复合植物代苜蓿truncatula</em用于检测结瘤

摘要

我们演示了如何毛状根复合植物可以用来研究植物根瘤菌的相互作用和结瘤的难以转化的物种苜蓿truncatula。

摘要

发根农杆菌农杆菌tumerfaciens类似，可以转移到自治区根诱导质粒（RI）为基础的植物细胞外的DNA。 A。 发根 ，可引起植物组织毛状根形成和改造后形成的复合植物。在这些复合植物，一些再生根，转基因，携带野生型的T - DNA和工程的二进制向量，而芽仍非转基因，提供能源和增长的支持。这些毛状根复合植物不会产生转基因植物种子，但也有一些使这些非常有用的复合植物，在植物研究中的重要特征。首先，具有广泛的宿主范围，A.发根可以改变许多植物，尤其是双子叶植物，让各种物种的基因工程。其次，A.发根农杆菌感染组织和外植体直接，没有组织文化转型前是要取得复合的植物，使它们转化顽抗的植物物种的理想。此外，转基因根组织可以在几周内产生。 苜蓿truncatula，我们可以得到转基因根源，在尽可能短三个星期，比正常花香浸拟南芥转化速度更快。总体而言，毛状根复合厂技术是一种多用途的和有用的工具，研究基因功能和根相关的表型。在这里，我们演示了如何毛状根复合植物，可用于研究在难以转化的物种M.植物的根瘤菌的相互作用和结瘤truncatula。

研究方案

下面的协议已被用来产生毛状根的复合植物模型豆科植物M. truncatula。类似的协议已被改编为至少8个植物^物种 1-4 。我们用M。 truncatula毛状根复合植物研究在根和根瘤发育的基因功能。该协议分为四个部分：1）植物材料的准备; 2）产生毛状根复合植物; 3） 共生根瘤菌感染; 4）转基因root的身份。我们使用的是二进制向量含有绿色荧光蛋白（GFP）基因作为筛选转基因复合植物根³记者。以抗生素为基础的选择相比，绿色荧光蛋白为基础的筛查是快速，简便，价格低廉。在我们的构造，优化ER 表达绿色荧光蛋白基因是由超级ubiquitin启动子，具有很强的构的GFP转基因根源信号驱动，允许转基因和非转基因根源之间很容易区别。

1。植物材料的准备

1. M. truncautla种子收获在温室中种植的植物（相对湿度50％，16 / 8 h光/暗，22/18 ° C昼/夜温度） 。成熟的种子可以保存在4 ° C
2. 大约100粒种子scarified定期摇晃10分钟10毫升浓硫酸（95-98％，Sigma - Aldrich公司，MO）。
3. 种子轻轻摇动无菌水冲洗5-7次。
4. 种子在室温下在水中浸泡6小时，并保存在4 ° C为36-48小时同步发芽。
5. 大约20-30种子置于培养皿中的湿滤纸上传播。他们都保持在22 ° C，16 / 8 h光/暗周期^{，40μmol.m-2。-1}光的强度，为5-6天。
6. 发芽的幼苗被转移到土壤和温室放置一个月。

2。产生毛状根复合植物

1. 携带基因的二元结构转化成A 。使用标准协议的发根。我们已经设计了一套二进制向量含有绿色荧光蛋白基因作为标记，以促进转基因组织的筛选。这些载体含有不同的促销员都过度表达或沉默靶^基因 3,5网关克隆网站（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，CA） 。
2. 答：发根培养50毫升选择适当的抗生素的LB培养基在28 ° C时16-24小时。
3. 这种细菌的收集和再悬浮外径₆₀₀至终浓度氮气的免费植物营养液（表1和^6）= 0.3。
4. 为了支持毛状根再生，消毒的支持矩阵（“岩棉”，Hummert国际地球城，密苏里州），切成约³厘米3插头。我们放入一个培养皿中，4个插头。
5. 顶部每个插件使用枪头戳一个洞，以方便插入植。A.发根 （5毫升）被添加到每个插件。
6. 一个2-3个腋芽的拍摄部分切除一个斜斜切。外植体，然后插入插头，生长在22 ° C约三个星期。我们无需浇水保持苜蓿外植体为第10天，那么，水5毫升无氮的解决方案，必要时。我们发现，消除根尖分生组织，可能会减少不定根的形成。

