神经元形态的研究方法：<em&gt;体外</em&gt; RNAi技术在胚胎小鼠大脑皮质的电穿孔

摘要

我们描述涉及的方法进行快速评估的功能基因在大脑皮层的发展，体外电质粒共表达抑制核糖核酸（RNA干扰）和绿色荧光蛋白在小鼠胚胎皮层。该协议是适合研究神经发育的各个方面，如神经，神经细胞迁移和神经元的形态，包括树突和轴突生长。

摘要

大脑皮质的指示较高的认知功能。这6个层状结构会产生一个内部第一，外部最后的方式，其中第一个出生的神经元保持密切的心室，而去年出生的神经元迁移过去的第一个出生的神经细胞向大脑表面^1。除了 ​​神经细胞迁移^2，皮质功能正常的一个关键过程是调节神经元的形态^3。虽然神经元形态，可在原代培养体外研究，有多少要了解到，从这些过程是如何在组织环境监管。

我们描述的技术来分析神经细胞迁移和/或在大脑皮层的器官切片^4,6形态。用于修改一个pSilencer载体，其中包含同时U6启动子驱动的双链发夹RNA和一个单独的编码绿色荧光蛋白表达盒驱动b雅CMV启动子^7-9。我们的方法允许候选基因的具体击倒后突起生长的缺陷快速评估，并已成功用于在屏幕上一个突起生长⁸监管。因为只有一部分细胞会表达的RNAi构造，器官切片允许镶嵌一个潜在的表型分析。此外，因为这种分析是在附近近似体内环境，它提供了一个低成本为皮质功能未知的基因，并迅速替代代转基因或基因敲除动物。最后，在体内电穿孔技术相比， 体外电击实验的成功是不依赖于熟练的手术技巧的发展，可以用更短的训练时间和技能进行。

研究方案

1。准备培养液和媒体（不是视频）

1. 准备完整汉克平衡盐溶液（HBSS中）含有1X HBSS中，2.5毫米HEPES液（pH7.4），30毫米D-葡萄糖，1毫米_氯化钙 ，硫酸镁₄ 1毫米和4毫米碳酸氢钠₃ 1升。加入双蒸水（DDH _{2 O）}的。过滤消毒用0.2微米的过滤器，并储存于4°C。
2. 准备片用35毫升基础培养基鹰媒体的培养基，完整的HBSS 12.9毫升，20毫米D-葡萄糖（1.35毫升的1 M的解决方案），1毫米Glutamax 200毫米的解决方案（0.25毫升），0.5 ml青霉素链霉素100X股票的。 0.2微米的过滤器过滤消毒，然后加入热灭活马血清终浓度为5％。
3. 准备1毫克/毫升原液用无菌蒸馏水去离子水层粘连蛋白，层粘连蛋白工作的解决方案。准备在0.5毫升离心管加入100μL分装和冻结在-80°C。
4. 所以准备聚-L-赖氨酸的工作lution通过加入聚-L-赖氨酸5毫克，1毫克/毫升原液5毫升无菌H _{2 O。}准备1毫升分装和冻结，在-20°C
5. 准备到终体积12毫升无菌水稀释1毫升聚-L-赖氨酸和100μL粘连涂层解决方案。每次作出新的这一解决方案。

2。准备器官切片插入（没有视频）

1. 准备一个文化的插入，每孔用无菌镊子两个六孔板。加入2毫升无菌DDH _{2 O的}下方的文化插入。
2. 加入1毫升的照顾，不穿刺膜的膜之上的涂层解决方案。在饱和湿度培养箱隔夜在37°C和5％的CO _2。
3. 除去包衣介质，并用无菌H _{2 O}三次膜。让我们在使用前插入干。加入1.8毫升片培养基，在37°C间孵化器的地方。用封口膜包住未使用的板块在4°C存储长达4周。

