类固醇受体的生化重建•Hsp90的蛋白质复合物和配体激活绑定

摘要

一个在体外准备从纯化的蛋白质和细胞裂解液的功能性糖皮质激素受体（GR）•HSP90蛋白复合物的方法描述。该方法利用免疫吸附的盐剥离和蛋白质复合体重组重组的GR。辅助因子和缓冲条件的重要性进行了讨论，作为潜在的方法应用。

摘要

HSP90是一个重要和非常丰富，已发现调节超过150个的真核细胞信号蛋白，包括转录因子（如核受体，P53），并参与细胞周期蛋白激酶（如SRC，英国皇家空军，Akt激酶）的分子伴侣蛋白，肿瘤的发生，细胞凋亡和多种真核细胞信号转导通路^1,2。许多这些“客户”HSP90蛋白，类固醇受体大会•HSP90复合物是最好的定义（ 图1）。我们在座的适应性强的糖皮质激素受体 ​​（GR）的免疫测定和体外GR•HSP90重组的方法，可随时用来探测HSP90真核细胞的功能活动，HSP90介导的类固醇激素受体 ​​配体的结合，以及分子伴侣辅助因子的要求。例如，此法可用于测试HSP90的辅助因子的要求和加入外源性化合物的重组进程的影响。

遗传资源已经为研究HSP90一个特别有用的系统，必须绑定到HSP90，因为受体有一个开放的配体结合裂访问类^固醇 3 。内源性的，unliganded的GR非共价的约束，以HSP90的哺乳动物细胞的细胞质中。如发现内源性GR•HSP90 heterocomplex，GR配体结合裂，是开放的和有约束力的类固醇的。如果从GR HSP90不赞成或如果其功能受到抑制，受体是无法绑定类固醇和需要重组的GR•HSP90 heterocomplex的结合活性类固醇之前^恢复 4 。遗传资源，可以从细胞细胞质使用单克隆抗体免疫沉淀，如HSP90蛋白复合物，以遗传资源，可以通过免疫印迹检测。免疫沉淀的GR结合活性的类固醇，可以由孵化与^[3H]类固醇immunopellet 。

以前的实验已经证明HSP90介导的GR配体裂约束力的开放需要HSP70，第二个分子伴侣，也为真核细胞的活力至关重要。 HSP90和HSP70的生化活性催化合作伴侣蛋白合，hsp40，和^P23 5 。一个多蛋白的伴侣机械HSP90，HSP70，合，和hsp40是在真核细胞的细胞质内源性目前，网织红细胞裂解液提供了一个伴侣，含有丰富的^蛋白质来源6。

提出的方法，GR是immunoadsorbed从细胞细胞质和内源性hsp90/hsp70伴侣用温和的盐条件下的机械剥离。盐剥离的GR然后孵育•HSP90 heterocomplex和类固醇的结合活性^的激活7，网织红细胞裂解液，三磷酸腺苷^，和K +，这在重组的GR结果。可以利用这种方法来测试各种伴侣的辅助因子，新的蛋白质，和实验HSP90或GR抑制剂的影响，以确定其HSP90介导的类固醇具有约束力^8-11的功能意义。

