人类诱导多能干细胞的转染和Nucleofecting

摘要

尽管基因改造的最新进展，转染的人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）保持一个反复无常的过程。据我们所知，系统和有效的方法，转染人诱导多能干细胞（iPSCs）尚未见报道。在这里，我们描述了可靠的协议，有效地转染和nucleofect人类iPSCs。

摘要

转基因（GM）将继续是一个重要的工具，在研究干细胞生物学和提出潜在的临床应用人类胚胎干细胞（胚胎干细胞^）1。尽管仍有改进的在几个基因传递方法已被描述^2-9，转染仍然是一个反复无常的过程对人类胚胎干细胞，尚未据报道，在人类诱导多能干细胞（iPSCs）。在这段视频中，我们展示了我们的实验室常规转染和利用质粒增强型绿色荧光蛋白（EGFP）记者nucleofects人类iPSCs。人类iPS细胞无饲养层培养适应和维护，以消除可能的饲养细胞转染，并允许稳定的转基因IPSC的克隆，转染后的有效选择。对于核转染，人类iPSCs预先处理与ROCK抑制剂^11，胰蛋白酶消化成小的细胞团块，上馈线nucleofected和再接种在饲养细胞空调中，增强细胞恢复。 6小时后，可以得到转基因表达的人类iPSCs。抗生素的选择被施加后24小时和稳定的转基因品系1星期内出现。本协议的鲁棒性和重现性好，可用于人类iPSC的线，在不改变这些细胞的多能性。

研究方案

我们的协议，开始与人类iPSCs的方法，以适应无饲养层培养，GeneJuice（EMD）和人类iPSCs使用Amaxa公司nuclefector设备的核转染转染人类iPSCs的协议。

注：下列程序进行，在无菌层流罩。所有的媒体和解决方案是平衡至37℃或室温，然后再启动，除非另有规定。

1。馈线系统上建立人类iPSCs

人类iPSCs可以保持原来的饲养层细胞分裂，转移到Geltrex涂层的菜和维护馈线转染前两个通道。

1. 在4°C过夜解冻Geltrex要准备Geltrex涂料，冷DMEM的解冻Geltrex 1:50稀释。混合轻轻的解决方案。

注：Geltrex，类似基底膜是可溶形式的基底膜MATR九纯化Engelbreth - 霍尔姆群（EHS）从小鼠肿瘤细胞。或者，基底膜可以用作一种细胞外基质，建立人类无馈线IPSC的文化。

2. 覆盖培养孔与Geltrex溶液（1毫升，35毫米）的整个表面上。外套井Geltrex在37℃培养箱中培养1小时。
3. 要通过人类iPSCs，1毫升的accutase中，每孔置于37°C 1分钟，直到大部分细胞开始分离。

要通过人类iPSCs，1毫升的accutase中，每孔置于37°C 1分钟，直到大部分细胞开始分离。

4. 将添加10-15玻璃珠的细胞，轻轻地旋转板。加入2毫升的淘汰赛DMEM / F12，轻轻捣碎。细胞悬浮液转移到10毫升离心管中。
5. 附带细胞以800rpm的转速在室温下3分钟。
6. 吸液管从上清液，留下人类IPSC的颗粒完好无损。轻轻一抖管，分散细胞沉淀。
7. 从涂好删除Geltrex。
8. 轻轻重悬人类IPSC的颗粒在适当体积的STEMPRO。分发井间的进料器，取决于增殖率）。人类iPS细胞可以传代的分路比为1:2到1:6。
9. 小心地放入5％CO ₂培养箱中，涡流板仔细横跨孔中的细胞，以确保均匀分布。
10. 饲料，直到细胞的细胞每天都准备好再次被分裂（当细胞达到80％融合）。
11. 流路到新的Geltrex涂覆以及人类iPSCs（步骤1.3到1.9）中的分流比为1:2。小菌落形成上Geltrex转染前涂好且分布均匀。