3。电穿孔的准备（没有视频）

1. 准备电击的RNAi构造。双链RNA发夹插入克隆到pSilencer载体。质粒含有：1）1 U6启动子驱动的双链RNA代和2）的GFP表达盒由CMV启动子^8,9驱动。这种质粒以前一直由小西和他的同事和其他^7,8描述。质粒纯化使用Qiagen公司的最大准备套件，并在1毫克/毫升的浓度使用。
2. 以可视化的DNA，而注射，准备了0.5％的快速绿色染料溶液和使用它的DNA被注入（通常为20μL的DNA 1μL快速绿色）在1:20。超过离开的DNA快速绿色染料混合物可以储存在-20°C到一个星期。
3. 清洁的清扫面积，dissecti吴用70％乙醇的工具和vibratome船只。冷藏完整的HBSS，以便它是冰冷的。的寒意vibratome船只围绕它包装内快速冷却的vibratome一些水冰。使用完整的HBSS，准备3％低熔点琼脂糖。微波1分钟。避免了沸点。保持在42℃水浴，直至使用。
4. 电参数设置如下。 1 E15胚胎使用35伏特，5个脉冲，长100毫秒，900毫秒脉冲之间的间隔。对于年龄较大的动物，以确保电，使用更高的电压高达50 V或增加脉冲数高达8个脉冲。为了防止损坏，在年轻的动物组织，使用更少的脉冲或2脉冲和低电压高达25 V。这些参数可能是多种多样的，凭经验确定取决于动物的年龄。

4。解剖和电（视频）

1. 安乐死女性怀孕后，解剖胚胎放进冰水里完成的HBSS。柯EP在各自的胎盘囊胚胎。
2. 解剖胚胎，并切断后的第一颈椎头。保持在冰冷的完整的HBSS。
3. 注射，头放在一块培养皿上的封口膜。使用自定义Hamilton注射器（ 见表一 ）注入约6至8μL的DNA：通过第三脑室快速绿色染料混合，以填补皮质囊泡两侧脑室。另外，注射可以直接进入每一个侧脑室。
4. 为体外电击，使用BTX-镊子铂电极。背皮质即头顶部electroporate的皮质，你想向一侧放置正极。
5. 电击后，静置至少5分钟前解剖上冰元首。
6. 解剖大脑在使冰冷HBSSby的头部一侧的一个小切口，剥离头的两侧皮肤的折扣。下一步，细镊子轻轻剥离从脑软。从头骨完整的大脑取出，注意不要损坏皮质。

5。嵌入和电穿孔皮质切片（视频）

1. 3％低熔点琼脂糖转移到冰上放置了一个大型模具。模具的底部将开始固化速度更快，这将防止下沉模具底部的大脑。轻轻地，转移与细镊子取出后多余的缓冲，与Kimwipe或滤纸的大脑。使用10微升吸管尖漩涡的大脑内的模具，以确保琼脂糖和脑组织之间的最大接口。
2. 东方的大脑，以确保所有的大脑都在同一方向，并在同一水平在琼脂糖。让琼脂糖巩固约5分钟。使用粘接胶（疯狂胶），使嗅球站在重视琼脂糖块。一旦块被重视，立即加我每个大脑获得CE冷的HBSS和琼脂糖修剪，以确保个人片。
3. 切块，低速（约一半的最大值）设置的vibratome的速度和叶片的振动频率设置在最高设置。产生250微米厚的冠状切片。检索切片，用弯曲的细铲，并用细刷或镊子转移他们组织井。
4. 在组织文化的引擎盖，转移到片涂层刀片。加入500μL片培养基每个插入容易转移。每个刀片可放置多达5片。删除多余的介质，从切片的顶部，并在37°C在加湿的孵化器孵化。

6。文化和器官切片分析（视频）

1. 为了保持健康的切片，新鲜媒体应增加至少隔日膜取代一半的媒体每次下方。
2. 为了分析切片后的d文化esired天，固定在膜切片。 1X的磷酸盐缓冲液（PBS）的37°C间三次，每次10分钟洗净。接下来，4％多聚甲醛（PFA）过夜固定在4°C或在室温下为1小时。
3. 片可以分析不同的细胞标记或单独用Hoechst染色，电穿孔和电穿孔非细胞可视化。通透和阻止片2小时，在室温下用10％山羊血清，0.1％，在1X PBS轻轻摇动TRITON。
4. 用Hoechst染色在室温下为1小时，用3次，每次10分钟1X PBS轻轻摇动。
5. 要挂载切片用手术刀膜，并用细镊子转移一个磨砂玻璃片膜在水室的幻灯片。可以置于载玻片每到5片。删除多余的水，并添加一个解决方案，每个大脑切片Flourmount下降。轻轻地放在大脑切片上盖玻片，并删除Ÿ气泡。利用共聚焦显微镜分析片。

