肝细胞样细胞从人类胚胎干细胞群的鲁棒代

摘要

本文将着重从人类胚胎干细胞群的人肝胚层代。

摘要

尽管在模拟人类药物的毒性取得了进展，许多化合物在由于预见的副作用临床试验失败。临床研究的成本是巨大的，因此它是至关重要的，更预测毒理学屏幕在药物开发（Greenhough等2010）早期开发和部署。人肝细胞的代表，目前黄金标准模型评价药物毒性，而且是一种有限的资源，表现出变量的函数。因此，使用永生细胞株和动物组织模型是经常雇由于其丰富度。虽然这两个来源的信息，他们是有限的功能较差，物种变异和/或文化的不稳定（Dalgetty等2009）。多能干细胞（PSCS）是一个有吸引力的替代来源的人类肝细胞样细胞（HLCs）（Medine等2010）。物业服务公司的自我更新和分化，在成人中发现所有的体细胞类型的能力，从而代表分化细胞的一个潜在的不竭源泉。我们已经开发出一种程序，是简单，高效，适合自动化和产量人类功能HLCs（Hay等人2008;弗莱彻等人2008; Hannoun等2010;佩恩等人2011年和干草等2011）。我们相信我们的技术会导致可扩展性生产的药物研发，疾病模型，额外的有形的设备建设和可能基于细胞移植治疗HLCs。

研究方案

1。所有化工股的前期准备工作和文化的塑料制品的涂层

在一个组织文化罩在无菌条件下进行的所有步骤。

1. 制备碱性成纤维细胞生长因子（hbFGF）
   1. 准备10％BSA在PBS和过滤解决方案，通过一个0.22微米的过滤器。
   2. 准备从10％BSA溶液0.2％的BSA溶液。
   3. 加入10毫升0.2％BSA solution/100微克hbFGF。
   4. 5 mL 10％的BSA溶液通过过滤器过滤，预湿用0.22微米的过滤器。丢弃10毫升BSA的洗。
   5. 通过预洗过滤器的过滤hbFGF。
   6. 分装无菌eppendorfs和储存在-20 ° C的hbFGF
2. 制备人类激活素A股解决方案
   1. 加入1毫升0.2％BSA的注射器和预湿的过滤器。
   2. 稀释激活素A在0.2％BSA的股票浓度到100微克/毫升。
   3. 过滤的活性N个解决方案，并分装在无菌eppendorfs，储存在-20 ° C
3. 制备小鼠Wnt3a联合解决方案
   1. 加入200μL的PBS到10微克/毫升的股权集中度的Wnt3a 2微克小瓶。
   2. 分装在无菌eppendorfs并储存在-20 ° C
4. 制备的人类肝细胞生长因子联合解决方案（1000X）
   1. 股票的10微克/毫升浓度稀释在PBS的肝细胞生长因子。
   2. 筛选肝细胞生长因子的解决方案，在无菌eppendorfs等份，储存在-20 ° C
5. 制备抑瘤素中号联合解决方案（1000X）
   1. 稀释在PBS OSM的股票到20微克/毫升的浓度。
   2. 过滤器的OSM的解决方案在无菌eppendorfs和分装，储存于-20 ° C
6. 文化与基质胶镀膜塑料制品
   1. 4解冻的基质胶10毫升股票瓶过夜°冰，然后加10毫升KO - DMEM充分混合，使用冷冻移液器和存储1毫升分装在-20 ° C。
   2. 解冻在4 ° C的至少2个小时或过夜，以避免形成一种凝胶基质胶等份。
   3. 添加5毫升冷KO - DMEM的基质胶，拌匀用移液器。
   4. 化妆〜15毫升冷KO - DMEM和混合使用吸管。
   5. 基质胶涂板或瓶（表（一））

板/保温瓶	音量/井或保温瓶
12孔板	每孔0.5毫升
6孔板	1毫升每口井
25厘米2烧瓶	2毫升每烧瓶

表1推荐的基质胶卷涂层典型的塑料制品对人类胚胎干细胞培养。

6. 6. 4℃过夜孵育涂层板或烧瓶° C或房间tempature 1小时后方可使用。
   7. 在4 ° C板或已与基质胶涂层烧瓶可以存储长达1个星期。他们应该清楚地标示他们涂的日期。放弃一个星期内不使用任何板或烧瓶。
      1. 在此之前允许使用包被的培养容器中拿出一个组织文化罩内室温。
      2. 之前使用吸基质胶，以及或烧瓶加入细胞悬液。