2。 GeneJuice转染的人类iPSCs

细胞（6孔板上生长）应该是约40 -50％汇合的转染当天，以达到最佳的转染效率。这是没有必要改变的细胞培养基中，直到第二天。

1. 准备的100微升KO-DMEM/F12在无菌的1.5毫升微量离心管。加入27微升GeneJuice转染试剂。拌匀。在室温下孵育5分钟。
2. 加入4μg质粒DNA。管，在室温下孵育15分钟。质粒的选择是至关重要的最佳的转染效率。我们使用的质粒与CAG启动子^{5（pCAG-eGFP}的）驱动的增强型绿色荧光蛋白（eGFP）。 CAG启动子是一个强启动子的转录活性在人类iPSCs，并因此可以被用来驱动在这些细胞中的转基因表达。在我们的手中，线性化的质粒转染效率似乎并没有影响。
3. 加入GeneJuice-DNA混合物的细胞和旋流板。旋转板，在1200 rpm离心5分钟（'spinoculation'方法），以增加接触就做好了人类iPSCs转染混合物。
4. 培养细胞在37及度C过夜。
5. 监测转染效率的第二天。
6. 对于稳定转染，改变介质的第二天与新鲜STEMPRO。 24 - 48小时后，加入适当的抗生素选择。

3。核转染的人类iPSCs

馈线或Geltrex上生长的人类iPSCs可以使用核转染。然而，我们强烈建议replating，nucleofected人类iPSCs到小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），人包皮成纤维细胞（HFF）馈线，以确保高细胞活力和恢复。应使用至少2百万个细胞，以实现更高的后核转染的细胞的存活。

1. 准备饲养层细胞的条件培养基（CM）培育人类iPSC的Knockout血清的更换（KOSR）的媒体与饲养层细胞过夜。收集CM，每24小时。

注：任何用于制备饲养层（如BLK6，CF1和MF1）的小鼠品系是适合用于R在CM。

2. 核转染的当天，预治疗人类iPSCs用10μMROCK抑制剂至少为1小时。
3. 准备人类干细胞nucleofector溶液的82μl的在无菌的1.5毫升微量离心管中。加入18微升补充1。拌匀。溶液在37℃下孵育5分钟。
4. 预温暖的饲养细胞的条件培养基（CM）和0.25％胰蛋白酶/ EDTA至37℃。引擎盖下，prelabel 1无菌15毫升锥形管。
5. 小心地取出媒体从人类iPSC的文化被nucleofected。轻轻洗2毫升1X磷酸盐缓冲溶液（PBS）中，每孔细胞。吸取PBS。 0.25％胰蛋白酶，每孔加入1 ml。细胞在37℃下孵育3分钟。
6. 细胞用1000毫升移液管尖轻轻捣碎。洗井的底部，以确保所有人类iPSCs完全脱离。细胞悬浮液转移到标记的15毫升锥形管。

注：胰酶消化成单个C英语学习者应严格避免。细胞应该只被抛下小由约三胞胎细胞组成的细胞团块，。在随后的处理的细胞小的细胞团块（小区三元组），将解离成单细胞。

7. 加9毫升的MEF媒体灭活胰蛋白酶。附带细胞以800rpm，3分钟。小心吸出上清液，并留下细胞沉淀完好。
8. 重悬细胞预热100μl的人干细胞nucleofector的解决方案，从步骤3.3。
9. 将细胞转移到一个nucleofector的比色皿，用1毫升移液管尖端部。
10. 到试管中的细胞悬浮液中加入4μg质粒DNA。细胞和DNA混合，轻轻回荡。轻按两次比色皿的引擎盖上表面。
11. 将试管中到nucleofector持有人。方案B-016。 Nucleofect细胞按按钮X.

