γHV68感染小鼠的测量

摘要

γ-疱疹病毒（γ- HVS）在其主机建立终身续保。感染小鼠γ- HV68提供了一种基因听话在体内模型为表征的生命周期/γHVs发病机制。这个协议描述γHV68感染的检测和定量菌斑形成，传染病中心，qPCR实验感染后的急性和潜伏阶段。

摘要

γ-疱疹病毒（γ- HVS）为显着的能力，建立潜伏感染的淋巴细胞^1。人类γ- HVS，如EBV和KSHV的宿主范围狭窄，严重阻碍了详细的致病性研究。小鼠γ-疱疹病毒68（γHV68）股广泛的遗传和生物与人类的γ- HVS， ^相似之处是2 murid啮齿动物的天然病原体。因此，γHV68感染小鼠近交系的评价，在病毒感染的不同阶段提供了一个认识过程中γ- HVS感染病毒的生命周期和发病机制的重要模式。

鼻内接种后，γHV68肺感染的急性血症结果，就是后来成隐性感染者脾细胞及其他细胞，这可能是整个生活的主机^3,4恢复解决。在这个协议中，我们将描述如何使用斑块的检测，以评估在传染性病毒滴度肺组织匀浆后滴鼻感染（DPI）在早期阶段（5 - 7天）在Vero细胞单层。虽然急性感染主要是清除2 - 3周，隐性感染的γHV68各地建立了14 DPI，以后维持在小鼠的脾。隐性感染者通常会影响在受感染的组织细胞的一个非常小的人口，据此病毒保持休眠状态，并关闭其大部分基因的表达。潜伏感染的脾细胞自发激活后病毒组织培养，可以通过扼要传染病中心（IC）检测，以确定病毒潜伏负荷explanting。要进一步病毒基因组副本的数量估计在急性和/或潜伏感染的组织，实时定量PCR（定量PCR）用于其最大的灵敏度和准确性。的qPCR和斑块的检测和/或IC检测的结果结合起来分析，就会发现病毒的时空分布在体内的复制和传染性。

研究方案

下面的协议，将描述研究的病毒滴度和病毒基因组的γHV68溶骨性和潜伏性感染周期，在小鼠中，理论上可以用于评估感染其他病毒，分享相​​似的生活方式γHV68负载。

1。扩增的γHV68

1. 在37℃水浴解冻γHV68冷冻小瓶。
2. 将病毒接种到NIH3T12或3T3细胞培养（〜50％汇合）在10厘米的菜肴和文化感染的细胞在37℃，5％的CO _2。
3. 检查显微镜细胞病变效应（CPE）的文化和媒体时大于80％的细胞显示4〜5天，感染后CPE收集一次。为了最大限度地提高产量病毒，受感染的细胞培养可冻结和解冻两次释放所有细胞相关γHV68。
4. 在1000转速在室温（RT）5分钟离心收集媒体以去除细胞碎片。
5. 仔细上清转移到新管（高速离心管），而不触及底部的细胞碎片。
6. 12,000 rpm的高速离心机（SA - 600 Sorvall）在4 ° C下至少1.5小时集中的病毒颗粒。
7. 到10γ漂白粉溶液倒掉上清，并仔细地重新悬浮颗粒（病毒和细胞碎片残留）用1ml无血清DMEM。转移到1.5 ml的微量离心管中的悬浮颗粒，拌匀由涡旋。
8. 离心机以最大速度为2分钟，以去除残留的细胞碎片和上清液（病毒存量）转移到一个新的管。这是病毒感染的最终股票。病毒的滴度是由斑块的检测（见下文）。

