在封装的细胞聚集跟踪缺氧信号

摘要

封装在一个交联的聚乙二醇水凝胶的细胞照片的方法描述。使用荧光标记系统内缺氧的信号封装小鼠胰岛素（MIN6）聚合跟踪。这个系统允许在水凝胶支架和相关的缺氧信号串行检查细胞与细胞表型的变化。

摘要

在1型糖尿病，胰腺β细胞中胰岛素的生产损失和潜在的致命性高血糖的结果的自身免疫性破坏。作为一种替代治疗选择外源性胰岛素注射，功能胰腺组织移植已^探索 1,2 。这种方法提供了更自然，恢复正常血糖长期承诺。从宿主的免疫系统是必需的捐助组织的保护，以防止排斥和封装是用来帮助实现这一目标的方法。

生物衍生材料，如海藻酸钠³和琼脂糖^4，已经胶囊建设传统的选择，但可能会引起炎症^或纤维化繁茂5可以阻碍养分和氧气的运输。另外，合成聚乙二醇（PEG）凝胶的非降解，易功能化，高纯度，可控孔径，是非常具有生物相容性^，6,7,8。作为一个额外的好处，PEG水凝胶可迅速形成一个简单的光交联反应，不需要申请非生理温度^6,7。这里描述的是这样一个过程。在交联反应，光引发剂的UV退化，1 - [4 - （2 - 羟乙氧基）苯基] -2 - 羟基-2 - 甲基丙烷- 1 -（Irgacure 2959），产生自由基攻击乙烯的碳 - 碳双dimethacrylated PEG（PEGDM）诱导交联的债券链的末端。在10分钟内就可以实现交联。以这种方式建造的聚乙二醇水凝胶已被证明有利的支持^细胞 7,9，和光引发剂浓度低，并简短地暴露在紫外线的照射是^不会损害10封装的组织的活力和功能。虽然我们甲基丙烯酸聚乙二醇与方法如下所述，PEGDM也可以DIRectly从Sigma公司，如供应商购买。

一个封装的固有后果是细胞从血管网的隔离。营养物质的供应，特别是氧气，因此，减少和限制扩散。这减少的氧气供应，尤其是可能影响β细胞的胰岛素分泌功能是高度依赖^氧气 11-13 。胶囊成分和几何也将影响对氧的扩散速度和长度。因此，我们还描述了确定乏氧细胞内的聚乙二醇胶囊的技术。与重组的腺病毒的细胞感染允许一个荧光信号产生时，细胞内缺氧诱导因子（HIF） ^途径激活14。由于HIFs转录缺氧反应的主要监管机构，他们所代表的理想目标标记检测缺氧信号^15。这种方法允许hypoxi简便，快速检测C细胞。简单地说，腺病毒有一个缺氧反应元件（HRE）三聚体的控制下，红色荧光蛋白的序列（DS红DR自​​Clontech）。低氧气条件下稳定HIF - 1，将驱动器的荧光蛋白（图1）的转录。对这种病毒的建设更多细节已公布^以前 15 。该病毒是存储在10％甘油于-80 ° C的很多150微升1.5 mL离心管分装在一个3.4 × ¹⁰ 10 PFU / mL的浓度。

在我们的实验室以往的研究表明，MIN6细胞封装为聚合整个文化周在20％的氧气维持其可行性。 MIN6聚集培养2或1％的氧气表明：用溴化乙锭染色，以及相对20％的氧气，细胞形态的变化，坏死细胞的两个标志（仍然可行的约85-90％）。顺利球形显示20％的聚集是洛杉矶T和聚合似乎更喜欢杂乱无章的细胞群体。虽然含氧量低应力不会导致在生存能力明显下降，这显然是影响MIN6聚集和功能为测量血糖刺激胰岛素分泌^15。封装的细胞在20％和1％的氧气西方印迹分析还显示，为DsRed的议员蛋白表达与低氧条件下培养的细胞中HIF -1α的显著增加。

研究方案

1。 PEGDM合成的光敏PEGDM单体溶液的配制

1. 一个用硬塑料盖40ML玻璃小瓶，称取PEG的2G（线性，万大）。
2. 加入约308μL甲基丙烯酸酐和松散的第小瓶。
3. 微波在一个标准的家用微波炉2分钟高小瓶。服装耐热手套，彻底涡旋小瓶，然后在​​高微波5分钟。
4. 简要允许小瓶不够冷静，要带手套处理。摘帽，并慢慢加入二氯甲烷，而纷飞的小瓶。加入足够的解决方案，使出现明确和同质化，需要震荡样品。亚甲基氯化物的总体积应为1.5 - 2毫升。
5. 在200毫升冷沉淀PEGDM，搅拌加入溶液滴加乙醚。
6. PEGDM真空过滤收集，并允许它干。
7. 溶解于适当数量的PEGDM去离子水（通常为100 -150毫升）。
8. 5天透析管透析千大分子量切断对去离子水的解决方案。每天更换一次水。
9. 分装到适当的容器内，并冻结在-80 ° C过夜的解决方案。冻干4天的解决方案，以产生一个纯净的白色PEGDM粉末。保存在4 ° C时不使用粉末。
10. 要准备一个光敏PEGDM解决方案，首先准备一个0.5重量％的光引发剂原液溶解在去离子水Irgacure 2959。涡的解决方案，并存储在黑暗中。
11. 准备了10％PEGDM和0.025％Irgacure 2959汉克的平衡盐溶液（HBSS）的解决方案。涡彻底，以确保PEGDM解散。我们通常准备时间的这一解决方案1ML。
12. 消毒注射器过滤器通过0.2微米到1.8 ml离心管过滤解决方案。包装在铝箔管并储存于4 ° C