< >时，将显示的核转染过程是COMPLET的ED（通常只需要1-5秒）。使用其他核转染方案的（A-023，A-033和U-023），得到小于10％的从​​人类iPSCs的eGFP阳性细胞。

12. 从试管中使用所提供的巴斯德塑料吸管检索nucleofected细胞。恢复细胞，再悬浮到无菌的1.5毫升微量离心管中预热的CM和ROCK抑制剂。 10分钟，在37°C培养细胞，让细胞恢复。
13. 逐滴传递细胞的饲养层上使用1毫升的移液枪枪头。孵育细胞于37℃培养过夜。
14. 监测转染效率的第二天。为了获得稳定的转基因人类iPSCs克隆稳定表达的转基因，改变介质的第二天，CM和ROCK抑制剂。 24 - 48小时后，加入适当的抗生素选择。

4。代表性的成果：

讨论

我们的协议简单，可靠，重现性好技术引进转基因人类iPSCs没有显着的毒性作用和细胞死亡。人类iPSCs应成更小的细胞团块，（5-10个细胞）传代，并镀上Geltrex在高密度（1:2），以确保最佳的转染效率在众多的小菌落。对于人类IPSC的线更容易发生分化和细胞死亡，更高数量的人类iPSCs（最多至4×10 ^6个细胞），应使用一个单一的核转染实验。瞬时转染1天之内产生大量的转基因表达人类iPSCs。稳定转染的iPSC的克隆通常出现在7天，应该是在三个星期内随时可以拿起这些转基因的殖民地。这里所描述的CAG启动子的使用确保无处不在表达绿色荧光蛋白记者。在这样的改善，我们的协议可以被输入到其他应用程序，包括过度表达，Conditional归纳，推导系特异性记者，短发夹RNA，siRNA敲除，基因打靶技术和同源重组。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
0.25％胰蛋白酶与EDTA	Invitrogen公司	25200056
2 - 巯基乙醇	Invitrogen公司	21985-023
3毫米的玻璃珠	Fisher Scientific则	11-312A	玻璃珠应用盐酸（HCl）过夜，用氢氧化钠（NaOH）和蒸馏水冲洗掉，并在使用前用高压灭菌器灭菌。
Accutase细胞分离试剂	Invitrogen公司	A11105-01
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）	Invitrogen公司	PHG0263
DMEM（高糖）	龙沙	12-741 F
胎牛血清的	Invitrogen公司	16000044
Geltrex	Invitrogen公司	12760013	生长因子减少
GeneJuice转染试剂	EMD Biosciences公司	70967
Glutamax-I（100X）	Invitrogen公司	35050061	L-谷氨酰胺（Invitrogen公司，25030081）也可以被代替使用。
人类iPSC的KOSR媒体			500毫升人ES媒体由390毫升基因敲除的DMEM / F12，100毫升Knockout血清替代品，将5ml Glutamax-I（100X），5毫升的NEAA（100X），500微升，2 - 巯基乙醇（55毫米），用10 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子和补充。
淘汰赛DMEM/F12	Invitrogen公司	12660-012
Knockout血清替代品（KOSR）	Invitrogen公司	10828-028
小鼠胚胎成纤维细胞介质			MEF媒体包括90％FBS，1×NEAA Glutamax-I，1X和1X丙酮酸钠的DMEM（高糖）
非必需氨基酸，NEAA（100X）	Invitrogen公司	11140050
人类干的细胞nucleofector解决方案与补充	龙沙	VAPH-5012
磷酸盐缓冲液，不含Ca 2 +和Mg 2 +	Invitrogen公司	10010023
丙酮酸钠（100X）	Invitrogen公司	11360070
STEMPRO介质工具包	Invitrogen公司	A1000701	500毫升STEMPRO媒体组成的454毫升敲满分的DMEM / F12，10毫升STEMPRO无血清生长添加物（50X），5毫升Glutamax-I（100X），将5ml NEAA（100X），36毫升BSA（牛血清白蛋白，25％），909微升2 - 巯基乙醇（55MM用10 ng / ml的碱性成纤维细胞生长因子）和补充。