鼠标使用新型脊髓损伤的后肢骨质流失的纵向评价，在体内，方法论

摘要

在成年小鼠股骨和胫骨的纵向检查的骨质流失，脊髓损伤后使用连续低剂量X射线扫描。整个研究过程中胫骨损耗检测，直到检测到伤后40天，而在股骨的骨损失。

摘要

脊髓损伤（SCI）是由骨质疏松症常伴有骨盆和下肢sublesional地区，导致更高的频率的骨折^1。由于这些骨折常发生在已经失去了正常的感觉功能的地区，患者的骨折依赖病症的风险更大，包括死亡。 SCI依赖的损失都骨密度（BMD，克/ ^厘米 2）和骨矿含量（BMC，克）已被归因于废用^机械 2，异常神经^信号 3，荷尔蒙的^变化 4 。脊髓损伤引起的骨质疏松症的啮齿类动物模型的使用可以提供宝贵以下脊髓损伤有关骨质疏松症的发展的内在机制，以及为^新疗法^的 5-7（8审查）代的测试环境。 SCI小鼠模型的极大兴趣，因为他们允许还原机制BA通过使用空和转基因小鼠的SED评估。虽然这种模式提供了重要数据，仍然是需要微创，可靠，重现性好，可量化的方法，在确定以下脊髓损伤的骨质流失的程度，特别是随着时间的推移，在相同的实验动物队列，提高诊断，治疗方法，和/或脊髓损伤引起的骨质疏松症的预防的。

在啮齿类动物的骨骼密度测量的理想方法，将允许多个连续（​​随着时间的推移）的风险，以低层次的X射线辐射。这项研究描述了一个新的整体动物IVIS Lumina的XR（卡尺仪器），可用于提供低能量（1-3 milligray（MGY））高清晰度，高倍率的X射线图像扫描仪，使用随着时间的推移以下脊髓损伤的小鼠后肢骨骼。看到明显的骨质密度的损失后脊髓横断10天没有受伤，年龄匹配的对照相比，在小鼠的胫骨（天真）小鼠（下降了13％，P <0.0005）。在股骨远端骨质密度的损失 - SCI后第10天检测，而直到伤后40天（下降7％，P <0.05）检测的密度在股骨近端的损失。 SCI依赖小鼠股骨密度的损失验尸报告证实，通过使用双能X射线骨密度仪（DXA），目前的“金标准”的骨质密度测量。在40天使用IVIS Lumina的XR - SCI公司后我们发现在小鼠股骨的BMC 12％的损失。这绝不逊色于以前报告的BMC的损失为13.5％，皮卡尔和他的同事用鼠标股骨验尸报告后30天- ^SCI 9 DXA测量分析。我们的研究结果表明，IVIS Lumina的XR提供了一种新颖，high-resolution/high-magnification鼠标在执行长期的纵向测量，后肢骨密度以下脊髓损伤的方法。

研究方案

1。小鼠脊髓横断模型

1. 成人，男，C57BL6小鼠（约20-25克）麻醉用氯胺酮（200毫克/千克）和甲苯噻嗪的组合（10毫克/公斤）。无菌条件下，所有的外科手术是在体制，IACUC批准的手术套房。
2. 一旦深深麻醉，背部的皮毛修剪使用电动快船。剃光回是第一次与70％的乙醇碘溶液擦洗。
3. 初始切口之前，首先是阴刻回领域渗透的浓度（0.25％，<1ml/kg），以尽量减少手术后的疼痛与局部麻醉（Marcaine）。
4. 使用小剪刀，一个小的开放是在皮肤上，在各地的二级地区。这是扩大开放与同一组的剪刀，纵向延伸的T2区。除了通过使用猛犬夹具的皮肤边缘，然后举行。
5. 然后用微型剪刀明确从8胸椎水平（T8）脊髓背椎板肌肉组织。 T8可以识别，丹山和Wrathall（1998年^）10描述。简言之，T13可以识别背棘突。使用一对＃5杜蒙钳，可以触摸/最后一根肋骨，识别和计算到T8。一旦清除，骨Rongeurs用于执行T8背椎板切除。
6. 全脊髓横断病变：一旦脊髓是暴露在T8，另外一组是用来消毒微型剪刀切断手术显微镜下，在垂直的平面的脊髓长轴的线。我们使用＃5杜蒙钳轻轻地解除对脊髓的一极，以确定病变的完整性。
7. 脊髓横断，无菌明胶海绵小块，浸泡在无菌生理盐水（0.9％）是经过精心放置到病灶腔，以促进止血。
8. 额外的明胶海绵一块，然后放置在暴露自旋人线。皮肤，然后用无菌，不锈钢手术订书钉封闭。科目，然后返回自己的家乡笼，放在纸巾上，以防止床上用品材料的愿望，并用了一段时间约12小时的加热垫回暖。主题也提供了水凝胶包（ClearH2O）和笼子里的地板上的食物颗粒在早期恢复。受伤科目能够获得食物/在自己的笼子里的水一旦从麻醉中恢复。
9. 所有受伤的受试者接受每日两次人工膀胱后送（约12小时的间隔），使用期限（40天）的研究Crede手动方法修改。
10. 损伤小鼠还提供了3天（0.5毫升），每天两次腹腔注射0.9％生理盐水，以帮助维持水化，每日两次注射阿片类药物丁丙诺啡（0.05毫克/千克）控制手术后的疼痛，会期5天。如果动物表现出的迹象Øf痛后的最初5天期间，他们将收到额外丁丙诺啡（0.05毫克/千克）每天直到疼痛的迹象（行动不便，驼背的身材，没有新郎，发声时处理）已经解决了。