2。人类胚胎干细胞的文化和表征的日常维护

1. 复苏的人类胚胎干细胞线
   1. 取出胚胎干细胞从液氮储存，并迅速在37℃水浴解冻。
   2. 仔细细胞悬液转移到无菌试管中几毫升温暖中等。
   3. 颗粒细胞离心低转速（1000 RPM）为5min。
   4. 吸上清，轻轻resus挂起了热烈的ES介质和板在MEF饲养层细胞。
   5. 每天用新鲜的ES培养基后subconfluence，细胞重新提供细胞，细胞需要传代。
2. 常规胚胎干细胞的维护
   胚胎干细胞是生长在基质胶涂层板或烧瓶。细胞需要进行审查，并每日灌胃：
   1. 在显微镜下检查污染，细胞形态和合流。
   2. 吸用过的介质。
   3. 添加新鲜的小鼠胚胎成纤维细胞条件培养液（MEF - CM）+人碱性成纤维细胞生长因子（终浓度为4纳克/毫升）或其他无^血清媒体6适当的音量。
3. 胶原酶传代细胞
   人类胚胎干细胞线（H1，H9和RCM - 1）将达到汇合后每隔5-7天在一个1:3的分流比传代。在基质存在的早日通过人类胚胎干细胞生长慢，基质胶的时间可以成为一个重要因素。人类胚胎干细胞不应该离开的时间超过14天在同一基质胶由于基质的降解，在这种情况下可能有必要通过分流比在1:1或1:2的细胞，如果细胞subconfluent。
   
   酶孵化
   1. 在一个组织文化罩在无菌条件下进行的所有步骤。
   2. 确保有一个新的基质胶涂菜或容量瓶中，每节1.6准备。
   3. 细胞所需的分割比率的决定。一个涉及许多因素决定分流比：
      1. 殖民地低基质的高级别：可以传回以及一个较小的大小，或可传1:1将摆脱一些基质，从而增加殖民地基质的比例，促进人类胚胎干细胞的生长。
      2. 基质的高层次大型菌落，根据菌落数，可传1:1或1:2，如果有足够大的人类胚胎干细胞的殖民地。
      3. 典型的人类胚胎干细胞与一个小STROMA或无基质和/或一些分化，可以1:2或3代。
      4. 吸从井里或烧瓶媒体。
      5. （2毫升PBS - ₂氯化镁，氯化钙_2）洗一次。
      6. 加入适当体积的胶原酶（200 U / mL的KO - DMEM稀释）和37 °彗星2-5分钟。从2分钟的起定期检查，在显微镜下（1分钟间隔）。分化的细胞在点开始起飞，殖民地开始解除在边缘传代细胞准备。
   刮池的人类胚胎干细胞
   3. 6. 吸胶原酶。
      7. （2毫升PBS - ₂氯化镁，氯化钙_2）洗一次。
      8. MEF - CM取决于分流比，使用细胞刮刀物理删除从井或烧瓶表面的细胞中添加适当的音量，然后磨碎根TLY由移液器上下的2-3倍，用10毫升吸管。它是重要的人类胚胎干细胞被保存在细胞团块，不分解成单个细胞。
   Replating的人类胚胎干细胞
   3. 9. Replate到新的基质胶涂层烧瓶或水井产生的细胞悬液。
      10. 设为MEF - CM量高达4毫升6孔板以及。
      11. 当放置在孵化器搅拌中的细胞组织培养容器，以确保甚至尽可能的菌落分布殖民地往往定居板/烧瓶影响细胞replating和分化的组织培养中心。
4. 流式细胞仪检测胚胎干细胞种群的常规鉴定
   1. 人类胚胎干细胞数量干细胞标记物，如10月3 / 4，茶1-60和SSEA - 4通过每月一次的流动流式细胞仪的检查。
   2. 人类胚胎干细胞人群从他们的基板单细胞悬液后与胰蛋白酶/ EDTA（Invitrogen公司）5分钟的治疗。
   3. 在1 × 10 ⁶细胞/毫升含0.1％BSA和0.1％的叠氮化钠在PBS重悬的单细胞。
   4. 在4 ° C孵育40分钟，在相应的抗体细胞的准备。
   5. 0.1％BSA和0.1％的叠氮化钠去除未结合的抗体和重悬到终体积为100μL，并用流式细胞仪分析为辅，用PBS洗涤细胞两次。
   6. 每个样品使用的流式细胞仪口径流式细胞仪配备有一个488 nm激光为30000-40000“活”事件的数据采集和分析使用CellQuest软件（Becton Dickinson公司，加利福尼亚州圣何塞）。不染细胞作为对照组。被排除在使用前向散射和侧向散射参数的实时电子门分析碎片的死亡和细胞凋亡。

