染色质免疫沉淀（ChIP）使用果蝇组织

摘要

最近高通量测序技术，大大提高了染色质免疫沉淀（ChIP）实验的灵敏度，并促使其使用纯化的细胞或解剖组织的申请。在这里，我们划定使用芯片技术与方法果蝇组织，可以解决在一个特点的生物系统的内源性染色质状态。

摘要

表观遗传学仍然是一个发展迅速的领域，如何染色质状态差，在不同类型的细胞在不同发育阶段的基因表达的研究。表观遗传调控，有利于广泛的生物过程，包括细胞分化的胚胎发育过程中和在成年后的动态平衡。在表观遗传学研究的一个重要战略，是研究各种组蛋白修饰和染色质的因素，如何调节基因的表达。为了解决这个问题，染色质免疫沉淀（ChIP）被广泛使用，以获得与细胞DNA的特定因素的关联的快照。

芯片技术作为起始原料，可在获得丰度和均匀性产生重复性的数据，通常使用的细胞培养。然而，有几个注意事项：首先，在培养皿中生长的细胞环境是从体内不同，因此可能在一个活的有机体，不能反映内源性细胞的染色质状态。其次，并非所有类型的细胞可以体外培养。有只有一个细胞系的数量有限，从中人们可以得到足够的材料芯片检测。

在这里，我们描述的方法做芯片实验用果蝇组织。起始原料是从一个活生生的动物解剖组织，从而能准确反映内源性染色质状态。这种方法有许多不同类型的组织的适应性将允许研究人员解决了很多生物体内 ^1，2的表观遗传调控的有关问题。此方法结合高通量测序技术（ChIP-SEQ），将进一步使研究人员能够获得表观景观。

研究方案

（整个芯片过程大约需要两天。高通量测序芯片库的制备另需2-3天。）

1。解剖，并准备组织芯片实验（约1亿个细胞）

1. 冷PBS + 1蛋白酶抑制剂（溶解在1.5 mL的1X PBS 1蛋白酶抑制剂的鸡尾酒颗粒获得7X原液）在解剖组织的利益（例如果蝇精巢200双）+ PMSF（终浓度为100微克/毫升）。漂洗两次组织和悬浮在200μL与抑制剂的解决方案相同的PBS组织。
2. 要解决的样品，加入5.5μL37％甲醛（在37℃的水浴在使用前1分钟的热烈甲醛）。在37°C孵育15分钟，涡之间，每隔5分钟。
3. 置于冰上2分钟解决的组织样本。冲洗450μLPBS（含蛋白酶抑制剂和PMSF）的2倍。样品现在可以是商店d在-20°C。重复清扫多次获得芯片足够的材料。

2。准备与蛋白质-DNA共轭上清芯片检测

1. 从1.75 mL的Eppendorf管中的1.3步结合足够的样本。
2. 从组织样本PBS。加入裂解液（200微升的50 mM Tris-盐酸，pH值7.6，1毫米氯化钙，0.2％的Triton X-100或NP-40，5毫米丁酸，1X蛋白酶抑制剂的鸡尾酒）。添加新鲜PMSF裂解液（PMSF终浓度为0.5毫米）的股票解决方案。蓝色均质（费舍尔猫＃749521-1590）均质，直到组织没有任何聚集在室温（室温）孵育10分钟，完全游离于。
3. 超声：使用微尖sonicator功率20（Misonix HS-XL200）。在冰上超声为10秒，休息50秒。重复4-5次（应凭经验确定最佳超声时间，超声不再会产生较小的碎片对于华宏反对使用抗体的ChIP。ê修改，我们通常约200-300 bp的超声染色质转录因子或染色质调节（如Polycomb蛋白），我们通常超声200-1000 bp的染色质。然而，最佳片段大小应测试经验。注意：始终保持在ICE，甚至在超声分散，以防止样品加热管！
4. 加入1.8 mL的RIPA缓冲液（稀释样品10毫米的Tris-HCl，pH值7.6，1 mM的EDTA，0.1％SDS，0.1％钠 - 脱氧胆酸，1％的Triton X-100的蛋白酶抑制剂和PMSF，在相同浓度的描述先前）。保存作为输入控制40μL，加入2微升5M NaCl和孵育65°C过夜器（O / N）的逆转交联。
5. 共轭抗体珠，加入40μL蛋白A珠1.5毫升的Eppendorf管中，再加入600μL的PBS和岩石在4°C 2分钟，适用于磁铁珠，上清。加入100μL的PBS和利益的抗体（抗体量应确定empirically）。在室温下孵育1小时或4°C间为4小时。
6. 用磁铁珠上清，加入1ml提取物的染色质从2.4步的珠子。旋转4°CO / N
7. 芯片样品申请磁铁和上清。珠洗，每次10分钟，在以下4个缓冲区°C间：
   RIPA缓冲液1毫升的2倍[1.89毫升的RIPA缓冲液+ 315μL7X蛋白酶抑制剂，20μLPMSF];
   RIPA缓冲液1毫升的2倍与±0.3 M氯化钠1.89毫升RIPA缓冲液220μL，3 M氯化钠;
   用1毫升的LiCl缓冲区（0.25M氯化锂，0.5％NP40，0.5％NaDOC），2倍;
   1X与1毫升的1X TE + 0.2％的Triton X-100;
   1X与1毫升的1X TE。
   
