网站特定的细菌染色体工程：ΦC​​31整合介导的盒式交换（IMCE）

摘要

描述一个快速和有效的方法融入预制受体菌株，称为停机坪株，外源DNA的利益。该方法允许进入工程着陆垫一个给定的应变轨迹的站点特定的DNA盒的整合，通过共轭ΦC31整合表达。

摘要

可用于细菌染色体的稳定保持在大型基地范围内¹外源DNA。整合到染色体复制质粒，质粒稳定性，质粒不相容性和质粒拷贝数变异，如规避的问题。这种方法使用从链霉菌噬菌体（Φ）C31的^2,3特定地点的整合。 ΦC31整合酶催化两个特定的DNA位点之间的直接重组：attB和attP（34和39个基点，分别^）4。此重组是稳定的，并没有恢复^5。一个“着陆垫”（LP）的1霉素抗性基因，AADA（SPR），和大肠杆菌组成的序列大肠杆菌 β-葡萄糖醛酸酶基因（uidA基因 ）两侧attP网站已整合到苜蓿根瘤菌，Ochrobactrum anthropi，在区域间的农杆菌染色体， 上午PC轨迹和的TETA轨迹，分别与根瘤菌用于在该协议。捐助动员的载体侧翼1填塞红色荧光蛋白（RFP）基因和抗生素抗性基因的attB网站也已建成。在这个例子中使用庆大霉素的耐药质粒pJH110。使用SPH我和 Pst一所需的结构可能会被替换的RFP基因⁶另外attB网站两侧，可能是一种人工合成的构造子克隆到动员的载体，如pK19mob ^7。由lac启动子驱动的ΦC31整合（克隆pHS62 ^8）基因的表达质粒pRK7813 ⁹上动员的广泛的寄主范围。

一个tetraparental交配协议用于转移到捐助盒的LP菌株，从而取代捐助卡带在LP序列标记。这些细胞的移植S-稳定整合。横贯稳定整合，形成了0.5％的典型效率。横贯稳定整合通常是发现在第一500-1000菌落筛选抗生素的敏感性，或用5 - 溴-4 - 氯-3 - 吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸（X GLUC）蓝白筛选。该协议包含用于创建和隔离跨稳定整合的交配和选拔程序。

研究方案

1。文化生产

1. 准备无菌液体介质：TY ^10（5克/ L，蛋白胨，酵母提取物3克/升，0.44克/升的氯化钙脱水^），11磅（10克/ L，蛋白胨，5 g / L酵母提取物，5克/氯化钠，pH值7）。
2. 从一个单一的殖民地：TY传媒SmUW227（ 根瘤菌的 LP应变：建设将在别处描述，紧张施工细节要求）（）到5毫升50微克/毫升大观接种。接种以下株，到5毫升的LB液体培养基，给予抗生素补充： 大肠杆菌大肠杆菌 ^DH5α12 pJC2，整合表达载体，含10微克/毫升四环素; E。大肠杆菌 MT616 ^13日的动员，10微克/毫升氯霉素; 和 E。 大肠杆菌 DH5αpJH110，捐助卡带载体，含有5微克/毫升的庆大霉素。
3. 孵育E。在37及隔夜大肠杆菌菌株度;ç不断晃动。孵育S。两天用颤抖的根瘤菌株在30°C。它有可能获得与根瘤菌文化具有较大的接种（1:500饱和文化的亚文化）过夜。

2。文化的制备和混合

1. 每一株洗净文化1.5毫升离心收集细胞沉淀在17000 XG为30秒和1毫升无菌0.85％氯化钠重新悬浮;重复一次。
2. 100无菌0.85％氯化钠液重悬沉淀。
3. 个别发现每一个普通的TY琼脂平板上的应变10微升水洗文化。这些点是控制点。
4. 加入40μL的每个菌株的大肠杆菌除外大肠杆菌 DH5α含有pJC2在无菌试管，混合，并当场这种混合物120μL纯TY琼脂平板上^12。这点是没有整合阴性对照。
5. 加入40μl每一株的无菌ţUBE，千姿百态，与现货160μL纯TY琼脂平板上这种混合物。这点是IMCE交配点。
6. 允许点干层流罩。
7. 密封板和30°C过夜孵育。

