在使用单细胞RT - PCR技术的黑质神经元电压门控钾通道mRNA表达分析

摘要

electrophysiologically神经元是第一个特点。然后从所记录的神经元的胞浆吸气和遭受反转录- PCR分析，检测神经递质的合成酶，离子通道和受体的mRNA表达。

摘要

在哺乳动物中枢神经系统中，不同​​类型的神经元具有不同的分子和功能特点是混杂着对方，难以分开，也不易确定其形态。因此，它往往是很难在一个特定的神经元类型的基因表达分析。在这里，我们记录全细胞膜片钳记录技术，它结合了单细胞逆转录聚合酶链反应（SCRT - PCR）分析mRNA的表达在大量的黑质神经元的不同类型的程序。电生理技术最初是用来记录单个神经元的神经生理学和功能特性。然后吸气，单electrophysiologically特点的黑质神经元的胞浆SCRT - PCR分析，以获取神经递质的合成酶，受体，离子通道的mRNA的表达谱。这种方法特别有用时，不能用免疫组织化学由于缺乏合适的抗体或蛋白质表达水平低的高选择性和灵敏度。这种方法也适用于其他脑区的神经元。

研究方案

1。脑片制备

1. 青年（15-40天）用于男性和女性的Sprague - Dawley大鼠。 （我们也可以使用这个相同的协议在小鼠。）深乌拉坦麻醉下，动物断头处死，迅速解剖大脑。接着是300微米厚的冠状脑切片中含有的黑质midrostral部分削减徕卡vibratome（VT - 1200S）。片切割过程是在一个冰冷的，含氧高切削液中含有（毫米）蔗糖：220蔗糖，2.5氯化钾，1.25的NaH ₂ PO ₄ 25 ₂ 0.5碳酸氢钠_3，氯化钙，7 MgCl _2的 10个D -葡萄糖。它是一个混合的95％Ø ₂ / 5％的CO _2，保持溶氧，并保持pH值在7.4冒泡。保持切削液冰冷的整个过程。
2. 脑片培养在充满含氧人工脑脊液（ACSF）含（毫米）的孵化室：125氯化钠，2.5氯化钾，1.25的NaH ₂ PO _4，25碳酸氢钠_{3，2.5，1.3氯化钙}氯化镁_2，10 D -葡萄糖。它是一个混合的95％Ø ₂ / 5％的CO _2，保持溶氧，并保持pH值在7.4冒泡。孵化温度为34℃，45分钟，然后在室温下，直到大脑切片被转移到录音室。

2。黑质神经元的电生理指纹图谱

1. 一个大脑切片被转移到一个膜片钳录音室连续灌注含氧学联在32 ° C。
2. 补丁移液器拉蒸压硼硅（KG - 33）玻璃毛细管（1.10 mm内径，外径1.65毫米，高精密玻璃国王，克莱蒙特，加州），使用的是PC - 10拉马（Narishige，日本东京）和细胞内的解决方案填充准备与DNase的无RNase的水（尔科技）（含​​135毫米氯化钾，EGTA 0.5毫米，10毫米HEPES，1.5毫米_氯化镁 2，调整pH至7.3） 。补丁移液器在洗澡2-3MΩ的电阻。
3. 黑质是根据其独特的解剖位置（ 图1A1 - 2）确定。配有Nomarski光学和60X水浸泡的镜头，大黑质平坦致密（SNC）和黑质细胞的视频显微镜（奥林巴斯BX51W1）的视觉引导下收杆马丁（SNR）（可能的DA能神经元和GABA神经元）选定进行录制。传统的千兆欧姆密封全细胞配置（图 1B1） 。电流钳和电压钳分析可以执行。为了尽量减少mRNA降解，电生理记录应当简短（≤5分钟）。一种选择是只记录膜和扣球属性为利益的神经元（ 图B2 - 3）电指纹。这个简短的录音时间只有约1分钟。