2。滴鼻感染小鼠γHV68

1. 感染〜6周龄的小鼠与1000〜5000γHV68每小鼠的菌斑形成单位（PFU）。
2. 麻醉小鼠腹腔注入氯胺酮/甲苯​​噻嗪（80毫克/毫升氯胺酮和12毫克/毫升甲苯噻嗪的混合物60μL/鼠标）。监测麻醉捏小鼠脚趾。它通常需要〜5-10分钟。如果老鼠是不充分麻醉的，他们会打喷嚏病毒。
3. 当鼠标完全麻醉，用吸管给小鼠接种〜30μLPBS中γHV68（15μL）在每个鼻孔下拉，缓慢但稳步下降。确保鼠标确实是吸入而试图形成气泡滴。
4. 让鼠标恢复为10-15分钟，监测，然后把他们送回笼的小鼠（如意识，呼吸等）的福利。动物疾病和充足的食物，水，和被褥条件，每天检查。如果疾病，疼痛或窘迫的临床体征的发展，将进行常规诊断，以确定病因。失去的体重超过20％的动物，将录得最大的减肥安乐死。最终决定执行安乐死是在临床兽医的自由裁量权，是与主要研究者协商后。

3。斑块含量，以确定在急性感染肺病毒滴度

1. Vero细胞单层斑块的形成是由病毒感染性滴度。
2. 斑块检测的前一天，在2.5 ^× 10 4细胞Vero细胞接种/ 12孔板。细胞应分布均匀，细胞密度应达到30 - 40％的斑块检测的一天。
3. 准备0.5％（W / V）甲基纤维素（MC）覆盖介质（见表1）。
4. 牺牲后5-7天γHV68感染小鼠滴鼻感染，以确定在肺部急性期病毒滴度。对于euthanization氯胺酮盐酸（80-100毫克/千克SC，IM IP）将给药的IM戊巴比妥钠（30-50毫克/千克的IP），静脉注射过量。这种方法是由T批准他在美国兽医医疗协会。
5. 收获的肺和1 × PBS冲洗两次，去除血细胞。收集1毫升冰冷的完整的DMEM培养基的一个侧面的肺部和保持在冰上。迅速冻结于-80 ° C，在肺部的qPCR（见下文）审查病毒DNA载量的肺部和存储的另一边。
6. 使用组织匀浆均质在肺组织的最高速度为1秒，冻结与解冻三次。洗净，在每一步改变样品时，用70％乙醇的匀浆。
7. 在10分钟3000转离心匀浆组织于4 ° C。收集上清，斑块检测转移到新的管。
8. 准备在1.5毫升微量离心管与普通的DMEM涡肺组织匀浆样品连续稀释（通常是从10 °到10 ^-8）。充液管的适当数量与540μLDMEM培养液稀释成60μL匀浆管头。传输我从第一管60μL没有下一个，依此类推。
9. 准备在12孔板VERO单层吸媒体和负载200μL/连续稀释匀浆含有传染性病毒，在相反的顺序（ ^从 10-8到10 °） 。每次滴定的两口井（一式两份）。
10. 孵育Vero细胞病毒接种1小时37 ° C。轻轻摇动板每15分钟均匀地分布在单层病毒。
11. 取出接种2毫升/覆盖介质（见表1）替换它。一个星期板在37 ° C。
12. 删除覆盖介质（不需要是完整的），更换与修复/斑块检测的染色介质（见表1）和至少1小时在室温下孵育。
13. 当干板，隔离斑块的数量在每个稀释度计数。为了尽量减少错误，只包含在10和100斑块之间的水井也计算在内。
14. 计算病毒滴度使用follo翼公式：滴度（PFU / ml的）= [（斑块数/孔）/（接种/以及体积）] ×稀释倍数。