8. 为了扭转交联，珠悬浮在100μLTE缓冲+ 3μL的10％SDS + 5μL蛋白酶K（20毫克/毫升）。在65孵育°CO / N
9. *珠子磁铁申请上清转移到一个新的管。上清包含的DNA样本。洗净与100μL的TE + 0.5米珠NaCl和结合两个上清。
10. 酚 - 氯仿提取DNA样本。加入200μL的苯酚：氯仿：生长素（25:24:1）混合和涡。在室温下5分钟14K旋转。另外，使用Qiagen公司的PCR纯化试剂盒提取DNA可。
11. 转移到一个新的管上清/水层，也可用于线性丙烯酰胺加入到终浓度为20微克/毫升（或者1μL在20毫克/毫升，每1毫升上清糖原，糖原被用于随后的定量PCR或PCR分析，而线性丙烯酰胺用于测序分析。）加入20μL的3M醋酸钠和500μL100％的乙醇。拌匀，孵育80°Ç10分钟。在最大速度旋转，在4°C. 20分钟
12. 除去上清液，用300μL，70％的乙醇。空气干燥，重悬在50μLTE缓冲液样本。样品现在可以保存在-20°C。样品可用于定量PCR（qPCR）检测（ 图1）。

3。分析ED的DNA芯片

3A。使用定量PCR分析DNA芯片-ED

1. 基因组DNA在以下浓度稀释，作出标准曲线：未稀释，1/10，1/100，1/1000，1/5000。
2. 对于每对引物，建立一式两份，一个步骤3A.1，输入控制芯片DNA基因组DNA 96孔板的qPCR：
   10μL的2倍SYBR PCR混合物（Fermentas公司，K0222）;
   1μL，10微米正向引物;
   1μL，10μM的反向引物;
   xμL的DNA芯片（输入控制，或基因组DNA）;
   ŸμL无核酸酶H _{2 O}调整至20μL的反应体积。
   
3. 降速迷你板微调（Labnet）96孔板。
4. 执行的qPCR的ABI 7300实时PCR系统使用以下条件（或其他实时PCR系统）：
   第1阶段：50°C，2分，1个周期
   第2阶段：95°C为10分钟，1个周期;
   第三阶段：95℃1分钟15秒，60°，40°Cycles;
   第四阶段（分解阶段）：95℃15秒，60°C下1分钟，95°15秒ç。
   
5. 检查解离曲线：在热分解图的峰值，表明了从单一PCR反应扩增。多个峰值，表明非特定产品的引物，不应使用qPCR数据。
6. 确定每个引物的PCR反应的指数放大的线性相位，计算公式，解决DNA含量，根据CT（循环阈值）值，这是基于使用稀释的基因组DNA在3A系列标准曲线。 1。
7. 如果Ct值的线性范围内的DNA芯片-ED和输入控制CT值，计算DNA芯片-ED与输入的富集，根据DNA芯片-ED和输入控制在2.4稀释因素。

3B。放大为高通量测序的DNA芯片-ED。

1. 年底修复的DNA组合芯片-ED（使用震中的DNA完修理包），冰上成立：
   1-34μL的基因组DNA的步骤2.12（0.1至5微克）
   5μL10倍完修复缓冲区
   5μL2.5毫米的dNTP混合
   5μL10 mM的ATP
   x微升H _{2 O}调整反应体积49μL
   1μL最终修复酶组合（T4 DNA聚合酶+ T4聚核苷酸激酶）
   在室温45分钟孵育。净化使用Qiagen公司MinElute反应的反应
   清理套件。在30μL洗脱缓冲液（EB），洗脱。
   