2。文化，感染和MIN6细胞的聚合

1. MIN6细胞的RPMI 1640与10％FBS，7mm的葡萄糖，100个单位/ mL青霉素/链霉素，0.5微克/毫升amphotercin乙在湿润的环境在37 ° C和5％的CO ₂的培养基中培养。
2. 要释放从处理过的培养瓶表面的细胞，吸出培养基，冲洗细胞与37 ° C钙/镁免费的HBSS，吸的HBSS，再加入2毫升37 ° C胰蛋白酶- EDTA溶液，并允许细胞孵育3分钟。
3. 牢固JAR烧瓶的侧敲的细胞，然后加入8毫升37 ° C介质，大力移液器细胞悬液上下注意不要引入气泡。
4. 移液器无菌的15 mL离心管中的细胞，并使用血球或其他细胞计数过程进行细胞计数。
5. 在准备与制造商的感染细胞病毒，首先要确定被感染的细胞总数，计算量要求达到的所需的感染复数（MOI）（50％至100％传染性颗粒细胞）的病毒悬液。
6. 稀释分装在1.8 ml离心管体积的HBSS中前仔细pipeting适量病毒悬液在HBSS中的病毒。 HBSS中聚合的细胞，每孔50μL是适当的。
7. 驱散pipeting他们在他们管，然后吸管必要的量，实现成一个6孔悬浮培养板的孔，每孔40细胞的细胞。
8. 每孔加入适当稀释的病毒量，以达到所需的教学语言。
9. 中等至每口井，使总体积为1.7毫升。
10. 将盘上轨道摇床培养箱内。振动筛上设置一个较低的设置，使中等轻轻洗井（〜100 RPM）左右。允许细胞以aggregaTE为24-36小时。应形成一个直径约75-175微米聚合。

3。细胞封装在PEGDM

1. 细胞可作为分散（步骤2.4）或以下的聚合（步骤2.10）封装。由于水凝胶的易制毒化学PEGDM解决方案是一种液体，细胞可能倾向于解决之前，交联和凝胶的形成。如果解决有望出现迅速，如较大的聚集，它可能是有益的两个步骤中产生凝胶，使细胞定居到中央的凝胶平面。一个单步水凝胶的合成过程，适合于分散的细胞显示（ 图 2），以及两个步骤所示（ 图 3），下面详细（3.2-3.9 ）。
2. 创建一个将削减1毫升的塑料注射器的锥尖，并把打开它在机架年底形成的水凝胶的船只。
3. 吸取20μL的光敏PEGDM，以便到柱塞注射器开放lution确保该卷涵盖了整个柱塞表面。调整柱塞以小增量，实现了平坦的液体表面。
4. 放置在机架中的位置下方约8分钟的紫外灯（365nm的，7〜毫瓦^/平方厘米）机架，让水凝胶交联的吸管。在这段时间内，制备的细胞可能会开始
5. 吸取含有1.8 ml离心管细胞/聚合所需数量的卷，第，130克，5分钟离心管。
6. 使用移液器，小心地取出，而不会干扰细胞沉淀在管尖媒体。由于媒体负责人沉淀的方法，它可能是有益的，使用更精细的10微升吸管尖。
7. 轻轻重悬细胞沉淀在20μL光敏PEGDM解决方案（使用宽口吸管尖，如果与聚合工作），并添加顶部的Th细胞悬液的注射器Ë以前交联水凝胶的一部分。
8. 注射器暴露的紫外光一个额外的8分钟内完成建设的水凝胶。完成后，细胞被完全封装外圆内水凝胶（ 图3）。
9. 弹出从注射器到1毫升以及一个24孔板中，简单地洗凝胶的HBSS的水凝胶。凝胶在24孔板和文化以及传输所需的条件下，以1毫升的媒体。

4。缺氧跟踪

1. 在任何一点，在文化，形象的细胞用荧光显微镜来跟踪开始缺氧的信号。成像是什么，你可以多孔板的图像或凝胶转移到载玻片事先安置在显微镜舞台上。山顶激发的Ds红在556nm达到峰值发射发生在586nm。排放量是相当激烈，因此漂白尚未观测教育署是有问题的。启动蛋白质生产和第一信号检测之间的滞后时间约为12小时。信号是不够具体，识别单个信号细胞，但分辨率可能不足以确定细胞内信号本地化。在信令细胞，通常观察到的信号是在整个细胞质中均匀。还可以增加信号强度，长期暴露在缺氧，虽然我们尚未完全确定，如果这是由于蛋白表达增加，总蛋白的积累，或延迟蛋白成熟。