3。细胞质的愿望

1. SNR GABA和DA能神经元的电生理指纹和表征后，应用轻柔的口吸吸细胞质。细胞核内也可能会被吸入，造成基因组DNA的污染。密封不应该被打破;否则外碎片，包括mRNA可能补丁吸管吸进污染的单元格的内容。密封的完整性是良好的，只要保持电流在-70 mV的增加不超过100 pA的。
2. 然后吸气单元格的内容被驱逐到0.2 mL PCR管中打破吸头和一个小的正压力。收集到一个单元格的内容是一个PCR管。接受该单元格的内容后，收集的PCR管，在冰上预冷，立即置于-20 ° C冰箱中。
3. 为了排除污染外碎片，其中可能包含的mRNA，补丁吸管降低到组织实际上没有吸胞浆，然后吸管内容是受到RT - PCR检测。

4。反转录（RT）

1. 收集的合理数量的神经元，通常10-20的单元格的内容后，RT，应当立即开始减少的mRNA的降解。
2. 由于从一个单一的神经元细胞的含量的数量太小，RNA分离过程中不被执行。要删除的潜在污染的基因组DNA，DNA酶我（5μL的DNA酶I和5时25分1.6μLDNA酶我缓冲区° C）吸气单元格的内容是先消化。然后我脱氧核糖核酸酶加入1.2μL，25毫米EDTA和孵化在75 ° C 5分钟灭活。
3. cDNA的合成使用标三反向酶为基础的细胞直接cDNA合成试剂盒（Invitrogen公司， 表1）。第一链cDNA合成在50 ° C为50分钟，然后反应是灭活在85 ° C为5分钟和1μL，核糖核酸酶H添加孵育到消化的mRNA（37℃20分钟）。单链cDNA储存于-20 ° C以后的PCR扩增。
4. 完成去除基因组DNA的逆转录被忽略，而所有其他反应成分完全相同的RT减去控制验证。

5。两阶段的PCR扩增

1. 设计引物，根据GenBank中的序列。只要有可能，跨越内含子的引物对用于帮助检测基因组DNA的污染。对引物序列列于表2。对引物的有效性，应首先验证了整个大脑的mRNA产生积极的产品。所有引物合成DNA技术综合（Coralville，美国爱荷华州）。
2. 在第一阶段，30μL的cDNA 5μL，35个循环扩增引物（ 表2）的存在。热循环热循环的协议（的Mastercycler，Eppendorf公司， 表1），在94 ° C为初始变性，然后15秒35的周期在94 ° C至变性，55章第30 ° C至退火2分钟， 45秒72 ° C至延长，其次是最后一次延长为7分钟。Taq DNA聚合酶，脱氧核苷三磷酸（dNTPs），PCR扩增所需的所有其他组件提供PCR的超级组合（Invitrogen公司，表 1）
3. 在第二阶段PCR，1μL从^第一阶段的PCR扩增产物为模板，并在第一阶段使用的是相同的引物（ 见表 2 ）。运行40个循环延伸时间缩短至30秒同一PCR超级混合使用。
4. 从^第二阶段扩增的PCR产物2.5％琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭（0.05毫克毫升凝胶）或gelgreen紫外光下可视化，并拍照（图 B4） 。阳性条带，然后切出，提取使用一个Qiagen公司提取试剂盒（ 见表1），测序，并与靶基因的序列比较。

6。代表性的成果：

多巴胺（DA）神经元的黑质致密部和收杆马丁和邻近的黑质投射神经元的GABA收杆马丁有不同的电生理特征（Zhou等人，2006年; 2011年丁等）。。 如图所示。 1B2，SNR GABA的神经元表现出约10赫兹的高频自发扣球。尖峰有一个基地的持续时间约1毫秒。 SNR GABA的神经元后超极化电流注入，显示响应极化电流注入弱极化凹陷， _说明我目前在这些神经元（图 1B2）弱表达。相比之下，黑质DA能神经元具有低频率（约2赫兹），有一个基地的持续时间约3毫秒的自发尖峰。 DA能神经元也显示响应极化电流注入一个明显的凹陷，表示强烈的_表达我目前（图 1B3）（Zhou等，2006年。丁等2011 ）。