2. 3'末端添加一个-出挑：
   30μL洗脱DNA的产品从步骤3b.1
   5μL10X的NEB缓冲＃2
   10微升1毫米的dATP
   2μLDH _{2 O的}
   3μL5 U /μLKlenow片段（3'→5'外切）
   在37°C孵育30分钟净化反应使用MinElute ReactionCleanup套件。洗脱在10μL的EB。
   
3. 公司Solexa链接结扎：
   10μL洗脱DNA的步骤3B.2
   10μLDDH _{2 O的}
   2.5＆亩;升10倍T4 DNA连接酶缓冲
   1μL适配器从Illumina公司（从股票1/10-diluted的寡核苷酸组合）
   2.5μLT4 DNA连接酶（400单位/μL）
   1小时在室温下孵育。净化反应使用MinElute ReactionCleanup套件。洗脱在20μL的EB。样品现在可以保存在-20°C。
4. 运行使用的E-凝胶仪器的步骤3b.3洗脱的DNA样本。凝胶在300-500 bp的条带隔离和净化使用Qiagen公司的胶回收试剂盒（这一步消除〜125 bp的自我结扎连接器，适配器寡结扎）。在12μL的EB洗脱。
   
5. 放大库使用配对末端从Illumina公司（PE）引物：
   10.5微升洗脱DNA的步骤3b.4
   12.5μL的master mix（2X Phusion HF，Finnzymes）
   1 PE1的PCR引物1μL
   1 PE2的PCR引物2μL
   PCR条件：
   ℃30 98°秒
   （98℃10秒，65℃30秒，72°℃30秒），重复20个循环
   72℃5分钟。
   
6. 步骤3b.5样品可以用于芯片SEQ后，选择适当大小的DNA（300-500 bp）的使用标准的2％琼脂糖凝胶。样品现在可以保存在-20°C。最好是在一个单一的凝胶，以防止污染隔离每个芯片样品。可以提交样品的高通量测序。

3C。公司Solexa管道分析

1. Illumina的Genome Analyzer的管道（GA）的25 bp的测序读得到。
2. 所有读取数据对齐的果蝇基因组（DM3）使用伊兰（高效核苷酸数据的地方对准）软件，允许最多两个与参考序列的不匹配。
3. 唯一映射读取被保留用于下游分析。多个相同的读取，最多三份被保留，以减少PCR扩增偏见的可能性。
4. 联大管道输出转换为浏览器扩展的数据文件（床）。
5. 要生成假发文件上传到加州大学圣克鲁兹分校的可视化浏览器，我们用一个python的以股代息已在以前出版³ 4基点，作为窗口的大小和160 bp的DNA片段的大小。
6. 分为沉默和表达的基因的果蝇基因中，我们使用数字量称为RPKM（读取/每碱基合并外显子区域/每百万映射读取）。沉默与RPKM≥1被归类到表达团体，列为低，中，高表达水平的基因可分为三个亚组和基因的基因被列为与RPKM = 0，每个组有大约相同数量的基因。
7. 要比较的组蛋白修饰水平和基因表达，我们用一个Python脚本，已在以前的出版物^3。

4。代表结果

芯片-qPCR的结果，使用BAM的例子（弹子袋）突变睾丸显示在图1 ^4。在BAM睾丸，在过渡增殖的精原细胞分化精^5，6是一个失败。我们使用BAM睾丸未分化的生殖细胞，这是这个组织类型丰富的来源。精子分化所需的分化的基因，如男性特有的转录因子87（mst87F），唐璜（DJ），模糊洋葱（fzo），是不是表示在BAM睾丸。这些基因是高度浓缩的镇压H3K27me3组蛋白修饰（ 图1A），但缺乏积极H3K4me3的组蛋白修饰（ 图1B），染色质的签名，我们称为“单价^”7。 H3K27me3或H3K4me3的任何富集确定一个组成细胞周期蛋白A（CycA）基因表达的正常化。

内容“>的ChIP-seq的分析使用BAM突变睾丸（ 图2）验证qPCR的结果如图1所示。对于三个测试终端分化的基因，DJ和fzo的mst87F的抗体相同的一组（即镇压H3K27me3和H3K4me3的积极）高度富集，他们的基因组区域与H3K27me3但不是H3K4me3的（ 图2A-2C）。相比之下，组成表示CycA基因的H3K4me3的具有显着的，但很少H3K27me3其转录起始位点（TSS），（ 图2D）附近的约束力。