3。分化肝胚层的胚胎干细胞ATION

1. 制备的肝胚层的胚胎干细胞分化的媒体。所有媒体的编制应在组织培养罩在无菌条件下进行。
   1. 制备的RPMI：B27吸介质内胚层分化
      1. RPMI - B27的培养基，混合RPMI 1640培养液（500毫升）和B27（50X，10毫升）
      2. 涡流混合组件。
      3. 所有组件添加到过滤装置过滤器在真空条件下，储存在4 ° C。
   2. SR - DMSO肝细胞分化的培养基的制备
      1. SR -二甲基亚砜介质，混合KO - DMEM 80％，20％的KO - SR，L -谷氨酰胺0.5％，1％非必需氨基酸，0.1mm的β-巯基乙醇和1％DMSO。
      2. 过滤真空除下的解决方案，存储在4 ° C和等份，并存储在-20 ° C，如果需要的话。
      3. 使用4毫升，每一个6孔培养板，6％的T25烧瓶毫升。
   3. 制备L15 HEPA成熟中期tocyte成熟
      1. 对于L - 15培养基，混合500毫升莱博维茨的L - 15培养基，tryptose磷酸盐肉汤（终浓度为8.3％），热灭活小牛血清（终浓度为8.3％），10μM氢化可的松21 -琥珀酸单酯，胰岛素（牛胰腺1微米），1％L -谷氨酰胺，0.2％的抗坏血酸。
      2. 过滤真空除下的解决方案，存储在4 ° C和等份，并存储在-20 ° C，如果需要的话。
   4. 最终的RPMI：B27的吸液的制备
      1. 免除实验（6孔板每孔1毫升，2毫升每T25烧瓶）所需的卷吸中等。
      2. 激活素A的终浓度为100毫微克/毫升。
      3. 重组Wnt3a添加到终浓度为50毫微克/毫升。
      4. 拌匀，媒体现在准备使用。
      5. 这个最后的媒体应新鲜每一天。
   5. 最终的L - 15成熟中期的制备
      1. 配制所需实验（4毫升6孔板，每孔和6％的T25烧瓶毫升）的L - 15培养基体积。
      2. 肝细胞生长因子加入到终浓度为10毫微克/毫升。
      3. OSM的终浓度为20毫微克/毫升。
      4. 拌匀，媒体现在准备使用。
      5. 这个最后的媒体应新鲜每一天。
2. 底漆以明确的内胚层的胚胎干细胞
   1. 文化人类胚胎干细胞（H1，H9和RCM - 1）和基质胶涂层板用小鼠胚胎成纤维细胞碱性成纤维细胞生长因子补充MEF - CM上传播。
   2. 启动肝分化的人类胚胎干细胞时达到的汇合水平约为30％-60％（取决于人类胚胎干细胞线更换与吸液的MEF - CM（辅以100毫微克/毫升激活素A和50毫微克/毫升的RPMI 1640 - B27的） Wnt3a。
   3. 在吸液培养的细胞为3天（改变中期每24小时），并与激活素A和Wnt3a最终吸液是由新鲜的每一天。
   在吸液72小时后，我改变中期到第二个分化培养基（SR - DMSO）为5天（改变中期每48小时）。
   4. 在8天的文化，在成熟和维护介质的细胞（L - 15）辅以10毫微克/毫升hHGF和20毫微克/毫升OSM的9天（改变中期每48小时）。成熟和维护与hHGF和OSM的介质是由新鲜的每一天。
   5. 细胞逐渐表现出形态的变化，从一个高低不平/三角形状特征的肝脏形态，显示一个多边形的外观（图2A）。
   6. 肝细胞分化的原理：