SCRT - PCR检测谷氨酸脱羧酶1（GAD1，GABA的合成和GABA的神经元标记的关键酶）基因electrophysiologically确定SNR GABA的神经元，但不是在DA能神经元（图1B4，5） 。相比之下，SCRT - PCR检测酪氨酸羟化酶基因（TH DA能神经元，多巴胺的合成和标记的关键酶）electrophysiologically确定SNC和SNR DA能神经元，但没有GABA的神经元，5）（图1B4。所以SCRT - PCR结果证实电生理神经元的鉴定。接下来，SCRT - PCR用于配置文件中的电压激活Kv3通道亚基，Kv3.1，Kv3.2，Kv3.3和Kv3.4的表达。这些亚基有助于形成电压门控K ⁺渠道的多样化属性取决于亚基组成（丁2011年）等。。在这个例子中SNR GABA的神经元如图所示 。 1B4，Kv3.1，Kv3.2，Kv3.3和Kv3.4的mRNA进行检测。在这个例子中的SNR DA神经元在 Fig.1B5所示，只有Kv3.2，Kv3.3和Kv3.4进行检测。 Kv3.1在我们的汇总数据，更频繁地检测SNR GABA的神经元比在黑质DA能神经元，表明较高的Kv3.1的表达水平在快速扣球SNR GABA的神经元（丁2011年）等。

图1。 SNR GABA的神经元和黑质DA神经元的电生理识别答 ：黑质的地区可以通过其独特的解剖位置确定 A1显示SNC和信噪比在日冕的尼氏染色与1X目标捕获部分的位置。盒装地区被捕获ED为10倍的目标，并显示在中间的箭头表示。细胞丰富的SNC和细胞SNR较差都清晰可见。A2显 ​​示SNC和SNR在现场，未染色冠状4倍的目标捕获部分的位置。细胞丰富的SNC和细胞SNR较差也清晰可辨。 VTA，腹侧被盖区，B1显示SNR GABA的神经元在全细胞模式正在修补夹住，B2显示了典型的电生理特性的信噪比神经元GABA电流钳记录模式。这些神经元火自发的高频率持续时间短的动作电位和弱_我H -介导的超极化电流注入的凹陷响应。B3显示在电流钳记录模式下的黑质DA神经元的典型的电生理特性。他们火自发的低频率的动作电位，持续时间长，有一个_突出的I H -介导的凹陷（箭头）响应极化电流注入。因此，SNR GABA的神经元和黑质多巴胺神经元是明确确定electrophysiologically B4显示了从一个电确定SNR GABA的神经元SCRT - PCR产物的凝胶图片。谷氨酸脱羧酶（GAD1）的mRNA，但没有酪氨酸羟化酶（TH）mRNA的检测。 Kv3.1，Kv3.2，Kv3.3和Kv3.4的mRNA的检测在这个SNR GABA的神经元。B5显示Kv3在SNR DA神经元的神经通道的mRNA SCRT - PCR检测。 TH mRNA表达，但没有GAD1 mRNA的检测在一个electrophysiologically确定的SNR DA神经元。在这个SNR DA神经元。B6的显示汇总数据，Kv3.2，Kv3.3和Kv3.4的mRNA进行检测。

7。潜在的假阴性和假阳性结果

根据我们的经验，有几个因素可能会导致假阴性SCRT - PCR结果。这些因素包括在吸足够量的细胞质中，由于修补枪头堵塞，RNase的污染，和低效的PCR引物的失败。补丁枪头堵塞通常可以看到在视频监视器上，以增加获得性表示。 RNase的污染，可避免彻底的失活和戴手套。 PCR引物的有效性应进行测试使用一拳从脑组织中的总RNA（Zhou等2008;。Ding等人2011年）。

由于我们始终使用DNA酶RT我们的样本中第一次治疗前，我们没有遇到假阳性结果。理论上，无DNA酶消化，基因组DNA的污染，因此假阳性检测时可能出现的基因是intronless或引物对不跨内含子区域。

讨论

修补脑片钳记录SCRT - PCR技术相结合，我们这里展示提供了一个极好的方法来研究离子通道，受体和个别特征的神经元的神经递质合成的关键酶的mRNA表达谱。这是特别有用的，当问题中的蛋白质不能被检测和本地化使用其他方法，如免疫组化由于表达水平低和/或缺乏合适的抗体（Surmeier等，1996;。Zhou等2009）。 SCRT - PCR的高灵敏度和选择性，允许检测低丰度的mRNA（Surmeier等，1996年）。此外，这个方?...

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