7。替代器官切片石蜡包埋（没有视频）

1. 也可以被嵌入器官切片石蜡更精细的形态分析，为此包含的器官切片的膜，可固定在煤灰作为以上所述的4％。
2. 固定片嵌入在1％琼脂糖（预先加热至37°C），并在冰凝固为30分钟。琼脂糖块，然后可以在4℃后固定为30分钟，在4％的煤灰。
3. 琼脂糖块包含的器官切片，然后将石蜡包埋免疫处理，如先前所述^10。

8。代表结果

如图1所示的小鼠皮层和文化的器官切片电图解。这种方法是一个RAPI有用的战略ð评估功能在神经元发育有关的基因^11。根据量DNA的电穿孔和电在萌芽阶段，转染效率会有所不同。片会开始表达绿色荧光蛋白至少8个小时后，电和细胞将进行正常的神经活动，在文化（增殖，迁移和早期神经细胞分化）序列图2显示了一个电脉冲的大脑切片，表达了控制pSilencer-GFP的向量和一个可以观察到神经元祖细胞，神经元迁移和分化的神经元在片。器官切片将保持其形态，只要他们保持在一个良好的媒体空气膜接口，可以使用至少5天的文化。

图1。插图体外电击和器官切片培养法。E14.5胚胎解剖，快速的绿色染料混合的DNA与单独注射，以可视化的注射部位。 DNA可在两个侧脑室注射插图描绘，以填补侧脑室或第三脑室。注射后大脑电穿孔方波electroporator，正电极放在大脑所需的一面。大脑在3％低溶点琼脂糖和切片使用vibratome嵌入。 250微米的大脑切片放在0.4微米插入，并培养了一个星期。转染后8小时后可观察到绿色荧光蛋白。

图2。电脉冲的大脑切片分析。电穿孔的大脑切片进行染色赫司特。背的皮质神经祖细胞电穿孔在脑室区（VZ）。 CORTI中的神经元CAL板（CP）是由边缘区（MZ）分隔。白色箭头显示移植的神经元。在这种情况下，被注入大脑在E15.5与pSilencer GFP控制向量与电穿孔。部分代表电后4天的皮质外植体。比例尺100微米。

故障排除：

1. 转染效率低：调整用于至少为1μg/μL的DNA浓度。总是从马克西准备使用非常干净的DNA，如果必要使用内免费Quiagen的试剂盒纯化的DNA。
2. 转染细胞在不同的大脑区域，一个比一个期望：确保向一侧被电脑的正极位置正确，电极定位。
3. 片失去器官形态变化的媒体每天，确保片漂浮在媒体
4. 琼脂糖片脱落，因为他们正在削减在vibratome：确保良好的界面嵌入在低熔点琼脂糖时的大脑。

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讨论

这些方法包括体外电击质粒编码双链RNA发夹和器官切片⁴提供了几个明显的优势文化。首先，这些方法可以快速评估为RNAi派生的表型的。 pSilencer载体包含U6启动子驱动的双链RNA发夹编码绿色荧光蛋白表达盒中列入允许细胞电穿孔与RNAi载体的快速识别和表征。除了时间效率，这些方法具有高度成本效益的几个淘汰赛行产生相比。第二，与生存电技术^12，需要较长的培训和技能?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
汉密尔顿注射器	哈密​​尔顿	80008	31计，0.5英寸长，PT-4（点斜边的水平），体积10μL
白金tweezertrodes	A型肉毒毒素	45-0489	5mm大小
ECM830 electroporator	A型肉毒毒素	45-0002
BTX的脚踏	A型肉毒毒素	45-0208	ECM830 electroporator
振动刀片切片机	徕卡	VT1000小号
6 - 以及菜用插入	鹰	353502	包含适合插入的缺口
组织培养插入	鹰	353090	0.4微米
快绿	西格玛	F7252
低融点琼脂糖	稳	BP165-25	DNA的等级
层粘连蛋白	Sigma-Aldrich公司	L2020
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich公司	P5899
培养基鹰	Sigma Aldrich公司	B - 1522
无钙，镁10倍的HBSS	GIBCO公司	14180-046
肝素钠的游离酸	Sigma-Aldrich公司	H4034