巴西田间放生转基因 伊 蚊的大规模生产

摘要

为了利用^RIDL®（释放携带主要致命物的昆虫）系统来抑制伊蚊，需要释放大量的雄性蚊子。这就需要利用大规模饲养技术和工艺，提供可靠的系统，以获得数量最多的优质雄性蚊子。

摘要

正在寻求新的技术和方法，以争取赢得与蚊子的战斗。分子技术的最新进展导致以无菌昆虫技术^（SIT）1-3为基础的新的和创新的蚊虫控制方法的发展。一种称为RIDL（携带主要致命物的昆虫释放^）4的控制方法，以SIT为基础，但使用遗传方法消除辐射灭菌^5-8的需要。在大开曼^9，10的田地里，一种E.aegypti的RIDL菌株被成功测试：计划或正在世界其他国家进一步实地使用。

在几个昆虫物种中已经建立了大规模昆虫饲养，每周达到数十亿的水平。然而，在蚊子中，饲养一般规模要小得多，大多数大规模饲养是在1970年代和80年代进行的。对于 RIDL 计划，最好尽可能少地释放女性，因为它们会咬伤和传播疾病。在大规模饲养计划中，要释放雄性有几个阶段：产卵、饲养卵子直到幼崽，然后在释放前从雌性中分拣雄性。然后，这些雄性用于RIDL控制程序，释放为幼崽或成人^11，12。

要抑制蚊子种群使用RIDL大量的高素质男性成人需要饲养^13，14。以下描述了OX513A的大规模饲养方法，OX513A是Ae.aegypti ⁸的一种REL菌株，用于释放，并涵盖了生产卵子和大规模饲养REL雄性进行控制程序所需的技术。

引言

蚊子传播许多病原体，这些病原体可引起人类一系列疾病，控制这些蚊子几个世纪以来一直是一场持续的战斗。基于化学和生物方法控制昆虫的战略取得了一些显著成功，但在许多情况下，控制在长期内是不可持续的。例如，巴西在50年代实现了消灭 Ae.aegypti， 但蚊子在过去40-50年中重新入侵。这可以归因于许多原因，包括杀虫剂耐药性，环境破坏，控制方案实施不力^15-20，以及快速再入侵没有充分的监测或反应。

正在寻求新的技术和方法，试图赢得这场与蚊子的战斗。 分子技术的最新进展导致以无菌昆虫技术^（SIT）1-3为基础的新的和创新的蚊虫控制方法的发展。一种称为RIDL（携带主要致命物的昆虫释放^）4的控制方法以SIT为基础，但使用遗传方法消除辐射灭菌的需要。已为包括Ae.aegypti 5-8、Ae.aegypti的RIDL菌株在内的多种害虫品种建造了RIDL菌株，在大开曼^9，10油田进行了成功测试：计划或正在世界其他国家进一步实地使用。 使用RIDL抑制蚊子种群需要饲养大量高质量的男性成年人^。

对于 SIT 程序，只释放男性被认为是可取的;雌性蚊子叮咬和传播疾病。此外，被释放的无菌男性可能会被被释放的女性"分心"，降低项目的有效性。在辐照地中海果蝇21的大型野外实验中，雄性释放比混合性别释放有效^3-5倍。

在 RIDL 大规模饲养计划中，有几个阶段可以生产雄性进行释放。 第一种是生产释放生成所需的鸡蛋（图1）。下一阶段是饲养卵子到幼崽或成人，将幼虫与幼虫和雄性幼崽从雌性幼崽中分离出来。在适合大规模分类的特定生命阶段，男性与女性的大规模分离需要性别^差异。在Ae.aegypti（和其他蚊子物种）中，雄性与雌性幼虫之间存在显著的大小差异，可以利用这种差异进行性别分离技术。排序的RIDL男性然后被释放在控制程序作为脓包或成人^11，12。