4。表征的人类胚胎干细胞源性肝胚层

1. 免疫染色
   1. 人类胚胎干细胞衍生HLCs PBS洗2次，每次冲洗1分钟洗净。
   2. 修正了4％煤灰的HLCs，在室温为20分钟，（单元格S可以存储在PBS在4 ° C，并在以后的日子染色）。细胞也可以用冰冷甲醇固定在-20 ° C 10分钟
   3. 两次清洗细胞，用PBS洗5分钟，每个。
   4. 核染色（此步骤不是必需的，如果使用甲醇固定）100％的乙醇，在室温下孵育2分钟的细胞。
   5. 两次清洗细胞，用PBS洗5分钟，每个。
   6. 座与PBS / T（0.1％之间）/ 10％BSA细胞在室温下1小时。
   7. 取出阻塞的缓冲区，并添加各自的主抗体稀释在PBS / T（0.1％之间）/ 1％BSA孵育在室温下2小时，或隔夜在4 ° C与躁动。
   8. 清洗细胞用PBS / T（0.1％之间）/ 1％牛血清白蛋白在室温下，每次5分钟洗3次。
   9. 添加适当的辅助的Alexa Fluor抗体（1:400）在PBS稀释的细胞，并在室温孵育1小时在黑暗搅拌。
   10. 清洗细胞3次，用PBS洗5分钟。
   11. 每口井山MOWIOL 4-88和DAPI（1:1000）。盖以及与盖玻片，盖玻片，轻轻按下，以确保所有气泡已删除，并储存于4 ° C黑暗环境中。
2. RNA的分离和提取
   1. 人类胚胎干细胞用PBS吸派生HLCs洗净。
   2. 加入1毫升Trizol试剂，室温孵育5分钟。
   3. 刮在一个1.5毫升的Eppendorf（储存于-80℃，以后使用如果需要的话）的细胞和地方。
   4. 小指和反相混合加入0.5 mL氯仿，确保这是在通风柜。
   5. 离心15分钟13000转的解决方案，在4 ° C。
   6. 收集到一个干净的Eppendorf的水层和地方，确保没有污染从接口。
   7. 由反相添加1毫升异丙醇和混合，在室温下离开10分钟降水大老的RNA。
   8. 在10分钟13000转离心4 ° C。
   9. 吸弃上清液，并确保不干扰RNA沉淀。 0.5毫升70％的乙醇清洗，在室温下5分钟离开。
   10. 5分钟8000转离心4 ° C。
   11. 吸乙醇和离开干在室温5-10分钟。
   12. 一旦所有的乙醇蒸发，在30μL的去离子水重悬沉淀。存放于-80℃，以后使用的RNA。
   13. 量化RNA的浓度，使用一个nanodrop。
3. 逆转录聚合酶链反应
   1. 设置使用先前分离出的RNA（200毫微克），随机六聚体，核苷酸逆转录酶（10毫米）和一个薄壁的0.5 mL Eppendorf公司在各自的缓冲区的一种反应。
   2. 设置负RT，没有上述逆转录反应。
   3. 管放入热循环仪，PCR仪，并成立后的Program：
      1. 37℃ - 5分钟（1个周期）
      2. 42℃ - 1小时（1个周期）
      3. 95℃ - 5分钟（1个周期）
   4. 存储供以后使用如果需要在-20 ° C的cDNA。
4. TaqMan探针定量逆转录聚合酶链反应收获细胞，整个分化协议在不同的时间点。提取RNA，进行逆转录定量PCR，使用以下的引物和含量上的需求，仪（Applied Biosystems）协议：
   1. 10月4 Hs03005111_g1
   2. Nanog的Hs02387400_g1
   3. 白蛋白Hs00910225_m1
   4. α-甲胎蛋白Hs00173490_m1

对于RNA的分离和提取，请参阅3.3.2节

1. 逆转录和TaqMan探针定量PCR
   1. 1微克的RNA和反向转录为cDNA，使用Invitrogen的上标III逆转录试剂盒，为制造商的说明。
   2. 1μL的cDNA在25μL的TaqMan应用生物系统公司，18S核糖体控制的引物和Invitrogen公司的2倍铂的qPCR supermix UDG与ROX适当的引物和适当的水体积组成的反应。
   3. 拌匀，放入两个井的是96或384以及定量PCR板10μL每个样品。
   4. 一旦所有样品加载，再加上适当的控制），密封板和分析应用生物系统公司7900HT的TaqMan机。
   5. 结果表示为在控制样本的相对表达。

5. 功能分析人类胚胎干细胞源性肝胚层细胞色素P450检测- http://www.promega.com/tbs/tb325/tb325.pdf
   1. 孵育17天的胚胎干细胞衍生与5个小时，在37℃（N = 3）特异底物。作为一个使用组织培养基阴性对照和孵化，在37 ° C为5小时。
   2. 收集上清，每制造商的指示进行检测。
   3. 衡量基底活动的相对水平和正常化，以每毫克蛋白，由BCA含量（http://www.piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=02020101）确定。

注释

1. 所有卷都基于一个6孔板格式。调整相应的卷所需的板或瓶。
2. 所有吸，分化和成熟的过滤介质是在真空状态下方可使用。
3. 底漆，分化和成熟培养基保存于4 ° C的时间不超过2个星期。评估需要多少介质实验和分装其余的媒体，并在-20 ° C保存以供将来使用。
4. 基质胶是按照制造商的说明; 1毫升分装，可在-20 ° C保存，直到使用。
5. 格罗一旦作出，并分装WTH因子可以储存在-20 ° C和解冻时，可以保存在4 ° C的时间不超过2个星期。
6. 通常用来描述人类胚胎干细胞衍生HLCs的主要抗体是白蛋白（1:250，Sigma - Aldrich公司，圣路易斯，密苏里州）。