4。传染病中心检测，以确定潜伏感染脾细胞中的病毒载量

1. 是由传染病中心（IC）检测单层Vero细胞病毒潜伏负载。 IC检测，种子Vero细胞在6孔板的前一天（1 - 2.5 × ¹⁰ 5细胞/孔，我们通常使用脾样本的11％口井，10口井将用于连续稀释的脾细胞悬浮和一个用于测试冻融循环后自发激活病毒。
2. 牺牲后延迟（感染后12 - 14天）感染小鼠。收获的小鼠脾和游泳池到1毫升冷冻的DMEM。
3. 机械分离小鼠脾。新鲜分离的小鼠脾脏转移到一个10厘米的钢板，并添加10毫升含2％FBS的DMEM培养基所需。湿两种磨砂高端玻璃显微OPE幻灯片用冰冷的介质。将脾上一张幻灯片和尼克胶囊与其他幻灯片的磨砂结束边缘磨砂。机械游离于两个幻灯片之间的脾粉碎，直到所有的红色团块（去除脂肪颗粒如果存在的话）。
4. 用DMEM冲洗的幻灯片，幻灯片上都恢复剩余的细胞。
5. 通过细胞过滤器（40微米尼龙网）传输整个组织悬液，轻轻放入50毫升的锥形螺丝帽筒。 10 cm培养皿，同时过滤含有10毫升PBS和转让脾匀浆洗净。
6. 375 XG离心机的单细胞悬液10分钟，弃上清。弗里克细胞沉淀，打破现有的细胞团块。加入5毫升的ACK缓冲液（见表1）裂解红细胞。孵育5分钟，再次离心375 X G.
7. 弃上清，重新暂停颗粒，彻​​底，还轻轻在PBS，含2％FBS。保持细胞在4 ° C。使用吸管清除杂物，如果有的话。使用自动细胞计数器（BIO - RAD）的计数活细胞。
8. 离心4分钟XG 375的PBS重悬脾。弃上清，重悬细胞，在4毫升完全DMEM（2 × 1毫升，将用于集成电路检测原悬挂;串行五倍稀释在IC检测用0.6毫升0.4毫升病毒DNA的制备和定量PCR， 1毫升悬液，将用于评估三个冻融循环后自发激活潜伏的病毒）
9. 准备串行的5倍稀释（即1 / 5，1 / 25，1 / 125，1 / 250）脾悬挂在重复。预填的15毫升2.4毫升的DMEM和第一管稀释成600μL脾悬挂拌匀锥形管。从以前的管传输到600μL，下管等，不要旋涡！
10. 从准备6井单层Vero细胞吸介质。种子1毫升到Vero细胞的连续稀释，每个稀释dupl脾icated（10口井将用于为0，1 / 5，1 / 25，1 / 125，1 / 250稀释）。
11. 板8-12小时在37 ° C和5％的CO _2。不要超过24小时。吸种子脾悬挂和加载4毫升覆盖媒体（见表1）每口井。孵育一个额外的6天。
12. 确定斑块检测显示，板块与0.2％（W ​​/ V）结晶紫染色脾​​传染病中心的水平。

5。病毒基因组的量化

1. 从γHV68感染的组织，如肺，脾样本，在这个实验中提取总DNA。使用DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen），按照制造商的协议。
2. 确定每个样本的DNA的浓度，以确保DNA的定量PCR检测正在使用的相同数额。设计病毒的特异性引物（〜200 bp的扩增是一个定量PCR检测的首选）。我们使用γHV68ORF56特异引物（正向引物：5＆PRIME; - GTAACTCGAGACTGAAACCTCGCAGAGGTCC - 3'，反向引物：5' - CCGAAGCTTGCACGGTGCAATGTGTCACAG - 3'），此法和β- actin引物（正向引物：5' - cacccacactgtggcccatcat - 3'反向引物：5' - gtgaggatcttcatgaggtagtc - 3'）控制的qPCR反应。
3. 混合DNA样本（100 - 500吴好）和适当的引物与2 × SYBR的master mix（Bio - Rad公司的iQ SYBR绿色Supermix）。使用Bio - Rad公司的实时PCR系统量化在受感染的组织的病毒载量。在下列条件下进行PCR：95℃15分钟和45周期95 ° C为30分钟，60 °彗星为30分钟，72 ° C下30分钟，其次是病毒和熔解曲线分析，肌动蛋白扩增产物。
4. 为了使病毒的基因组进行量化的标准曲线，一个γHV68与未受感染的细胞中分离出基因组DNA bacmid DNA连续稀释的已知金额。并行运行的qPCR的DNA与从感染检索TED组织使用同一组病毒特异性引物。
5. 目前病毒DNA每单位正常化后肌动蛋白的基因组DNA的拷贝数（例如100毫微克或500纳克）组织的病毒基因组负载。