以下描述了OX513A的大规模饲养方法，OX513A是一种E的RIDL菌株 。艾吉普提， 要释放所述方法涵盖了生产卵子和用于控制程序的RIDL雄性所需的技术。

研究方案

昆虫要求

1. 概述

1. 大规模饲养有几个阶段，每个阶段都在大规模饲养单元的不同区域进行。 图1 显示了饲养的主要阶段和它们发生在大规模饲养设施中的位置。

2. 昆虫的生物安全考虑

1. 该项目得到了巴西圣保罗大学动物伦理委员会的批准，并获得了所有必要的许可证和批准。
2. RIDL 系统使用有条件的杀伤力：膳食补充剂（四环素）可防止RIDL系统的表达，使昆虫大量饲养：没有四环素蚊子就会死亡。在野外的 Ae.aegypti 繁殖地没有发现四环素，因此任何从逃亡者身上产生的后代都无法存活。 这比使用用其他方法（即 辐射）消毒的野生型（WT）昆虫增加了额外的安全性。
3. 使用双门入口，"仅限授权人员"标志和昆虫屏幕中的昆虫。任何窗户都应密封，以避免WT昆虫污染该菌落，并有助于防止昆虫从内部逃逸。
4. 地方法规和当局可能有具体的其他或替代性要求。尽早与有关当局联系以获取信息/指导，并在昆虫中建立 RIDL 菌株之前获得所有必要的许可和批准。
5. 大规模饲养昆虫只应用于RIDL饲养。不应存在其他菌株或昆虫。这是为了避免对RIDL菌株的污染和对可能影响健康和生存的病原体的污染，降低被释放的男性的生产力和有效性。

3. 昆虫设计

1. 图2 显示了巴西比奥菲布里卡·莫斯卡梅德使用的昆虫计划。
2. 所有房间的温度为26°C±2），相对湿度约为70-80%，光照时间为12：12：使用荧光灯条的暗周期。
3. 此蓝图可根据特定空间要求进行修改， 例如 释放规模将决定总体大小。然而，鸡蛋的生产、饲养和分拣、质量控制（QC）和释放应分为四个不同的区域：鸡蛋生产殖民地、释放生成、QC和成人储存放生。
4. 鸡蛋生产殖民地室（约20米^2）用于生产卵子的释放生成。
5. 质量控制区是进行实验，检查程序和RIDL线的适合性，包括测量舱口率，幼崽数量，幼崽大小，测量分拣和移除女性的有效性。还通过使用测量杀伤力的偏移检测来检查荧光标记和表型是否存在，从而对WT污染进行了测试。
6. 释放生成室（约36米^2）需要足够的空间来整理托盘和幼虫和幼虫。托盘存放在专用铝架上。饲养和分拣需要一个大的工作区域和水槽，洗盘和笼子需要另一个大水槽。水槽的废水口中包括了一个过滤器捕获陷阱，以减轻活蚊子通过下水道的逃逸。
7. 托盘上使用的所有水都通过排水沟处理，排水沟有一个装有网格的隔间，可防止昆虫在任何发育阶段逃逸。
8. 成人的释放存储区域（成人存储释放， 图 2），包含机架以容纳释放设备，而成人在释放前成熟。

