倒置慢慢几次。观看您的颗粒非常密切。如果颗粒变得超脱，地方管在机架和颗粒定居底部。或者，你可以管离心15秒全速颗粒回落到试管底部。
3. 使用P1000的micropipet，小心地取出乙醇非常小心，不要打扰沉淀。提示管，使尽可能去除尽可能多的液体。
重复步骤2和3。
4. 开管放置在机架或烘干箱为10-20分钟，其余的乙醇蒸发。干燥后的颗粒很容易丢失，一旦干。 Becareful处理管轻轻。完成后，接近上限。可视化的干燥颗粒，以确认它是目前在管。
5. 重悬在22μl无RNase水和管置于冰上的沉淀。

6。 InVitroTranscription（IVT）

1. 恩佐bioarray套件包含了所有需要准备从cDNA生物素标记的cRNA的试剂。
   一个主mixfor整个类将被作为follows.The教练准备将准备混合或指定类的人。这项工作必须在无RNase的地区。
   

乙醇（100％）	405 UL
NH 4醋酸	80 UL
颗粒涂料	1 UL

试剂2]试剂4]注意：
34. 标签0.5 ml PCR管中。在管和吸管高达结合以下，几次下来，组合。在离心机中旋转5秒的全速所有试剂，试管底部。
    

	AMT /样品	＃样品	共
试剂1 [10X反应缓冲]	4μl
4μl
试剂3 [10倍的数码地面电视]	4μl
4μl
试剂5 [20X T7 RNA聚合酶]	2μL
总容积	18μL

准备足够的样本数加一预混。这将确保足够的移液的目的。

7。清洁的生物素化的cRNA

1. 整个的cRNA样品转移到一个新的1.7 ml离心管。无RNase水加入60μL和350μL的RLT缓冲和5秒的旋涡。
2. 再加入250μL100％的乙醇和旋涡。
3. 标签的RNeasy旋转柱和整个的cRNA样品转移到列。小心不要触摸吸管尖端的硅膜。关闭盖子，离心15秒全速。
4. 从收集管中取出离心柱。吸管穿过液体（液体收集管）到离心柱和离心15秒后重试。
5. 放入一个新的2毫升收集管和吸管上的旋转列500视网膜色素上皮缓冲液的离心柱。关闭管和全速离心15秒。通过液体倒掉收集管通。放置到一个新的2ml收集管的离心柱。
6. 添加另外500μL的RPE缓冲区的离心柱。
7. 传送到一个​​新的收集管的离心柱和执行一列“晒”在2分钟的速度旋转。
8. 标签一个新的1.7 ml离心管，用您的身份信息。离心柱转移到该管。
9. 小心地转移30μL在1.7 ml管到相同的自旋列的RNeasy硅胶膜中心恢复。将列在相同的1.7 ml收集管中，1分钟，在室温下孵育。离心1分钟全速。这种双重洗脱确保cRNA的最大金额是从膜回收。
10. 传送到一个​​新的1.7毫升离心管和标签，生物素标记的干净的cRNA适当。
11. 确定的cRNA浓度上面所述在RNA分离过程中使用相同的步骤。记录的浓度和260/280的比例。

8。碎片的cRNA的目标准备

1. 标签0.5 ml PCR管中，用您的身份信息。 5微克的同等数额的cRNA的传输管。加入足够的无RNase水带来总量的16.0 UL，然后添加4.0 5X碎片缓冲液管。应在管总量20.0 UL。
2. 涡管和离心10秒。在94 ° C孵育30分钟，在一个热循环管。在冰上，把下面的潜伏期。

9。评估零散和不分段的cRNA，用琼脂糖凝胶

1. 设置的E -使用预制1.2％琼脂糖凝胶电泳仪。预运行2分钟的凝胶，根据​​制造商的建议
2. 每孔加入14μL水在E -凝胶。
3. 一巷凝胶加入4μL的DNA阶梯（BioLine简易梯，我的大小标准或Novagen公司PCR标记）
4. 运行20分钟的凝胶。
5. 可视化在透射电子凝胶。以凝胶图像。

10。 2.0酵母基因芯片杂交

代表性的成果：

图1。扫描Affymetrix的酵母基因芯片图像（Affymetrix基因芯片操作系统软件（GCOS））

图2。所有遗传成绩单（约6700个基因）的二维散点图，比较的控制和处理酵母数据。每个点都代表一个单一的基因。在紫颜色的基因表明基因差异表达，而在红色的基因是不。差异表达基因的说明标在相应的传说，而且大多数是在细胞周期控制在这个例子中涉及。 （Affymetrix基因芯片操作系统软件（GCOS））

图3。

图4。

cDNA的混合物	22μl
Enzomastermix [fromabove]	18μl
TotalVolume	40μl

讨论

应用和意义。

佛蒙特遗传学网络推广方案，在佛蒙特大学，进行本科推广到全州8个合作伙伴学士学位学院。而VGN宣传核心的目标是暴露在佛蒙特州国家的最先进的科学技术和资源使用的动手经验的本科生。芯片模块的描述是在2003年和随后升级。它已经提供了一个小型的课程或集成到现有的实验室课程参与机构。