此外，四个班的差异表达基因的转录起始位置跟附近的H3K27me3和H3K4me3的芯片配置文件是每个组蛋白修饰与功能一致。 图3A所示，H3K27me3下游的起始位置跟富集与基因表达水平呈负相关。沉默的基因，而最高的H3K27me3高表达的基因有没有H3K27me3约束力。这些数据对基因表达的H3K27me3压制作用是一致的。相比之下，周围的起始位置跟H3K4me3的富集表明，与对面相关基因的表达水平（ 图3B），对基因表达的H3K4me3的积极作用。

图1。qPCR分析，对镇压H3K27me3组蛋白修饰（A）或积极H3K4me3的组蛋白修饰（B）在未分化的细胞富集BAM突变睾丸抗体的DNA芯片-ED。 （一）在BAM睾丸分化的基因（Mst87F DJ，fzo）的富集与H3K27me3镇压组蛋白修饰。 （二）分化的基因被耗尽H3K4me3的积极标志。第一级别的靶基因（Mst87F，DJ或fzo的 ）DNA芯片（芯片的DNA /输入）正常化的利 EL的在芯片控制CycA基因的DNA。误差棒表示标准偏差由三个独立的生物复制。

图2。 UCSC基因组浏览器H3K27me3快照和H3K4me3的跨越（一）Mst87F（二）DJ和（三），（四）fzo CycA基因。（d）中盘旋H3K27me3富集地区的整个基因组区域的浓缩反映了染色质状态重叠基因CG7264，这是弱旅巴姆表示睾丸（RPKM = 1），但高表达野生型的睾丸（RPKM = ^{130）8（SEQ}芯片数据从^7）。定量PCR图1芯片结果的分析中使用的探针标记在每个小区的底部。 点击这里查看大图 。

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图3。芯片SEQ配置使用BAM H3K27me3及H3K4me3的睾丸 ^7。四个基因组（7509个基因）进行分类，根据他们的基因表达水平，基于RNA-seq的结果^8。绘制基因的代表类的特定组蛋白修饰的富集，从3KB上游3KB下游的转录起始位点（起始位置跟）使用序列。这会产生一个丰富 ​​的（一）的H3K27me3（K27次）和（乙）H3K4me3的（K4），各组SEQ芯片分析。的个人资料点击这里查看大图 。

讨论

本议定书中所讨论的芯片分析的通用性，可用于在不同的组织，它提供了一个机会，在生物相关系统研究染色质状态。芯片实验中使用的细胞培养系统是方便执行，因为可以很容易地获得大量的细胞。然而，培养的细胞并不一定反映在多细胞环境中的细胞。通过使用活的动物解剖组织开发这一技术，我们可以解决许多问题，培养的细胞不能。

尽管本协议的有效性，有几个注?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
完成迷你蛋白酶抑制剂的鸡尾酒	罗氏公司	11836153001
甲醛（37％）	Supelco公司	47083 - U
PMSF	西格玛	78830
kontes颗粒杵	菲舍尔科学	K749521-1590
PCR纯化试剂盒	Qiagen公司	28104
线性聚丙烯酰胺	西格玛	56575-1ML
糖原	Qiagen公司	158930
SYBR绿色/红霉素定量PCR预混	Fermentas公司	K0223
迷你板微调	labnet	Z723533
实时定量PCR系统	应用生物系统	4351101
体积小，超声波处理器	misonix	HS-XL2000	型号停产
磁珠，蛋白A	Invitrogen公司	100-01D
Dynamag磁铁	Invitrogen公司	123-21D
酚：氯仿：生长素	Invitrogen公司	15593-049
震中的DNA完修理包	震中生物技术	ER0720
MinElute Reactio列印清理套件	Qiagen公司	28204
Klenow片段（3'→5'外切）	New England Biolabs公司	M0212S
T4 DNA连接酶	Promega公司	M1794
适配器寡核苷酸	Illumina公司	PE-400-1001
配对末端引物1.0和2.0	Illumina公司	1001783 1001 784
电子凝胶Electorphoresis系统	Invitrogen公司	G6512ST
2X Phusion高频Mastermix	finnzymes	架F-531