2。纵向评估骨质密度使用IVIS Lumina的XR spinally横断小鼠相同队列

1. 开始后第10天 - SCI，持续10天至40天，我们评估了生活的权利和左股骨和胫骨，麻醉学科（横断科学和未受伤的年龄匹配的对照）。
2. 在一天的扫描，受试者从该机构的Vivarium面积的安置房，其中卡尺的IVIS Lumina的XR是在自己的笼子转移。使用相同的氯胺酮/甲苯​​噻嗪鸡尾酒以前在SCI的交付使用，所有受试者麻醉。这种鸡尾酒为1到1.5小时内保证麻醉状态;足够的scann持续时间ING程序。
3. 调查初始化的卢米纳XR设备，并允许内部的摄像头达到工作温度（-90℃）（〜10分钟）。
4. 主体（切断或控制）麻醉后，轻轻地放在内卢米纳XR动物平台。高倍率镜头插入设备，允许在股骨和胫骨地区（实地查看2.4X2.4cm高倍率镜头）的重点。如果这个问题不正确定位的视野之外，门被打开的主题，直到左或右后肢为中心的重新定位（参见图2A为妥善安置后肢）。
5. 一旦适当的位置，X射线的功能可以被执行。选择的能源下拉列表中选择合适的动物 （生活的主题，35千伏为100uA，过滤X -射线）
6. 一旦动物是在合适的位置，使检查标记X射线在X射线的特征控制面板。 获得的X射线图像。确保整个股骨和胫骨都可见（见图2b）。原始图像数据自动保存到硬盘驱动器。代表。TIFF文件也被保存。鼠标，然后返回到其家乡笼和允许下恢复研究者观察。然后重复这个过程与未来的鼠标。
   注：生活图像软件默认显示转化的X射线图像。为了显示原始的X射线图像，删除复选标记旁边的X射线吸收更正/过滤工具。当X射线数据已被吸收纠正，你可以通过比较信号强度测量的ROI评估相对的骨质密度。投资回报率强度的增加与组织密度增加。

3。 IVIS X射线扫描图像分析

1. 对生活的图像图标双击打开该软件。
2. 通过点击加载X射线图像“浏览”按钮。在出现的对话框中，选择感兴趣的的文件夹，然后单击确定。生活的图像浏览器显示选定的数据与用户的ID，标签信息，和摄像头的配置信息。打开数据，下列操作之一：双击数据行，右键单击数据名称并选择快捷菜单上的负荷 ，选择数据行，并单击“ 加载 ”，或双击缩略图。显示图像和工具调色板。以绿色突出显示在浏览器中打开数据。
3. 点击工具面板上的投资回报率工具 。在投资回报率的工具，从类型下拉列表中选择测量投资回报率。负载3的投资回报率的在本次实验中使用，请按一下广场的图标并加载3平方。
4. 用一把尺子，测量股骨的长度。调整长度的平方两个全股骨长度的1 / ⁸次。调整这两个广场的宽度要1/24th全股骨长度。你的统治者，测量1 / ⁸从股骨近端的距离，并位于广场，所以它是股骨内为本。位于第二方阵，以便它是从远端股骨（图3）的总股骨长度1/4th。这些投资回报率可以用来衡量近端和股骨远端地区。
5. 使用标尺，测量胫骨的长度。调整的第三个正方形的长度，胫骨总长度^的 1 / 8次。调整宽度，胫骨总长度的1 ^/ 30日。位于广场中心和胫骨的距离胫骨近端（见图3）的总长度1 ^/ 8
6. 点击“ 测量 ”图标（铅笔和直尺）。出现的投资回报率强度测量的X射线图像中出现的投资回报率的测量表。 导出此表to你所需的位置。csv文件。这将允许您使用Excel打开表。
7. 重复这与所有你保存的图像。
8. 整合到一个Excel工作表中的所有数据。确定通过使用Microsoft Excel或SigmaPlot 11.0软件（SYSTAT软件）学生的t检验统计学意义。