研究方案

1。制备细胞细胞质中含有功能的GR

1. 技术说明：所有的缓冲区应冷藏，此协议，包括离心和孵化，每一步应在冰上或在4 ° C，除非另有说明。低温是必不可少的，以防止GR和蛋白质复合物的降解。
2. 使用冷冻离心机，取得了〜1-5毫升颗粒细胞功能的GR表达了高浓度。在遗传资源丰富的细胞来源的例子包括：小鼠成纤维L929细胞，它表达的内源性遗传资源的高浓度，并昆虫重组GR杆状病毒（如p2Bac ^经理杆状病毒12）已被感染的细胞。大约15-20毫升包装细胞获得每昆虫杆状病毒细胞培养升。细胞应呈几何级数增长，前收获。在5000 × g离心5分钟的细胞悬液。
3. 汉克斯“缓冲盐溶液15毫升，冲洗细胞沉淀三次。清洗，轻轻悬浮5分钟，随后在5000离心沉淀× G。最后一次洗涤，彻底去除上清。
4. 准备7.5毫升含HEM的缓冲液（10 mM的HEPES，1毫米EDTA，20毫米钼酸钠，pH值7.4），1毫米苯甲基磺酰氟（PMSF），和3完成迷你蛋白酶抑制剂的地面片的缓冲一个同质化。 PMSF和完整的小片在随后的步骤防止发生水解。完整的迷你片，可以很容易地地面到细粉用迫击炮和杵。添加1.5卷同质缓冲细胞沉淀。
5. 破裂Dounce同质化（50杆）或冻结/解冻（3次）技术的细胞。 Dounce同质化可能维持改善内源性的GR•HSP90蛋白复合物，并更快地完成。冻结/解冻提供研究人员一个机会，暂停在这一步的协议，并继续在稍后的时间。 Dounce同质化应与冰桶匀浆，以防止蛋白质的降解。冻结/解冻，可完成冻结的离心管中，含有颗粒同质化缓冲液的细胞用液氮，干冰或-20 ° C孵化，在30℃水浴解冻。
6. 通过超速离心分离从破裂的细胞颗粒物质的GR含有细胞质。在100,000 × g匀浆转移耐用的超速离心机管，对群众的平衡管和离心30分钟。
7. 取出500μL分装在长期储存的1.5毫升离心管，在-20细胞质（上清液）和存储° C。要保留的最大的功能GR活动，闪存冻结30秒甲醇干冰浴前存储在液态氮或孵化分装。一定要小心，以避免皮肤直接接触冷却剂。

2。从细胞细胞质遗传免疫吸附

1. 技术说明：图2提供了这个协议的步骤2-5的示意图。
2. 准备一个包含immunoadsorb在第1步准备的受体对GR提出一个单克隆免疫球蛋白（IgG）抗体的免疫吸附混合物。在1.5 ml离心管中，结合解冻的GR - 100μL含有细胞质中，200μLTEGM缓冲区（8毫米的工商业污水附加费，4毫米EDTA，50毫米的NaCl，20毫米的钼，10％（V / V）甘油，pH值7.6） 100μL20％的蛋白质A -琼脂糖凝胶（PAS）浆（V / V，准备在TEGM缓冲区），5微克抗- GR的单克隆抗体（如BuGR2）。钼是包括在TEGM缓冲区，以帮助稳定GR - HSP90 heterocomplex，这可能是有用的，以测定的内源性heterocomplex类固醇结合^活动 13 。
   1. 反GR抗体纯化蛋白上市。另外，它可能会取得反GR的含有IgG的腹水免疫吸附混合物中加入10μL。腹水是由小鼠注射抗- GR杂交瘤细胞（如FiGR杂交瘤细胞^14），并获得腹水和在这些实验中使用的是近似的抗体浓度为0.5μg/μL，Bradford法测定。
   2. 准备一个阴性对照样品，使用GR - 含有细胞质中，TEGM缓冲区，和首席助理秘书长（如上所述），一个IgG和5微克不承认的GR，HSP90，或其他分子伴侣蛋白（简称为“非免疫”抗体）。
   3. 由于比较大的PAS珠子大小，使用切割时的P - 200吸管尖转移的20％浆PAS样品管。切吸管提示准备切片2-3毫米市售的P - 200提示结束，从而增加了吸管尖光圈。
3. 将样品在垂直旋转的轮子和2小时为一个不断旋转的最低孵化。样品可能长达8小时的孵育，而不失去活性。
4. 在免疫吸附孵化结束，去除未结合的蛋白质抗体考绩颗粒（“immunopellet”）离心。从immunopellets分开使用一个冷冻离心机1分钟编程10,000 × G离心的上清液，然后用1 ml TEGM缓冲区和涡流清洗两次。经过离心和洗涤之间，弃上清，谨慎，不打扰颗粒。
   1. 删除所有在第二洗的结论上清。为了确保没有颗粒不经意地吸气，用压接的P - 200吸管尖，最终上清愿望。轧花吸管提示准备压扁市售的P - 200的提示使用镊子。

3。从遗传资源immunopellet内源性HSP90分解（“盐剥离”）

1. 要洗immunopellet准备在第2步，添加355μL甘醇缓冲液（TEGM没有钼酸钠缓冲液）和45μL5 M氯化钠（NaCl浓度最终= 0.5米）。
2. 将样品在垂直旋转的轮子和不断旋转的1.5小时的孵化。样品可以孵育长达2个小时，但是，较长的孵化，可能会导致减少蛋白质的恢复和功能活性较低。
3. 取出离心的immunopellet未结合的蛋白质。 1分钟，在10000 × G.旋转样品洗一次1毫升甘醇缓冲​​区，并一度以1毫升10 mM的HEPES缓冲液，pH值7.4。
4. 删除所有在第二洗的结论上清，小心，不要去打扰immunopellet，使用一个卷曲的P - 200吸管尖。