大规模饲养 RIDL 的生产方法：

蛋生产殖民地生产用于释放代（图1）的鸡蛋，以生产成人。这两种饲养方法有许多相似之处，但也有一些明显的区别。仅在鸡蛋生产殖民地部分描述两个程序相同的饲养过程。

鸡蛋生产殖民地

4. 拉瓦尔生产

鸡蛋生产殖民地产生同源OX513A RIDL鸡蛋⁸ 为释放一代。高质量的控制确保了所供应鸡蛋的生存能力、体能和应变完整性。

1. 孵化的刺激是浸入低溶解氧的水中。为了降低水中的氧气含量，加热水，直到它沸腾，并立即将400毫升放入500毫升玻璃罐（74毫米开口周），牢牢地固定盖子，并在室温下离开几个小时冷却。
2. 将1克鸡蛋放入一罐白开水中，重新seal，等待一小时。将物品转移到2升水的托盘中，在昆虫条件下过夜。
3. 将孵化的幼虫放入已知的水量中，用磁搅拌器和跳蚤搅拌，以获得足够的时间取回松石：剧烈搅拌或长时间伤害幼虫，应保持在最低限度。用于孵化幼虫的标准体积为 1 L，但超过 300 幼虫/毫升的密度难以计数，而且可能具有破坏性。因此，孵化不超过30万个鸡蛋/升的水。
4. 通过取三个 1 毫升的吸水纸，并在吸水海绵上放置一张 1 厘米方格的吸水纸，以吸收多余的水，确定舱位率。 通过寻找孵化鸡蛋的缺失帽，从三个正方形计算孵化和无帽子的鸡蛋数量。预计孵化率约为80-90%。
5. 取四个1毫升的松饼，放入四个黑色称重船（幼虫是白色的，因此在黑色背景下更容易看到），并计算眼睛呈现的活幼虫的数量：建议使用计数器。然后，每毫升幼虫的平均数量用于计算每个托盘上添加的水量，以获得每个托盘所需的幼虫数量。
6. 幼虫在株和物种之间饲养的密度可能有很大的差异。将RIDL成年雄性与野生型雄性进行比较也是可取的：理想情况下，你想要类似于更大的RIDL雄性，可以成功地与野生雄性竞争。因此，对于每个 RIDL 菌株，需要确定幼虫的理想密度，并权衡饲养的空间限制和生产规模。密度从0.1-2.5幼虫/毫升，我们发现是生产产出和质量的良好组合：也讨论了美第奇^23。
7. 将幼虫添加到托盘中。在我们的设施中，我们使用约 53 厘米 x 37 厘米 x 8 厘米（L x W x H） 的托盘和所需的水量，以达到幼虫的密度以进行生产。
8. 在 1：100 稀释时将四环素（水中 3 毫克/毫升）的库存溶液添加到托盘中，以获得 30μg/ml 所需的最终浓度。
9. 每天用片状鱼食（www.sera.de）喂幼虫，这些幼虫已被压成细粉。 表1 显示了典型的每天每幼虫食物毫克的喂养制度。在上述昆虫条件下喂养幼虫，直到适当的排序日。

5. 从普佩和男性/女性普佩分拣拉瓦

1. 通过将幼虫与幼虫分离，在孵化8天后从幼虫中分离出幼虫。然后对男性进行性排序。一种称为板分离器^24，25 的装置可以从雄性幼虫和雌性幼虫中分拣幼虫。 图3 说明了使用这个板分离器将幼虫从雄性幼虫和雌性幼虫中分离出来。
2. 使用底部有网状物的测量勺，用 500 pupae 或更多校准它，并用它来设置笼子，并估计产生的雄性和雌性 pupae 的总数量。
3. 在分拣的第一天（第8天），大多数幼崽是雄性，所以把分类的幼虫放回托盘，然后饲养到第二天，当大多数幼崽是雌性（图4）。
4. 每天重复步骤 2.1-2.3 中描述的排序过程，直到所有幼虫都吐出或直到工作周结束。
5. 将 1，000 只雄性幼崽（使用测量勺子）放在笼子里，第 9 天在同一笼子里添加 3，000 只雌性幼崽（我们使用 30 厘米高、直径 30 厘米的 PVC 管，配有网状顶部和网状通道孔，但 BugDorm 也提供 30 厘米 x 30 厘米 x 30 厘米塑料笼）。
6. 允许成人交配至少2天，并为他们提供蔗糖溶液（10%）在血液喂养前在湿棉 广告利比图姆 。收集鸡蛋两周（~两个淋病循环），每周两次血液喂养。这平均产生143，000个卵子从3，000个女性的笼子里（平均48个卵子/雌）。每周生产400万只鸡蛋，每周需要设置28个笼子。