4。验尸骨密度分析：

1. 继收购最终纵X射线扫描内IVIS Lumina的XR，小鼠，随后深深Beuthanasia（戊巴比妥75毫克/公斤）麻醉。一旦已经达到深麻醉，小鼠transcardially灌注冰冷的磷酸盐缓冲生理盐水heparain（40毫克/升），以抽血。
2. 一旦exsanguinated，消费都股骨。要特别小心删除尽可能多的软组织，这已被证明影响密度测量^11。包装水浸湿纱布和存储的股骨- 20C，直到您准备对它们进行分析。

5。使用一个Hologic公司QDR 4000骨密度DXA测量分析

1. 解冻纱布浸泡股骨骨密度套件和转让。
2. 校准设备制造商的协议，确保在可接受的限度内，BMC和BMD值下降。
3. 放置在机器的黄铜准直。这允许用户限制X射线束的大小和角度，把重点放在一个特定的目标。
4. 淹没到充满水（左髁，与股骨平行的床），位置只是激光的权利培养皿中解冻股骨。
5. 输入你要扫描的股骨的简历（一个描述性标题，其中包括动物识别信息，治疗等） 。
6. 输入扫描选择菜单，然后选择regionA高清晰度 。说明你的扫描参数：扫描地区2 × 0.7489英寸，0.01英寸的行距和0.00499英寸的点分辨率。
   注：监控扫描，同时它是正在进行中。由于X射线束光栅扫描采样，监测，以确保有足够的水，在会议厅内，完全覆盖骨样品。
7. 分析选择菜单下输入分析 。按照提示突出的投资回报率作为整个股骨。报表页面会拿出计算的BMC（克）和BMD（GMS / ^厘米 2） 。
8. 重复这些步骤，分析余下的股骨。
9. 整合到一个Excel工作表中的所有数据，并进行统计分析（t检验）。

6。代表性的成果：

相对鼠标脊髓损伤后的胫骨和股骨骨密度的损失时，天真的小鼠相比采用上述方法检测。有后可检测骨质密度显著下降短短10天（12％，P <0.0005），高达15％的骨骼密度在40天的损失（P <0.0005，图4）。观察伤后40天（下降7％，P <0.05，图5）在股骨骨密度损失。这些结果提供了证据使用的非侵入性的X射线成像的脊髓损伤后的骨质密度变化的纵向观察。

为了比较什么是当前可用的方法的疗效，我们分析这些小鼠切除股骨使用DXA的成像损伤后40天。图6可以看出，在数据输出的代表性。我们发现，有一个在SCI小鼠骨矿物质含量的显著损失相比，天真的（减少12％，P <0.05，图7）。骨密度没有显著变化，但也遵循了类似的趋势（图8）。这些结果与文献中发现的;皮卡德等观察减少了13.5％，在BMC（P <0.001），但没有显著DECR缓解骨密度（2008皮卡德）。

图1实验时间轴。

图2左后肢代表方向：一）照片和B），X射线。

图3。近端股骨和胫骨的地区内的投资回报率的尺寸和方向。

图4。脊髓损伤后的骨质密度在胫骨近端10，20，30和伤后40天的损失（N = 5）相比，年龄匹配naives（N = 5 ）。误差棒代表教育统筹局局长; ** P <0.005，*** P <0.0005。

图5。脊髓损伤后骨的密度在股骨近端的损失（N = 5）相比，年龄相匹配的naives（N = 5 ）。误差棒代表教育统筹局局长; * P <0.05。

图6。脊髓损伤后骨的密度在伤后10，20，30和40天的股骨远端损失（N = 5）相比，年龄匹配天真对照组（n = 5 ）。误差棒代表教育统筹局局长; * P <0.01-0.05; ** P <0.001-0.01; *** P <0.0001-0.001; **** P <0.0001。