4。重组的GR•HSP90 heterocomplex使用分子伴侣，辅助因子，与ATP

1. 技术说明：无​​数的实验条件，可以测试到准备下面的重组混合物，包括额外的蛋白质，辅助因子，激活剂，或利益抑制剂。重组混合物的总体积应<120μL。
2. 每个盐剥离immunopellet准备在第3步，添加一个重建的混合物，含有50μL分子伴侣源和5μL一个ATP生成系统（10 mM的HEPES 50 mM的ATP，磷酸肌酸250毫米，20毫米醋酸镁100 U / ml的肌酸磷酸激酶，pH值7.4）。
   1. 重整反应，可能会增加补充重组混合物50μL港币缓冲液（10 mM的HEPES，氯化钾100毫米，5毫米二硫苏糖醇（DTT），pH值7.4）和ATP生成系统的一个额外的5μL。如果观察充足的重组和类固醇具有约束力，这一步可以省略。氯化钾增加HSP70的ATP酶活性及数码地面电视保护半胱氨酸含蛋白质^氧化 9 。
   2. 一个推荐的分子伴侣来源是市售的兔网织红细胞裂解物。个别分子伴侣从网织红细胞裂解液纯化或重组表达（如15微克HSP90，HSP70 15微克，0.6微克合，P23 6微克和0.125微克港元缓冲区hsp40），也可使用。
3. 在30℃水浴整整20分钟中孵育样品。弗里克管，以每1-2分钟，轻轻扰乱颗粒混合重组解决方案。
4. 1分钟，加入1毫升TEGM缓冲区，旋涡，在10,000和离心机× G。小心，不要去打扰颗粒去除上清液并丢弃。共有3个洗重复。在缔结最终使用的P - 200压接吸管尖洗，彻底清除所有上清。

5。重组蛋白复合物与配体结合活性分析

1. 在重组immunopellet中的蛋白质可以识别常规聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE），微流控电泳（如Bio - Rad公司的Experion），和免疫印迹（ 图 3 ）。技术说明：优秀的协议， ^描述 15 SDS - PAGE电泳和免疫^印迹 16目前，其他调查员的礼貌。
   1. 添加50μL的SDS - PAGE样品缓冲液含有β-巯基乙醇和涡。特定的样品缓冲液配方有所不同。被聘用的电泳系统的制造商建议的基础上，选择之一。
   2. 孵育5分钟，在沸水浴或100 ° C电子加热块。
   3. 在10,000 × g离心1分钟。 immunoadsorbing抗体，GR蛋白复合物遗传资源将脱离彼此释放到样品缓冲液上清中。
   4. 将上清转移至一个新的离心管，用吸管尖的P - 200压接尖。弃去沉淀。正准备用市售的SDS - PAGE或微流控电泳系统分析样品。完成两种技术following制造商的指示。
   5. Western blot分析以下的SDS - PAGE可为最终鉴定immunoadsorbed遗传和分子伴侣的GR复合重组孵化。使用对GR（BuGR2），HSP90（AC88）提出的单克隆抗体，HSP70（N27F3 4）和合作伴侣蛋白检测GR•HSP90蛋白复合物的主要成分。
2. •HSP90蛋白复合物，可以通过化验使用类固醇的结合^活性[3H] 类固醇（图 4）确定遗传资源的重组后，盐剥离的GR功能激活。对于该协议的其余部分，遵循必要的预防措施，安全处理氚的样品和废物。
   1. 重组后immunopellet，添加47.5μLHEM的缓冲区2微米和^2.5μL[3H]地塞米松（最后的类固醇浓度= 100纳米） 。
   2. 轻轻地混合沉淀小心，尽量减少流离失所的样品量的离心管的墙。
   3. 在冰上孵育过夜。它是没有必要的旋转或在此孵化混合样品管的。
   4. 添加1毫升TEGM缓冲液，轻轻混匀，在10,000和离心机× G为1分钟。弃上清，被铭记，它包含未绑定的^[3 H]类固醇。重复共3 TEGM缓冲液洗。
   5. 在缔结最终使用的P - 200压接吸管尖洗，彻底清除所有上清。颗粒包含的GR，HSP90和其他分子伴侣复合物的^GR，[H]类固醇受体特异性结合。非特异性结合，可以计算，包括1000倍的超额非氚在地塞米松孵育过夜混合物。作为替代阴性对照，反GR immunoadsorbing抗体可能会被替换在步骤2.2中添加非GR - immunoadsorbing（NI）的抗体。
   6. 挂起200μLTEGM缓冲区，并转移至10 ml闪烁瓶使用的P - 200吸管尖切洗immunopellets。
   7. 加入4.8毫升闪烁鸡尾酒瓶和涡。
   8. ^[3H]类固醇结合到重组后的GR金额•HSP90蛋白复合物，可以使用液体闪烁光谱法测定。