6. 血液喂养

1. 铝板喂养系统每周两次为笼子提供血液。铝板（10 厘米 x 10 厘米 x 3 毫米）侧面用 Parafilm （图 5）创建一个血袋。为了鼓励喂养，血液通过在板材喂食器上放置一个加热豆袋来加热。豆袋由布袋中约250克小麦粒组成，在微波炉中加热约10秒。我们用来喂养的血液来自当地的屠宰场：由于这些动物（主要是山羊和绵羊）是供人类食用的，因此它们经过测试，以避免病原体的存在。
2. 喂血三天后，为雌性产卵提供了一个输卵部位。渗透部位是一个圆形塑料容器，里面装满了约1/4的水和滤纸。两天后，渗漏位置被移除。为了最大限度地生产鸡蛋，请确保滤纸覆盖容器内的整个可用表面，并保持湿润。
3. 取出蛋纸，放在吸尿纸上，在昆虫条件下晾干：鸡蛋需要一段时间的调理在高湿度（超过70%）奠定后至少48小时。只要湿度保持在²⁵度以上，鸡蛋就可以在昆虫中保留长达3个月，孵化率最小降低。
4. 鸡蛋生产群落需要足够大小，以提供每周为释放计划所需的鸡蛋数量。上述设施可生产约400万个鸡蛋，每周设置28个笼子。建议保留足够的鸡蛋储存，以保证至少4周的鸡蛋释放生成和鸡蛋生产殖民地。

发布生成

7. 拉瓦尔生产

释放生成的孵化、饲养和分拣过程与先前描述的鸡蛋生产群落方法相同。然而，生产规模要大得多，这需要更多的托盘和更多的努力。

8. 分拣拉维、雄性普佩和雌性普佩

1. 幼虫、雄性幼崽和雌性幼崽的分类与蛋生产描述的方法相同。
2. 对雄性幼崽进行分类后，在释放前检查雌性污染物是很重要的：在场的女性不应超过1%。取三个500 pupae的阿利奎特（三个随机的小狗测量勺子），并计算在场的雌性小狗的数量。女性可以识别，因为他们一般比男性大，从生殖器叶形状的差异（图6）²⁷。如果女性超过1%，则应再次求助并检查她们。
3. 仅使用第8天和第9天的男性释放：高压灭菌任何剩余的幼虫和幼虫。在巴西，这种废物必须与医疗废物一样对待，但其他国家的法规可能有所不同。不要使用卵子生产殖民地释放代的雌性幼崽和幼虫，因为质量控制、饲养和污染风险的差异来自数量较大，质量控制较低。

成人存储释放：将男性放入释放设备中，在发布前出现并成熟。此方法不包括释放设备的详细信息。但是，我们使用的释放设备的容量约为 1，000 男性。此方法不包括释放方法详细信息（释放设备和释放系统）。

结果

预期的幼崽生产结果显示在 图4中。雄性幼崽先，第8天达到顶峰，孵化后第9天雌性达到高峰。重要的是要测量这个小狗曲线，知道最好的时间排序男性从女性。

超过6个月的男性和女性幼崽分类结果显示，女性平均污染率为0.02%（图5：SEM = 0.004%） 。这种污染率仅代表在一个月内释放的400名女性（约200万男性）。目前每周的鸡蛋产量为400万。其中350万只孵化用于卵子群落和生产，其余储存起来供备份。大约11%的鸡蛋用于卵子生产群落，其余用于释放生成。鸡蛋孵化率平均为87.3%（SEM = 0.5%）L1幼虫的雄性幼崽平均产量为29.5%（SEM =1.2）。每周为繁殖一代繁殖的幼虫饲养200万只，产自约571，000只雄性幼崽（SEM = 14，000只）。Pupae 和成人在出现和释放期间的平均死亡率为 5%，导致每周约有 543，000 只（SEM = 13，000）释放成年雄性蚊子。预计目前400万鸡蛋/周的产量可降至300万/周，并进一步优化，以减少浪费和储存造成的损失。所述生产总共需要6名工作人员：四个工作释放生成和其余的两个在卵子殖民地。