图7。DXA数据显示BMC和BMD输出的形象代表。

图8。DXA测量分析在脊髓损伤小鼠股骨的骨矿含量（克）伤后40天（N = 5），与年龄相匹配的naives（N = 5） 。误差棒代表教育统筹局局长; * P <0.05。

图9在脊髓损伤小鼠股骨的骨密度DXA测量分析（毫克/厘米^2）伤后40天（N = 5），与年龄相匹配的naives（N = 5） 。误差棒代表教育统筹局局长;无显着性差异。

讨论

这项研究提出了一种新的非侵入性方法，评估范围内个人骨骼密度变化（胫骨和股骨）的纵向，在小鼠的单个队列，用卡尺IVIS Lumina的XR成像系统。 SCI的生产年龄相匹配的，没有受伤，对照组小鼠相比，超过40天的实验期间内spinally横断小鼠的单个队列研究时，在股骨和胫骨的骨质密度减少。股骨我们的研究结果证实，验尸，通过D​​XA的使用，表明卡钳仪器IVIS Lumina的XR的应用程序可以作为一个敏感的测量工具，用来评估SCI的长期和渐进的的影响骨质流失。

使用这个系统的调查的一个潜在好处是纵向遵循以下脊髓损伤的动物后肢骨骼病理变化发展的能力。一个单一的队列长的时间周期，以评估的能力提供了ST荣的优势，以研究者的条款：1）与动物购买和长期护理相关费用。取而代之的是研究需要大量的动物，需要在特定时间点牺牲，以评估时间依赖性变化，可以遵循这些病理结果在相同的队列超过同一时期，2）变异：除了受伤科目的单一队列内产生的结果比较与对照组群，可以评估和整个研究的程度相同的动物;再次降低内动物的变异以及需要较大的时间点之间比较，同伙的实验对象。

虽然Caliper的IVIS Lumina的XR我们提供关于脊髓损伤引起的骨质疏松症的发展具有重要的纵向信息，也有限制，应考虑：1），而这个平台，使我们能够生成高分辨率X射线DAT在以下脊髓损伤的小鼠后肢骨骼，其效用可能是有限的小型啮齿动物，如小鼠。内卢米纳XR允许的最大主体高度为2.8厘米。该高度以上的任何事情都不能成功使用的卢米纳XR组件X射线成像。在我们手中，这已经排除了我们的能力，研究老鼠在200-250克的重量。虽然它可能会根据这个重量范围或其他啮齿类动物如仓鼠或沙鼠的形象大鼠，这将需要额外的测试由PI。 2）联合的方向。这是至关重要的，调查人员精心安排，使成像会议的成功之间的比较轻松重现方向四肢。肢体位置的标准化将使研究者生成和应用标准化的投资回报率，可以保存和跨学科和时间应用。

整体而言，我们相信，IVIS Lumina的XR提供了一个极好的平台与模型在小鼠SCI依赖骨质疏松症的发展。骨质流失的纵向学习能力，在相同的鼠标队列将允许我们：1）更好地了解骨质流失和除盐的时间性质，脊髓损伤后，2）确定这些变化是否稳定随着时间的推移，3）探索，可用性转基因和空的鼠标线，学习能力，基本这些病理变化，在还原的方式，和4）的分子机制，很可能是最重要的优势，开始测试设计新颖的干预措施，以防止骨质疏松症在早期阶段的发展的伤害，或扭转这种变化一旦骨质疏松症已经开发。最后，Lumina的XR的，除了提供优良的X射线成像的潜力，也可以用来研究在动物活体发光和荧光信号。人们可以很容易地想象，结合本系统内提供的其他方式，来看待一个MULtitude因素决定骨动力学机制SCI或任何其他疾病的过程中，骨质疏松症的结果。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
Beuthanasia	巴特勒施恩​​动物 健康	001848
Ketathesia（氯胺酮 盐酸盐）	巴特勒施恩​​动物 健康	023061
甲苯噻嗪	巴特勒施恩​​动物 健康	037849
布比卡因	巴特勒施恩​​动物 健康	021801
明胶海绵; 7MM	Fisher Scientific则	NC0085178	为了促进 止血时 手术
IVIS Lumina的XR	卡尺生命科学	135400
ZFOV，2.5厘米领域 查看镜头	卡尺生命科学	127285	绝对必要的 到产生高 放大x光 图像骨 结构
QDR骨 密度仪	Hologic公司		模型采用不再 在生产