3。隔离跨稳定整合

1. 连续控制点和IMCE点到TY平板补充200微克/毫升链霉素（SmUW227菌株Rm1021基于它带有一个突变赋予高级别抗链霉素^14）和30微克/毫升的庆大霉素。
2. 计算的IMCE效率的，悬浮约¼的的的IMCE交配点，在500μL无菌0.85％氯化钠。 10倍系列稀释至^10-7。板稀释到10 10 ^-2 TY琼脂板补充200微克/毫升链霉素和30微克/毫升庆大霉素，选择跨稳定整合^-5。板稀释度10 ^-3 THRough 10 ^-7补充200微克/毫升链霉素，选择反式稳定整合和潜在的受助人，即总受助TY琼脂板。
3. 对于悬浮隔离的无标记转稳定整合约500μL无菌0.85％氯化钠一季度IMCE交配点。 10倍系列稀释至^10-6。板稀释补充200微克/毫升链霉素和200微克/毫升的X GLUC四个TY琼脂板^10-4到^10-6。
4. 3天在30°C孵育板。
5. 查看RFP的反稳定整合在绿光（525纳米），并通过一个红色的过滤器（> 610 nm）的^15。
6. 计算％IMCE效率，反式稳定整合菌落形成单位相比，总受助人的菌落形成单位。大约一半的反式稳定整合将发生真正的磁带交换，使他们的白色和大观霉素敏感。
7. 找到刘元反稳定整合（W，捐助向量在这里不包含像pJH110）屏幕为白色菌落（延长潜伏期，在室温下的额外1-2天，将加强分化的殖民地通过X GLUC的的^通用汽车研究，这是必要的， 在 S 根瘤菌 SmUW227），TY琼脂平板上确认没有殖民地的筛选抗生素和TY琼脂板含有100微克/毫升大观霉素的敏感性。

4。代表结果

经过3天的潜伏期上TY辅以链霉素和庆大霉素控制条纹应该没有增长。 IMCE连胜应该有头连胜和图2可以看出，第二连胜的许多殖民地的融合发展。跨国整合的效率，跨稳定整合总受助人的百分比表示，应该在0.5％的范围内。约一半跨稳定整合，将大观霉素敏感和白色显示他们已​​经经历了真正的磁带交换。绿光（525纳米）下，通过一个红色的过滤器（> 610 nm）的¹⁵时，，横贯稳定整合包含从pJH110的测试RFP捐助卡带显示有迹可寻RFP的荧光。

图1共轭混合插图：质粒计算机辅助从pRK600转移基因的表达，都是随机从细胞到细胞转移。在混合物中的反式稳定整合创造IMCE，整合（int）的助手的质粒pJC2和捐助质粒pJH110所需的两个质粒通过的LP应变的收购，这种转移的结果。从非复制捐助质粒（pJH110）捐助卡带交换通过ΦC31整合活动的LP，磁带在染色体上的标记，造成损失的LP标记（SP^r和uidA基因 ）和捐助卡带（RFP和^通用汽车研究）中产生的反式完整之维护。

图2。答 ：非选择性的TY板琼脂表面上呈现出干细胞的混合物。接合点板A：链霉素，庆大霉素-X GLUC的板从顶部挑染的接合点，左顺时针没有整合控制，将与 IMCE 根瘤菌，E.大肠杆菌 DH5α， 大肠杆菌含有pJC2控制大肠杆菌 DH5a含有pJH110控制，E.大肠杆菌 MT616控制，S.根瘤菌 UW227 控制 C：10 ^-2稀释交配点悬浮上TY链霉素-X GLUC琼脂ð：10 ^-2上：TY链霉素，庆大霉素- X-GLUC琼脂（蓝色菌落是单一的重组稀释交配点悬浮，白色菌落的真实经历磁带交换） 电子邮件 ：10 ^-2的交配点悬浮TY链霉素-X GLUC的显示荧光不足的琼脂稀释传真：10 ^-2交配点悬浮TY链霉素，庆大霉素- X-GLUC两级琼脂稀释荧光（光明殖民地对应蓝色菌落，并具有较高的RFP表达大概是由于虽然读从向量序列，其中殖民地经历真正 ​​的盒式交换包含只有立即启动与招标书没有读通过lac启动子载体，这是不存在的。）。

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讨论

该的IMCE技术允许为一个单一的attB两侧LP轨迹以前工程菌的DNA磁带的有效整合。一旦RFP创建捐助盒克隆所需的构造，该技术并不需要随后的DNA纯化和改造，使得它非常健壮。这是至关重要的，包括适当的生长控制，是某些抗生素耐药性是由于建立反稳定整合，而不是其他因素。

IMCE生产效率约0.5％的反式稳定整合。相反，通过同源重组的双重交叉发生在约10 ^-6?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
链霉素	bioshop加拿大公司	STP101
大观	bioshop加拿大公司	SPE201
庆大霉素	bioshop加拿大公司	GTA202
氯霉素	bioshop加拿大公司	CLR201
四环素	bioshop加拿大公司	TET701
卡那霉素	bioshop加拿大公司	KAN201
细菌级琼脂	Bioshop加拿大公司	AGR001
蛋白胨	bioshop加拿大公司	TRP402
酵母提取物	bioshop加拿大公司	YEX401
氯化钠	bioshop加拿大公司	SOD001
氯化钙	bioshop加拿大公司	CCL444
X - GLUC	黄金生物技术公司	G1281C1
大肠杆菌 MT616应变	可要求		也可用于我们的实验室之外
大肠杆菌 pJC2应变	在内部，可以通过请求
大肠杆菌 pJH110应变	在内部，可以通过requesţ
SmUW227应变	在内部，可以通过请求