6。代表性的成果：

图1描绘了γHV68感染小鼠体内的测量实验的总体方案。代表性的成果，在γHV68斑块检测确定，急性感染期间肺部的病毒滴度，如图2a所示。一个含有γHV68非功能性的突变株病毒BCL - 2（vBcl 2）在肺部复制水平与野生型γHV68后7天滴鼻感染BALB / c小鼠（6 - 7％组小鼠）。肺病毒滴度检测两组差异无统计学意义。这一数据表明，vBcl - 2不是γHV68急性感染的关键因素小鼠。然而，28天postinfection，脾脏vBcl - 2变异病毒滴度下降6 - 10 - 倍的WT，传染病中心检测（图2B）来衡量，这表明vBcl - 2突变体γHV68病毒在感染后脾延迟的维修是有缺陷的。在协议减少传染病中心滴度，vBcl - 2突变病毒的病毒基因组负载严重减少相比，野生型病毒，在反复实验第28天，如在图2C所示。潜HV68vBcl - 2突变体病毒再激活体内潜伏的感染阶段的病毒基因组的负载和频率之间的密切的关系，突出了这种突变病毒感染的潜伏期缺陷。

γHV68感染小鼠的斑块形成，传染病中心和定量PCR检测的测量示意图图 1。第

图2。溶解的和潜在的WT和突变γHV68 在体内的病毒感染。在7天感染后DPI（）的BALB / c小鼠的肺部急性WT和突变vBcl - 2γHV68病毒的复制（一）是由斑块检测。 （B和C）测定脾传染病中心（B）和病毒基因组的负载（三）在感染小鼠脾脏的28 dpi的传染病中心检测和定量PCR，分别。红线，指示值的平均值。 NS，不显着。

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讨论

γHV68已被广泛用于作为一种模式来理解人类γ- HVS ^2,4,5的发病机制。在这个协议中，我们描述了三个经常使用的方法，包括斑块传染性病毒滴度的检测，IC病毒潜伏负载检测，病毒基因组负载的qPCR，以评估后，在小鼠滴鼻接种γHV68急性和隐性感染者。

斑块的检测已广泛使用，以确定受感染的细胞或组织中的病毒滴度，但不同的病毒正在使用的最佳条件。这主要是因为?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
材料名称	制备工艺
甲基纤维素（MC）病毒斑块检测的覆盖介质	热〜250毫升的蒸馏水在TC瓶> 80 ° C（沸点为3分钟微波） 添加到热水逐步2.5克管委会粉，慢火搅拌直到溶解。 高压灭菌立即液体周期为15分钟。 搅拌4 ° C过夜的蒸压MC媒体。 结合200毫升2 250毫升MC媒体x MEM（GIBCO - BRL）+ 50毫升FBS的500毫升的覆盖媒体。
修复/染色中等斑块检测	0.2％（W ​​/ V）水晶紫在20％的乙醇。
ACK裂解液	NH 4 CL 0.15米，KHCO 3 10MM，EDTA 0.1MM
完全DMEM	贝科的修改鹰的中期（DMEM），辅以10％小牛血清（FBS的; Invitrogen公司），2毫米L -谷氨酰胺，1％青霉素，链霉素（GIBCO - BRL）。

试剂名称	公司	目录编号
氯胺酮	Sigma - Aldrich公司	K2753
甲苯噻嗪	Sigma - Aldrich公司	X1251
甲基	Sigma - Aldrich公司	M0512 - 250G
2 x纪念	Life Technologies公司	11935
细胞过滤器	屋宇署Faclon	352340
全方位组织匀浆	OMNI国际	TH115
DNeasy的血液和组织套件	洽根	69504
iQTM SYBRH绿色Supermix	BioRad公司	170-8882
CFX96实时PCR系统	Bio - Rad公司	184-5072
细胞计数	Bio - Rad公司	145-0001
Sorvall SA - 600	Thermo Scientific的	096-124022