6。代表性的成果：

代表SDS - PAGE和免疫印迹数据列在图3。内源性的GR•HSP90 heterocomplex immunoadsorbed使用反GR抗体和合作与GR immunoadsorb考马斯染色（图3A）显示的个别蛋白质从细胞的细胞质。蛋白质在重组实验的任何步骤的immunopellet任何组件的身份确认，可经SDS - PAGE计算分子量和使用提出对感兴趣的蛋白质的单克隆抗体免疫印迹。

冲调的GR•HSP90 heterocomplexes是使用的Experion微流体电泳数据（图3C和3D）和免疫印迹分析（图3B）。确认的GR免疫吸附特异性与非免疫抗体（图3C，NI IgG抗体车道）取代immunoadsorbing抗体抗- GR。即使过量使用非免疫抗体免疫沉淀，没有遗传或分子伴侣（参见图3c，GR，HSP90，HSP70蛋白带目前所观察到的带缺乏反GR免疫吸附车道NI IgG的车道）。同样，它可能证实了HSP90的分离和其他伴侣蛋白，盐剥离的剥离和重组immunopellets克免疫印迹分析（图3B）。考马斯染色和免疫印迹immunoadsorbing抗体的重链（HC）的检测，它是为了确认平等的大小immunopellets在每个泳道显示。

immunoadsorbed的GR结合活性的类固醇可以检测所有的测试条件，和有代表性的类固醇数据绑定在图4。内源性的GR•HSP90 heterocomplexes immunoadsorbed，盐剥离，重组。使用这两种网织红细胞裂解物或纯化的蛋白，重组的GR结合活性的类固醇•HSP90 heterocomplex通常返回的内源性GR•HSP90结合活性水平的75-100％。电泳数据相似，可能是一个非免疫抗体（NI）的反GR抗体（一）地方，以服务为阴性对照，并作为衡量非特异性^[3H]类固醇具有约束力。

图1。GR•HSP90 heterocomplex大会和遗传资源类固醇结合裂开放模型。 hsp90/hsp70-based伴​​侣机械转换GR配体结合域从一个FOLDED的构象在类固醇结合裂是封闭的，而不是访问激素可以访问（杂环类固醇图标所示）一个开放的裂构象。伴侣机器预装在细胞和纯化HSP90，HSP70时，会自发形成，合溶液混合（反应1）。合包含34氨基酸tetratricopeptide重复（TPR）域（作为一个黑暗的新月所示），是后来在一个TPR域包含immunophilin蛋白heterocomplex成熟过程中所取代。机械打开类固醇结合的ATP和K ⁺依赖性裂，后合和最hsp70和hsp40最终离开复杂的（图标为虚线所示）。机械，HSP70与GR相互作用之前HSP90和HSP90的受体素数的和随后裂开放。实验中，类固醇具有约束力和GR裂开放增加，如果HSP90和HSP70同时存在。 heterocomplex是稳定的HSP90合作伴侣P23，保持在一个ATP约束构型HSP90的条目。一个超高分子量immunophilin（IMM）合退出后，可以绑定HSP90，形成最终heterocomplex的，因为它是从细胞恢复。改编自普拉特和Toft ^1。