作为本科教师采用的方案，并鼓励他们设计独特的实验，只要有适当的Affymetrix公司的基因芯片和注释可用。此模块的所有信息，包括实验室手册，参考资料和PowerPoint演示文稿，可在网上（佛蒙特州遗传学网络，2008年）。

关键步骤：

Spheroplasting：重要的是，在显微镜下观察成功spheroplasting。的SDS的使用是非常有益的，因为它会导致酵母肿胀在球体。重要的是观察出芽细胞以及形成球体。如果部分spheroplasting是观察，lyticase延长治疗建议。

颗粒清洁：

水应用膜的中心：在从膜的RNA洗脱步骤，它是重要的“唧”的水30μL直接向中心的硅膜。如果没有完成，这是可以离心列，并造成elutant可以重新申请再次硅膜。这可以根据需要多次重复。

修改和替代产品：

1. 替代核糖核酸（RNA）清理列可以被替换。例如USB准备缓解和Invitrogen公司的纯链接RNA试剂盒，和欧米茄核糖核酸（RNA）的清理工具包，仅举几例。
2. 裂殖酵母是一个可选的酵母。 Affymetrix基因芯片包含在同一芯片上的两个基因
3. 各种治疗方法和时间都可以使用。这可能包括药物治疗，温度处理，抗氧化剂等治疗时间也可能调整。
4. DNA酶处理可能不需要，因为描述的方法采用的Oligo（dT）引物的使用。
5. 的许多方法可用来量化RNA。 Eppendorf公司和Nanodrop只有被选中其易用性和测试的准确性。
6. 琼脂糖凝胶电泳进行使用标准的实验室设备。 E -凝胶是不是必需的，但，是可取的，因为它是核糖核酸酶自由，不需要等待凝胶凝固时间。
7. 订购产品的详细信息，已经提供。然而，许多一般的试剂，可以从多个供应商订购。
8. 一周期的cDNA试剂可单独购买，如果是这样的，更具成本效益。
9. 还有其他的目标准备的方法，但我们觉得这一个为学生提供更多的教学机会。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spetrophotometer
Thermocyler
离心
旋涡
搅拌板（2）
P - 10S移液器
P - 20的移液器：
P - 200的移液器：
P - 1000的移液器：
相机和透射
电子凝胶器械 Invitrogen公司 G6000 - 08
电子凝胶 Invitrogen公司 G6018 - 02
爱思进1.7毫升。清除 Krackler 383 - MCT175C
爱思进0.5毫升明确管 Krackler 383 - MCT060C
爱思进2毫升捕捉管 Krackler 383 - MCT200NC
P - 10的抗逆转录病毒提示框：电 BT10XL
箱的P - 100多家艺术提示：电 BT200
箱P - 20的抗逆转录病毒提示：电 BT20
酵母芯片
5毫升一次性无菌吸管
离心管架
KimWipes：
实验室外套
搅拌棒
培养瓶
Innoculating循环
Sharpies
手套
高压灭菌器磁带
搅拌棒
30％过氧化氢 EMD的微孔 386790
Qiagen公司的DNA酶试剂盒： Qiagen公司 79254
核糖核酸酶卸妆丹维尔科学 D1180
Harleco酒精100％ EMD的微孔 65347
ENZO的IVT的套件 ENZO ENZ - 42655 - 10
Lyticase：一瓶 VWR IC19012310
水，细胞培养级 EMD的微孔 4.86505
酵母培养： ATCC 18824
YPD肥肠粉 EMD的微孔 4.8504
D（+）葡萄糖，无水 EMD的微孔 346351
山梨醇 EMD的微孔 56755
EDTA EMD的微孔 4005
SDS溶液，20％ EMD的微孔 7990 - OP
颗粒涂料 EMD的微孔 69049
PCI核糖核酸DNA酶免费（7分装）：费舍尔 AC32711 - 500
7.5M NH4OAc费舍尔 ICN1987 5980
分段缓冲区（200毫米的Tris -醋酸，pH值8.1，500毫米KOAc，150毫米MgOA）
Trizma基地 Fiaher 50-899-90034
KOAc费舍尔 NC9757725
MgOA费舍尔 NC9681042
样染料 Invitrogen公司 10482055
PCR标记 EMD的微孔 69278-3
锁相凝胶费舍尔 FP2302820
单周期的cDNA试剂盒 Invitrogen公司 A10752 - 030
包含;
E。大肠杆菌的DNA聚合酶
的dNTP
T4 DNA聚合酶。
T - 7 oligod（T）
0.5毫升EDTA的pH值8.0
第一链缓冲
E。大肠杆菌RNaseH
第二链缓冲
E。大肠杆菌DNA连接酶
标二
数码地面电视