5。代表性的成果：

人类胚胎干细胞的表征保持前肝分化

为了表征在研究中使用的H9的人类胚胎干细胞的干细胞状态，我们所研究的一些参数。细胞表现出人类胚胎干细胞的形态，小，细胞排列紧密，生长在定义的殖民地（图1A），并表示多能干细胞的基因标记，10月3 / 4和Nanog（图1B）。我们没有找到一个H7的人类胚胎干细胞线阳性对照相比，在这些基因的表达显著差异。此外，人类胚胎干细胞人口的90.1％是干细胞标记SSEA - 4（图1C）阳性。

他SC分化为肝胚层

人类胚胎干细胞可以有效地分化体外肝胚 ​​层（Hay等人2008）。分化第9天，收获细胞和分化的人类胚胎干细胞，以HLCs评估。据此前报道的人类胚胎干细胞展出了一系列深刻的形态学变化，第9天，展出早期肝细胞的形态，发展一个多边形的外观（图2A）。此外，10月3 / 4的下调超过9天的时间当然是观察（图2B）。相比之下，肝成绩单AFP和白蛋白是从第7天起上调（图2C）。

在体外肝胚 ​​层的成熟

体外成熟，在肝脏内胚层，使用既定的程序（Hay等人，2008年）。在最后一天的分化培养人体肝脏标志物白蛋白，AFP和E - cadherin的免疫染色。使用我们的HLCs产量过程通常是90％（Hay等人，2008;嫩等2010;佩恩等2011）。 HLCs白蛋白，α-甲胎蛋白和E - cadherin（图3）染色阳性。

图1。在这项研究中使用人类胚胎干细胞的表征 。 （一）相差显微镜图像代表的人类胚胎干细胞的形态观察在文化，4倍和10倍的放大倍率。使用尼康TE3000 / U倒置显微镜（二）人类胚胎干细胞培养八聚体（10月3 / 4）积极和Nanog阳性，被抓获的图像。 H7的人类胚胎干细胞被利用作为一个全能性基因表达水平的控制。相对表达是指感应褶皱与内源性基因控制相比，β- 2 -微球蛋白（C）流式细胞仪图显示人类胚胎干细胞表面标志物表达水平，包括舞台的特定胚胎抗原SSEA 4 。

69/2969fig2.jpg“/>
图2。 （一）相衬显微镜观察文化的分化第9天的人类胚胎干细胞源性肝胚层形态的代表图像，X4及X10放大倍率（B）在基因表达变化的表征。 RNA提取和基因分析定量聚合酶链反应，呈现逐步下调的未分化细胞的基因表达（10月3 / 4）和（三）肝细胞的基因表达上调（白蛋白和α-甲胎蛋白） 。与内源性基因控制，β- 2 -微球蛋白在分化0天相比，相对表达是指感应褶皱。表示，P <0.05和P <0.001表示*** 0天的人类胚胎干细胞的比较，以衡量学生t检验。错误条代表1个标准差。

图3。通道aracterisation的人类胚胎干细胞衍生的肝胚层
免疫组化显示肝细胞标记，白蛋白，AFP和E - cadherin在人类胚胎干细胞（H9）的衍生肝胚层的表达。阴性对照执行相应的免疫球蛋白G（IgG）和图像显示的代表。

图4。人类胚胎干细胞（H9）的派生HLCs展出的代谢活动。 H9的第17天，分化HLCs展出CYP3A的代谢活动（N = 6）。

讨论

我们已经开发出一种简单，同质化和高度在体外重现的模型生成可扩展人类HLCs水平。我们的模式已经被验证由外部的合作实验室。我们经常干细胞HLCs使用我们在内部发展的标志和具体肝功能试验（其中大部分是市售）工具盒的特点。在我们的进程的关键阶段是：维持干细胞多能性;直接明确的内胚层干细胞分化能力;肝胚层的同质文化的规范，并能够推导出成熟的肝胚层参展在体外的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
一抗
抗原*	类型	供应商	稀释
白蛋白	鼠单克隆	西格玛爱秩序	1 / 500
E - cadherin的	鼠单克隆	Millipore公司	1 / 100
甲胎蛋白	鼠单克隆	西格玛	1 / 500
SSEA - 4 FITC	鼠单克隆	Biolegend	1 / 100
IgG抗体	鼠单克隆	DAKO公司	1 / 500
二抗
抗鼠FITC标记的共轭	山羊单克隆	Invitrogen公司	1 / 400