图（2）本协议的步骤2-5的示意图。 GR是immunoadsorbed使用绑定的蛋白A琼脂糖凝胶颗粒的GR（FiGR）提出的一种单克隆抗体，对细胞的细胞质。 HSP90和其他伴侣蛋白存在于内源性的GR•HSP90 heterocomplex与GR合作immunoadsorbed，和GR是能够绑定到类固醇。 HSP90是脱离使用温和的盐处理盐剥离（STR），简称GR。类固醇具有约束力的盐剥离的GR裂闭合，使得它无法绑定到类固醇。中级GR•HSP90 heterocomplexes含有HSP70，hsp40，和跳，这是能够约束力的类固醇，可以重组，孵化与纯化蛋白质或网织红细胞裂解液（Retic裂解液）和辅助因子的盐剥离的GR（侦察）。类固醇的结合活性和immunopellet蛋白质含量每一步可以过夜^[H]的类固醇孵化和免疫印迹分别确定。

图3。immunoadsorbed复合物电泳的蛋白质分析。一，重组的遗传资源的SDS - PAGE•HSP90 heterocomplex影像使用传统的电泳系统electrotransfer和考马斯染色。此外GR，HSP90和HSP70，重链（HC）和轻链抗体（立法会）的可视化。分子量标记（kDa的表达）的迁移，是显示在左侧。 B，含有盐剥克（STR）和重组GR•HSP90 heterocomplex（侦察）immunopellets免疫印迹。 ，重组遗传资源的虚拟凝胶•HSP90 heterocomplex使用的Experion微流体电泳系统生成的。包括两个不同浓度的一个非免疫（NI IgG抗体），免疫（抗- GR）immunoadsorbing抗体。 NI的IgG为阴性对照。研发，电泳重组的GR•HSP90的Experion微流体电泳显示面板B.微流控电泳的优点，包括较小的样本量的要求第三线的样品获得的heterocomplex，降低液体处理和运行后清理，提高了量化，并大幅较短的样品运行。

图4。类固醇结合活性，免疫吸附内源性的GR（Enodg），盐剥离的GR（STR）immunopellets和重组的GR•HSP90 heterocomplex（侦察）。此外，immunoadsorbing单克隆抗- GR immunoadsorbing抗体（一）GR，每个条件的阴性对照样品，使用非免疫球蛋白（NI）的准备。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

上文所述的检测可以适应测试无数影响hsp90/hsp70-based伴​​侣机械伴侣行动以及GR类固醇具有约束力的条件。这是以前报道的^方法 4,8,9,17的修改，旨在充分利用电泳技术的最新进展，并接触到更广泛的研究界。可以添加额外的辅助因子或蛋白质的利益，在GR•HSP90 heterocomplex重组的混合物，在本议定书第4步中所述，以观察对类固醇的约束力，heterocomplex蛋白质相互作用，并共同因素的要求影?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
Sf9细胞	Invitrogen公司		杆状病毒表达的重组小鼠GR
L929细胞	ATCC	CRL - 2173	内源性鼠标GR细胞质准备（替代杆状病毒表达）
FiGR杂交瘤细胞细胞	ATCC	CRL - 2173	准备含有反GR单克隆抗体的腹水（替代纯化BuGR2抗体）
完整的迷你蛋白酶抑制剂，EDTA无	罗氏应用科学部	11836170001
蛋白A琼脂糖	Sigma - Aldrich公司	P3391
兔网织红细胞裂解液	绿色公顷（俄勒冈州，威斯康星州）		内源性hsp90/hsp70伴侣机械的丰富来源
肌酸磷酸激酶	Sigma - Aldrich公司	C3755	ATP再生系统
磷酸肌酸	Sigma - Aldrich公司	P7936	ATP再生系统
反GR鼠单克隆抗体（BuGR2）	皮尔斯/ Thermo Scientific的	MA1 - 510	用于遗传免疫吸附作为第一抗体免疫印迹
抗- HSP90鼠单克隆抗体（AC88）	恩佐生命科学	ADI公司的SPA - 830	作为主要抗体用于免疫印迹
抗HSP70鼠单克隆抗体（N27F3 4）	恩佐生命科学	ADI公司的SPA - 820	作为主要抗体用于免疫印迹
从小鼠血清IgG抗体	Sigma - Aldrich公司	038K7690	作为非免疫抗体用于免疫吸附阴性对照
抗鼠IgG -过氧化物酶的共轭	Sigma - Aldrich公司	A4416	作为第二抗体用于免疫印迹
的Experion微流体电泳系统	Bio - Rad公司	7007001	替代传统的SDS - PAGE
[1,2,4,6,7 - 3H]地塞米松	珀金埃尔默	NET1192001MC	按照安全防范措施