5。代表性的成果

封装MIN6聚集在PEG水凝胶的一个有代表性的例子是如图4所示。交联凝胶将固体整个反应的船只的形状。一个光滑的外表面的凝胶是可取的，有助于防止异物重新植入响应。凝胶内，应完全封闭的细胞聚集在基质中均匀分布，以便更好的养分运输。

MIN6聚集在缺氧的信号代表图像是描绘在图5。无论是20％O _2（5A）或1％O _2的 44小时（5B）相同MIN6标记病毒感染聚集培养前的图像采集。

图1。缺氧标记系统的活动的示意图。的DS红DR基因和上游的HRE启动子的腺病毒插入允许对缺氧诱导的HIF - 1的控制之下的荧光蛋白的生产。

单步封装程序流程图图2。分散在CR MIN6细胞osslinked PEGDM水凝胶。对于每个凝胶，分散的细胞悬浮在光敏PEGDM单体溶液40μL。这是摆在断头1ml注射器和365nm的紫外线光10-12分钟后下形成凝胶。工程完成后，水凝胶磁盘是从注射器中删除，洗净，放置在装满一个中等孵化孔板。

图3双步汇总MIN6细胞在交联PEGDM的水凝胶的封装程序流程图。对于每个凝胶，半凝胶是第一所形成的光敏PEGDM 8分钟的单体溶液20μL的紫外光交联。仔细暂停MIN6聚集在光敏单体的解决方案，这是预先形成的半凝胶上添加额外的20μL。凝胶形成与聚合的紫外线照射一个额外的8分钟，完全封装在内侧平面凝胶。

图4。40μL水凝胶20X放大倍率下的图像。 MIN6聚合（〜40个细胞）内的凝胶清楚地看到。水凝胶的直径约6毫米（栏= 1mm）的。

图5荧光缺氧信号汇总MIN6细胞在PEGDM凝胶。封装和20％O _2，然后放入孵化44小时的细胞不显示，而细胞，然后封装在_2％的O 2 44小时孵育显示效果清晰，无处不在的信号的缺氧信号（一）。 （标尺示100μm）（B）。

讨论

这里介绍的方法，提供了一个细胞封装在非生理条件下的最小使用PEG凝胶快速和简单的技术。 PEG代表一个非常有用的封装材料，其生物相容性和易于修改。简单的PEG在光敏溶液的百分比变化，例如，可用于调节通过孔径的机械性能，如压缩模量和输运性质。此外，PEG很容易修改，除了侧链。聚乙二醇水凝胶，因此，是一种很有前途的临床设备和灵活的平台， 在体外研究

跟踪PEG封装细胞缺氧的方法也被提出。缺氧检测的简单性和避免需要的利益而牺牲的细胞，这种方法非常有用。该技术可应用于多种类型的细胞在其我们的各种条件efulness广泛。例如，作为干细胞分化的提示缺氧可能是干细胞微团培养跟踪。但是，这种方法只能适用于分散的电池系统或系统中，分散细胞后汇总。此外，检测荧光信号可能难以在更大或更密集的组织。

材料

试剂名称	公司	目录编号	评论（可选
聚乙二醇	Sigma - Aldrich公司	309028 - 500G
甲基苯酐	Sigma - Aldrich公司	276685 - 100ML
微波	艾默生	MW8784SB
Vortexer	科学工业	SI - A236
二氯甲烷	Sigma - Aldrich公司	D65100 - 1L
乙醚	Sigma - Aldrich公司	346136 - 1L
透析管	频谱	132640
	实验室
冰箱
冻干机	Labconco	7670521
真空泵	韦尔奇	8917Z - 01
Irgacure 2959	汽巴嘉基	029891301PS04
HBSS	Mediatech	21 - 022 - CV
注射器过滤器	VWR	28145-477
RPMI 1640培养	Mediatech	*	*自定义的制定
胎牛血清	临时机场管理局实验室	A15 - 351
青霉素链霉素	Mediatech	30 - 002 - CI
两性霉素B	Mediatech	30 - 003 - CF
孵化器	Thermo Scientific的	3597	新机场工程统筹署8000系列WJ W / O2抑制
胰蛋白酶EDTA	Mediatech	25 - 052 - CI
轨道摇床	VWR	12620-926
紫外灯	三洋Denri	FLR40SBLB / M	可容纳两个40W，365nm的黑光灯蓝色紫外线灯泡
离心分离	Eppendorf公司	5811 000.010 *	*订单号。 型号5810 ř
显微镜	尼康	TI - ND6 - PFS	随着556nm激发/ 586nm排放filterset