一个渐变产生的微流体装置，细胞生物学

摘要

我们描述了一个协议梯度产生的微流体装置，可以产生良好定义的微环境中的空间和时间的梯度微细。在这种方法中，梯度产生的微流体装置可用于研究细胞定向迁移，胚胎发育，伤口愈合，癌症转移。

摘要

的制造和研究细胞行为的一个梯度产生的微流体装置的操作说明。微流体平台是一个有利的实验工具，因为它可以精确地操纵流体流动，使高通量的实验，并产生稳定的水溶性的浓度梯度。相比传统的梯度发生器，聚二甲基硅氧烷（PDMS）的基于微流体装置，可以产生生长因子具有良好定义的配置文件稳定的浓度梯度。在这里，我们开发了三个独立的进气口简单的梯度产生的微流体装置。三微合并成一个微产生浓度梯度。 isothyiocyanate荧光素（FITC）-葡聚糖的分子量类似表皮生长因子（EGF），生长因子梯度的稳定和形状被证实。我们表明，使用这种微流体装置，暴露表皮生长因子的浓度梯度成纤维细胞对高浓度的迁移。细胞迁移和细胞迁移运动的方向定位，定量评估细胞跟踪分析。因此，该梯度产生的微流体装置，可能是有益的研究和分析细胞迁移的行为。

研究方案

A.梯度产生的微流体装置微细

1. 硅晶片被视为与活性氧离子（Harrick科学30W，5分钟，NY）。
2. 负型光刻胶（SU - 8 50，Microchem，MA）是在一个硅晶片上的1分钟1000转的旋涂。
3. 晶圆是软的烤在65 ° C为10分钟，随后在95 ° C为30分钟一个电磁炉。
4. 晶圆暴露在紫外线灯（200W），通过一个30微米的最小特征尺寸的透明度面具3分钟。
5. 晶圆是出炉后在65 ° C为1分，在95 ° C为10分钟。
6. 四掌握模具100微米厚的渠道是开发利用SU - 8光刻胶开发。
7. 含微晶圆被放置在一个Petri盘。
8. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）中（Sylgard 184）模具制造混合的有机硅弹性体和固化剂（10:1）。
9. 泗母模的PDMS混合物倒入。
10. 四母模是放在真空干燥器除去10分钟的气泡。
11. PDMS的是固化在70 ° C，1〜2小时。
12. 从四母模的PDMS模具揭下。

B.实验装置

1. 细胞的入口，出口，并注入进气口的PDMS微设备使用锋利打孔器打孔。
2. 是不可逆转的保税的活性氧等离子（Harrick科学30W，5分钟，纽约州）的设备和载玻片（2 × 3英寸）。
3. 聚乙烯管（PE 20，流式细胞Dickinon，MD）被插入到微流体装置注入进气口，随后连接到一个注射器泵。
4. 异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖（MW = 10kD，10μM，Sigma公司）和缓冲液（PBS，Invitrogen公司，CA）注入到微流体装置内的流体设备，以确认稳定的梯度。
5. 培养箱中培养1小时（37℃）的微流体装置内涂外基质（ECM）（即纤维连接蛋白）。
6. 的NIH 3T3成纤维细胞，胰酶消化分离。
7. 游离细胞被加载到微流体装置（宽800微米），在细胞密度2 × ¹⁰ 6细胞/ ml 。
8. 注入2毫升媒体和50 ng / mL表皮生长因子（EGF）是一个微流体装置，使用注射泵（0.05微升/分钟）生成可溶性梯度。
9. 细胞实时监测每5分钟，通过倒置显微镜（尼康TE的2000）。

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讨论

细胞暴露于稳定的表皮生长因子的浓度梯度，在向着更高浓度的迁移一个微流体装置。细胞跟踪分析，细胞迁移，趋化指数，细胞迁移运动的方向定位进行了调查。因此，该梯度产生的微流体平台可用于研究癌细胞转移，胚胎发育和轴突导向。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran-FITC	Reagent	Sigma-Aldrich	FD10S	Fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated-dextran (10kD)
hr-EGF		Invitrogen	13247-051	human recombinant Epidermal growth factor
PDMS		K.R. Anderson Co.	2065622	Poly(dimethylsiloxane) (PDMS), Dow Corning Sylgard 184 (8.6 lb)
Negative photoresist		MicroChem Corp.	SU-8 50
Si wafer				silicone wafer, 4 inch
Petri dishes
Polyethylene tubing		BD Biosciences	PE 20
PBS		Invitrogen
Fibronectin
NIH 3T3	cell-line			fibroblast cells
Inverted microscope		Nikon Instruments	TE 2000