质量管理

质量控制对于保持成年人的素质、饲养效率、劳动力和成本至关重要。

转基因表型控制

为了验证RIDL基因表达，我们进行了两项控制，一是检查荧光标记的表达，二是在没有四环素的情况下检查RIDL杀伤性特征的表达。所有幼虫都应该表达荧光标记。为了检查荧光标记是否按预期表示，2，000 只首次星内幼虫在 Leica MZFLIII 立体显微镜下使用 DsRed2 过滤器 （得克萨斯红） 进行检查，以确定是否有任何无荧光个体存在。没有四环素的RIDL基因被表达出来，我们预计^成人8的存活率为3-4%。为了检查这一点，为每个未四环素的释放批次设置一个额外的托盘。与正常饲养的唯一区别是，食物从第6天起减少2/3，因为由于死幼虫积累多余的食物会导致细菌过度生长。

饲养控制

随机选择释放生成中的四个托盘进行排序和单独计数。每天从每个托盘记录的男性和女性幼崽的数量（图4）。与预期的男性和女性数量的任何偏差都表明存在一个潜在的问题，可能会影响生产和/或健身，并可与卵子群进行比较，以帮助确定问题的根源。

普佩测量

普佩的大小已被证明与成人大小²⁸相关。作为成人尺寸的质量控制，从释放生成开始，每分拣一天至少测量 30 只雄性幼崽：对于鸡蛋生产殖民地女性幼崽也测量。释放的雄性的平均头孢菌宽度为1.05毫米（SEM 0.005），释放的雄性平均宽度为1.04毫米（SEM =0.006）和1.29毫米（SEM =0.006），男性和女性分别为卵子生产、殖民地：类似的结果也取得了类似的结果，为A.阿尔博皮图斯大规模饲养^24。

图1。大规模饲养蚊子用于RIDL/SIT计划的阶段。 蛋类生产殖民地具有高水平的质量控制，以确保提供给释放一代的鸡蛋的质量。 卵子被饲养到释放的殖民地，在那里雄性从雌性排序。 然后，男性成人用于 RIDL 控制程序。

图2。 用于生产 RIDL 雄性为释放程序的饲养设施的示意图。 优质鸡蛋在鸡蛋生产殖民地室不断生产，然后通过饲养到释放生成室的幼蛋。幼虫和幼崽然后分开，幼崽为雄性进行性分类。然后，男性被放入释放装置，并允许成熟成人在成人存储和释放室释放。

图3。 使用板分离器²⁶分离幼虫、雄性幼崽和雌性幼崽。  板块分离器使用幼虫、雄性幼崽和雌性幼崽之间的大小差异来分拣这三个不同的生命阶段：幼虫往往比雄性幼崽小，而雄性幼崽又比雌性幼崽小。 仪器由两个玻璃板组成：一个固定在第一个板的顶部，另一个可以移动相对于第一个使用四个调整螺丝（A）。 四个调整螺钉允许将外板设置在后板的角度，以便在板之间形成楔形空间，向下逐渐减少。 幼虫和幼虫倒在玻璃板（B）之间，用水管（C）轻轻清洗。 通过调整板的角度，幼虫、雄性幼崽和雌性幼崽可以分开（D）。 随着连续冲洗和增加板角，幼虫可以冲过第一个（进入筛子），其次是雄性幼崽，最后是雌性幼崽。

图4。 大规模饲养的里德尔Ae.艾吉普蒂的小狗曲线。  此图显示了在 23 周观察期间大规模饲养的 RIDL 雄性和雌性幼崽的平均比例，每周恢复约 135，000 只幼崽。 错误条=平均标准误差，n=23。在第一次收集（第8天），我们平均恢复59%的男性和30%的女性幼崽从总脓包从托盘恢复超过5天。

