电场控制的二维和三维环境中的神经祖细胞定向迁移

摘要

此协议表明用于建立定制设计electrotactic的商会的二维和三维环境的方法，它可以追踪细胞在体内/体外

摘要

内源性电场（EFS） 在体内自然发生和组织/器官的发育和再生过程中发挥关键作用，包括中枢神经系统^1,2。这些内源性的EF所产生的细胞与细胞和组织的电阻相结合的离子运输调控。据报道，应用EF治疗可以促进脊髓损伤，动物和人类的^3,4功能修复。 EF导向细胞迁移，特别是已被证实在多种类型的细胞^5,6，包括神经祖细胞（筹备^）7,8。直流电（DC）EF的应用是不是在大多数实验室常用的技术。我们已经介绍了详细的协议，为直流EF的应用细胞和组织培养，以前^5,11。在这里，我们提出了一个标准方法的视频示范的基础上计算磁场强度成立2D 1ð3D环境，为筹备和调查外汇基金的刺激，在单细胞的生长条件，在2D，3D的器官在脊髓切片的细胞​​反应。在的脊髓cordslice是学习全国人大前体内的行为，移植后，因为在cytoarchitectonic的组织机构以及保存这些文化在^9,10理想收件人组织。此外，这种体外模型还允许程序在技术上并不可行追踪细胞在体内使用在单细胞水平上的时间推移录影。这是极为必要的评估不仅是一个二维的环境中的细胞行为，而且在一个三维器官的条件， 在体内环境mimicks。该系统将允许使用玻璃盖的菜肴，在组织或器官培养， 在体外和体内的单个细胞迁移的3D跟踪，可以移动到前在vi中的中间步骤的高分辨率成像VO典范。

研究方案

1。神经祖细胞的分离

1. E14-16小鼠在寒冷的DMEM/F12培养基进行剖析，从全脑。删除所有脑膜转移到35毫米的培养皿下解剖显微镜和大脑。
2. 用细镊子机械分解成组织碎片的大脑和他们转移到15 ml管，然后离心3分钟的样本，以消除碎片在800转。
3. 加入DMEM/F12培养液含有碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子和磨碎用1毫升吸管。
4. 通过一个细胞过滤细胞悬液，以获得单细胞悬液。
5. 板成瓶细胞在2-5×10 ⁴细胞/毫升，然后执行一个完整的介质改变，每3天，并通过细胞每6天。
6. 至少有5代后，神经球消化为单细胞用胰蛋白酶和EDTA和增长的poly-D-lysine/laminin-coated electrotactic商会（准备在2以下）。使用日益增长中等含氮补充，碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子在任何时候都保持的NPC的属性。

2。编写的electrotactic室

1. 准备灭菌22×22毫米一号一半的厚度盖玻片，用金刚石笔除以22×11毫米的玻璃条。
2. 创建良好的内部尺寸22×10毫米的独立玻璃胶合在一起四个垂直站立22×11毫米高真空硅脂条。允许井完全干燥变硬过夜。
3. 翌日，将两个22×11毫米的玻璃条，相互平行留下一个10毫米的差距，以100毫米文化使用硅脂菜基地。封锁这些带之间的区域，通过放置一个22×22毫米，在每年年底盖玻片，附有油脂三面环盘底部，但不是最接近中心。
4. 将玻璃盖2.2跨上准备滑倒，使内墙创建一个播种的密闭空间到板底部的细胞。防水硅脂所有关节。这个密闭的区域与聚-D-赖氨酸然后粘连顺序：大衣添加到室1毫升聚-D-赖氨酸和离开5分钟，让聚-D-赖氨酸绑定到该板块的底部，洗室用无菌PBS两次，然后在无菌PBS稀释产生20微克/毫升和使用覆盖板底部的粘连。在室温下在夜间离开。
5. 翌日，收获细胞，并准备1毫升含有1×104个细胞的悬浮。以及从玻璃粘连，使空气完全干燥，并更换1毫升细胞悬液。在37°C，至少4小时，以便附件放置在孵化盘。
6. 一旦细胞有足够的融合从室中取出所有介质。小心取出玻璃。细胞在屋顶形式，认真重视，硅脂，蒸压22 x 22毫米盖玻片两个22 x 11毫米带之间的桥接。涵盖中等几滴细胞，以避免干燥。
7. 在每个腔年底通过创建两个水密硅润滑脂的障碍，从一个盘子的边缘运行的其他在室的屋顶，形成一个独立的中型水库。新鲜培养基填充室，确保从一个中型水库，通过流动到其他。返回菜孵化器12个小时，使细胞恢复。