3。共生根瘤菌（ 苜蓿根瘤菌 ）感染

1. 三个星期后，会出现一些不定根岩棉。复合植物毛状根转移到沙或蛭石（消毒），岩棉带或不带。它们是生长在温室22℃，16 / 8 h光/暗周期，和^{300μmol.m-2 -1}光照强度为一个星期。
2. 此前根瘤菌感染，S.根瘤菌 1201是在50毫升酵母中提取甘露醇在30 ° C（表2和^6,7）7天的中期培养。
3. 根瘤菌细胞重新悬浮稀释至终浓度的外径₆₀₀ = 0.08使用无氮营养液。一个10毫升的新鲜暂停的 S. 根瘤菌是适用于每个复合植物诱导根瘤的形成。

4。转基因root的身份，

1. 根瘤菌接种后两个星期，复合植物根深蒂固的水冲洗。根可以很容易地分开砂或珍珠岩水。
2. 我们置于紫外显微镜（尼康SMZ1500，激发460 - 500nm的，无障碍比510nm，505nm分色）毛状根。转基因根源GFP阳性和不定根的GFP负。然后，我们收集基层accordin克GFP信号，计数的结节，测量根长，并计算侧根密度。 GFP负根被用作控制。

5。代表性的结果

在我们的实验中，新的发根再生答 ：在2-3周后，从植发根 innoculation。在紫外显微镜，携带绿色荧光蛋白基因的转基因根表现出较强的绿色荧光（图1） 。再生根和GFP阳性根部分的金额取决于植和复合plants.On平均生长环境的条件下产生的根源，25％是转基因毛状根。为了提高转化效率， 1）塑料盖的厄运，如视频所示，就足以保持增长托盘的最初几天的湿度，植物只需要在头几天少量的水。过多的浇水，不利于形成毛状根; 2）农杆菌innoculant的浓度是非常重要的转型。过量的细胞是不是有利于毛状根形成根瘤的形成。根瘤的形成，浇水的解决方案的需求无氮，否则，将形成几个结节。

可以为起始原料，使用或entact幼苗的子叶产生毛状根的复合植物。上述协议的只有轻微的修改，是^ncessary从8其他组织产生毛状根。更重要的是，每个毛状根是一个独立的转化事件。因此，在一个复合植物中观察到的表型的几个transforamtion事件，需要重复确认在多个复合植物的总和

图1。 A.转基因根源，可以整理出毛状根 。 B.结节形成复合植物毛状根 ，我们把4 周龄 M. truncatula毛状根在紫外显微镜和GFP阳性根植物可以很容易识别。 （红色箭头：GFP的根;黄色箭头：非GFP的根）

股票	g/200ml	毫升股票/升
硫酸镁4 .7 H 2 O	12.3	2
氯化钙2 .2 H 2 O	14.7	4
K 2 HPO 4 .3 H 2 O	6.8	1
K 2 SO 4	11	4
铁CL 3 .6 H 2 O	0.49	2.5
微量营养素	见下文	1

微量营养素	克每升
H 3 BO 3	0.142
H 2 O的 MnSO 4。	0.077
硫酸锌4 .7 H 2 O	0.1725
硫酸铜4 .5 H 2 O	0.037
NaMoO 4。 H 2 O	0.024
CoCl 2。 H 2 O	0.0025
NISO 4	0.001

表1。Nitogen免费营养液

K 2 HPO 4	0.5克
氯化钠	0.1克
硫酸镁4 · 7H 2 O	0.2克
酵母提取物	0.4克
甘露醇	10克
pH = 6.8时

表2。酵母提取甘露醇培养基（每升）

讨论

产生毛状根复合厂，是一个快速简便的的方法来获取许多双子叶植物物种的转基因材料的大量。这种方法虽然不能产生转基因植物种子，它可以在几个星期内生产的转基因材料。该方法尤其适合建立组织培养或生成稳定的转化有困难的植物。多年来，我们已经利用这种技术来研究基因的功能，促进功能，小分子RNA，根和侧根发育，国防和非生物胁迫的反应，结瘤和其他共生的过程，激素的反应，代谢分析，基因分析，蛋白组学分析，并其他生物过程。该协议是强大的和可复制。