图5。 平均女性污染排序的雄性幼崽。 此图显示了在孵化超过六个月后，男性在第 8 天分拣期间女性污染的月平均百分比。

图6。铝板血液馈线系统。盘子（B） 覆盖着帕拉菲尔姆（A），血液被吹进口袋里， 然后密封（D）。盘子被放在笼子上，通过在上面放置一个加热的豆袋（C）加热。 

图7。 区分男性和女性 的艾吉普蒂 · 普佩。  Ae . aegypti 幼虫可以通过生殖器叶形状的差异（在桨下方的 pupal 腹部段的末端）可靠地进行。此外，男性也往往比女性小。

表1。 Ae. 艾吉普蒂 里德尔幼虫的一般喂养制度（每天每幼虫的食物毫克）。 计算实际需要的食物量乘以每盘幼虫的总数。

讨论

RIDL是一种有效和环保的方法，控制蚊子^3，29-31。该技术适用于综合害虫管理计划，目前大多数控制方法，包括杀幼虫剂、繁殖地减少和成人杀虫剂都与这项技术相容。此方法描述了如何每周生产多达 570，000 个 RIDL 雄性幼崽，用于 Ae 的控制。据我们所知，这是第一次描述这种规模的转基因蚊子的生产。在20世纪60年代和70年代²⁵年代，为野生Ae.aegypti开发了一些类似的生产系统，但自那时以来，一直没有这种规模的可比生产。从2011年2月到2012年2月，巴西约有1100万男性被释放。控制某一区域所需的雄性数量取决于若干因素，包括野生种群的规模、释放的雄性分布、释放后雄性生存和交配竞争力以及环境条件。 先前的研究表明，RIDL至少可以减少80%的蚊子数量^。

在优化生产规模和成本与男性质量之间需要平衡。例如，增加幼虫密度可以通过减少所需的空间、劳动力和时间来增加^{生产能力。}然而，幼虫密度过高会导致寿命更小、寿命较短的雄配能力降低^{32 ， 33 。}与 SIT 计划相关的男性质量最终将由被释放的男性在实地与女配的能力来评估。需要广泛的实地评估，以评估交配竞争力相对于野生同行^9，10。这往往使准确评估哪些因素使"高质量"雄性蚊子不切实际。然而，在大规模养殖中保持一致的生产和质量（在可以定期评估的程度）是至关重要的。这需要高度警惕和标准化所有流程，小波动可能会产生重大影响。L1幼虫的引文是关键一步，说明了这一点。将正确数量的幼虫加入托盘对优质生产至关重要。喂养制度正是为特定数量的幼虫量身定做的。幼虫太少/太多会导致过度/喂养不足，从而影响幼虫的生存、幼虫的大小和幼崽的时间。如果说大规模饲养艺术有一个秘密的话，就是要确保生产周期中的许多小步骤能够像本文所述，持续、精确、高质量地进行。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vipan Premium	Sera GmbH	190	http://www.sera.de/uk/pages/products/product/sera-vipan-3.html
Tetracycline	Sigma Aldrich	T7660	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?D7=0&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&N4=T7660|SIGMA&N25=0&QS=ON&F=SPEC
Plate separator	J.W. Hock	5412	http://www.johnwhock.com/download/manuals/instr_5412_separator.pdf
Parafilm M	Pechiney Plastic packing	PM-996	www.parafilm.com
Rearing pans for Release generation (53 cm x 38 cm x 8 cm)	Pleion	0757	http://pleion.actcenter.com.br/produtos.asp?opcao=1
Fluorescent scope	Leica Microsystems	MZ FLIII	http://www.leica-microsystems.com/fileadmin/downloads/Leica%20MZ%20FLIII/Brochures/M1-160-0de.pdf
Adult cages	BugDorm	DP1000	http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
Filter paper	CELAB		http://www.casadolaboratorio.com.br/subpage118.html