3。电场应用的electrotactic室的

1. 准备盖覆盖钻两个孔，定位在每个水库的移民室的菜。
2. 在含25毫米的HEPES缓冲介质与文化厅取代所有的介质和传输盘的温度控制的成像系统。成立时间推移和多方位记录实验参数。对齐，使阴极和阳极室上的左，右分别，EF的载体，以确保运行水平看显微镜和成像系统记录。
3. 填补斯坦伯格的解决方案（58毫米氯化钠，氯化钾0.67毫米，0.44毫米的Ca（NO _3）2 .4 H ₂ 0，1.3毫米硫酸镁₄ .7 H ₂ 0和4.6的毫米Trizma基地，pH值7.4）的两个烧杯。连接到每一个中型水库单独的烧杯中，用事先准备好的玻璃桥梁（玻璃管〜13厘米长，3毫米，直径在本生灯火焰加热弯曲成U形），充满了2％（W ​​/ V）Steinberg's琼脂解决方案，通过孔盖的。完成电路放置Ag / AgCl电极连接到直流电源到每个烧杯Steinberg的解决方案。
4. 设置在电源电压为0，打开拨号。电压而转向电压拨号，用电压表测量整个electrotactic室，并调整，以适应实验的要求。
5. 开始时间推移录音。执行中的变化和调整电压，根据需要，每隔一小时。新鲜培养基，药物或化学剂可能会增加水库的要求​​。当执行中的变化，两种选择，可以考虑如下：
   1. 选项​​1 - 暂停录制时间推移，暂时，小心取出从室的玻璃桥避免扰动盖盖，用消毒的巴斯德吸管轻轻地更换新鲜培养基介质和玻璃桥，然后继续录制。
   2. 选项​​2号 - 或者，自4孔（两个定位在每个水库迁移室），盖上盖子，也可用于使用中改变用途。两个玻璃桥连接，另外两个用于改变介质。选项​​2允许无干扰连续记录介质的变化。

4。器官型脊髓片的制备

1. 解剖lumbAR 2周龄C57BL / 6小鼠的脊髓。
2. 与McIlwain组织菜刀切成500微米厚的部分脊髓。
3. 单独的切片和解剖显微镜下选择片完整的矢状/轴向脊髓结构。
4. 板片为35毫米的Petri菜含有30μl的基底膜，并把它们尽可能接近中心，并保持在37℃至少30分钟，直到他们在5％CO ₂培养箱基底膜蛋白质自组装生产脊髓片表面的薄膜覆盖。这是非常重要的是要确保基底膜已组装完全，孵化另一个30分钟，如有必要，在37°C的培养皿。
5. 加入4-6毫升DMEM/F-12中含有25毫米的HEPES缓冲液和15-20％胎牛血清非常轻柔，避免到介质的流量直接切片。确保片不完全淹没在中期，离开外植体表面以及暴露在空气中。更改介质每周两次。

5。 Hoechst 33342荧光标记的NPC注入器官型脊髓片

1. 准备全国人大暂停1×10 ⁶细胞/μL。
2. 预孵育培养基中30分钟与5μMHoechst 33342荧光细胞悬液。
3. 用毛细玻璃管到脊髓切片microinject 2μL悬浮在显微镜下缓慢。确保毛细玻璃管穿过基底膜（显微镜下的粉红色部分），并达到脊髓切片（灰色显微镜下的组织）的内部，保持至少30秒内的脊髓切片，以避免细胞悬液辗过。放在培养皿中含有脊髓切片（37°C 5％的CO _2）进入孵化器，并留下过夜。
4. 第二天，适用于500毫伏/毫米EF脊髓切片含在electrotactic室赫斯特33342标记的NPC（使用中所述的方法3）。

6。代表结果

当筹备暴露了他们表现出高度定向对细胞迁移的阴极（图1）生理的EF范围。在单细胞水平上的器官型脊髓片体外模型，模仿（图2） 在体内条件下的三维环境也取得了同样的看法。

图1。筹备表明定向迁移的EFS。电脑显示对阴极当暴露在EFS的高度定向迁移，红线和蓝色箭头代表细胞的运动轨迹和方向（一）。 B显示的NPC的迁移路径。酒吧：50微米。

图2。移植的NPC显示在器官脊髓切片直接向阴极迁移 。 （一）用Hoechst 33342标记的NPC被移植器官的脊髓切片的EF治疗的起点。筹备定向迁移对阴极为2.5小时，而此时的EF极性颠倒（乙）。改变引发对新的阴极（三）外汇极性的电性急剧逆转。 （四）内移植在脊髓片的录制时间推移年底筹备中的形象。 （E）移植的NPC三维重建，脊髓内的切片。三维扫描部分厚度为300微米，从中间开始，并在片底部的结束。虚线表示开始逆转，EF的治疗终点（A类 - C），分别在移植细胞的相同人口的相对位置。箭头表明Hoechst 33342荧光标记的NPC相同的人口。酒吧：50微米。

讨论

^5,11以前的研究基础上，我们所使用的协议。使用这些方法，稳定的文化和电目前的条件，可同时申请通过琼脂桥梁，Steinberg的解决方案，Ag / AgCl电极，标准化和精确的尺寸定制设计electrotactic的商会，培养细胞或片的EF维护。钱伯斯的深度可以调整，以适应不同的样品厚度^11，在细胞的情况下，室的大小可以修改，以适应但是许多细胞（如Western blot分析需要很多的细胞）。我们已?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
基本的FGF-重组人	Invitrogen公司	PHG0026	20毫微克/毫升
表皮生长因子重组人	Invitrogen公司	PHG0311	20毫微克/毫升
N2 - 补充液体（100X）	Invitrogen公司	02048
DMEM/F12培养基（高糖）	Invitrogen公司	31330-095
聚-D-赖氨酸	Millipore公司	-003-E的
自然科学小鼠层粘连蛋白	Invitrogen公司	23017-015
生长因子减少基底膜基质（Matr​​igel的）	BD公司	354230
HEPES缓冲	Gibco公司	15630
McIlwain组织菜刀	小数怕长计实验室工程有限公司	TC752-PD
道康宁高真空硅脂	Sigma-Aldrich公司	Z273554