配对末端标签测序（嘉PET）测绘染色质相互作用和了解转录调控染色质相互作用分析

摘要

配对末端标签测序（嘉PET）的染色质相互作用分析方法是从头染色质相互作用的检测，为更好地理解转录调控。

摘要

基因组被组织成三维结构，采用高阶构内^，2，12微米大小的核空间。这样的架构是不是随机的，涉及¹³基因启动子调控元件之间的相互作用。具体的调控序列的转录因子结合，带来了网络的转录调控和协调^1，14。

配对末端标签测序（嘉PET）的染色质相互作用分析，以确定这些高阶染色质结构^5,6。细胞是固定的，相互作用的位点是由共价DNA-蛋白质交联抓获。为了尽量减少非特异性噪声和降低复杂性，以及增加特异性染色质相互作用分析，染色质免疫沉淀（ChIP）是用来对付特定的蛋白质因子丰富接近结扎前的染色体片段的利益。随后结扎涉及半交联剂对一起拴在个别染色质复合物的DNA片段之间形成的共价链接。的侧翼MmeI，限制在一半交联剂酶切位点，允许提取配对结束后MmeI消化标记链接标记构造（PETS）。作为交联剂一半是生物素，这些PET结构采用链霉亲和磁珠纯化。纯化的宠物结扎与新一代测序适配器和通过下一代，如Illumina的Genome Analyzer的时序产生相互作用的片段目录。映射和生物信息学分析，然后进行识别芯片浓缩铀的结合位点和芯片丰富的染色质相互作用^8。

我们已经制作了一个视频演示，CHIA-PET的协议，特别是芯片制备的关键方面，由于芯片的质量起到了重要作用，在的嘉PET库结果。由于协议很长的，唯一的关键步骤是在视频显示。

研究方案

答：染色质免疫沉淀（ChIP）（ 见图1）

1。双交联染色质结合蛋白和细胞收获

（视频02:10）

染色质免疫沉淀（ChIP）是参与建设嘉PET库的第一个关键步骤。这一步很重要，以减少复杂，背景噪声水平，并添加特异性。编制的芯片将需要的细胞类型和兴趣的因素进行了优化。该协议是基于RNA聚合酶II CHIA-PET MCF-7细胞在我们的实验室建造⁹备库。由此产生的库，以确保足够的复杂性，我们建议使用1×10 ^8个细胞的芯片材料准备。根据目标和细胞株，获得的产量是100毫微克至300毫微克之间。我们建议，应使用至少100纳克芯片合作少于20个PCR循环操作指示1嘉义PET库，以尽量减少在测序过程中的冗余。芯片材料的较高数额将允许进一​​步减少冗余，提高图书馆的质量。

1. 1×10 ⁸ MCF-7细胞（相当于5 500厘米² 2×10 ⁷细胞的方板）用磷酸盐清洗两次缓冲液（PBS）前预热，在37°C。
2. 新鲜制备交联的MCF-7细胞1.5毫米EthylGlycol二（SuccinimidylSuccinate）（EGS的））为45分钟，在室温（22℃），在化学通风柜旋转。
3. 在化学通风柜旋转20分钟，在室温（22℃），加入37％甲醛终浓度为1％。

4. 解渴由2 M甘氨酸添加到终浓度为200毫米的交联剂。在室温下孵育10分钟（22℃）旋转。

5. 丢弃废物烧瓶淬火交联剂，用冷PBS洗细胞两次。
6. 刮丢弃PBS和收获细胞。收获细胞置于冰上。冲洗板5毫升PBS（蛋白酶抑制剂（“有价证券”）根据制造商的指示），以最大限度地收集细胞。
7. 10分钟沉淀细胞在1800 XG（3000转）在4°C。弃上清，并进行细胞裂解。另外，颗粒储存在-80°C。

2。细胞裂解

（视频04:15）

1. 重悬浮颗粒在15毫升0.1％SDS裂解液彻底移液器（50毫米肝素钠pH7.5的，150 mM氯化钠，1 mM的EDTA，1％的Triton X-100，0.1％去氧胆酸钠，0.1％SDS +有价证券）。旋转15分钟，在4°C
2. 颗粒裂解细胞在800 xG为10分钟（2,000 RPM）在4°C。
3. 弃上清，重复一次细胞裂解每步2.1和2.2。
4. 核球是孤立的核裂解准备。另外，存储颗粒在-80°C。

3。核裂解

（五时00视频）

进行核裂解释放之前交联染色质碎片。在核膜的情况下，交联染色可以使用温和的条件下超声。有时，超声强度可能不足以打破了在这种情况下，核膜，染色质少获得，因为完整的细胞核，将离心后丢弃。然而，不同类型的细胞，可能需要不同的条件。

1. 重悬孤立核颗粒在15毫升1％SDS裂解缓冲液（pH7.5的肝素钠50毫米，150毫米氯化钠，1 mM的EDTA，1％的Triton X-100，0.1％钠Deoxycholate，1％的SDS + PI）的。转移的细胞核悬浮液高速离心管（橡树岭离心管（聚丙烯））和旋转15分钟，在4°C
2. 颗粒裂解核颗粒在4°C 30分钟XG（20000转47810）
3. 倒出上清和休息颗粒与P1000枪头。
4. 与30毫升0.1％SDS裂解液（PI）的颗粒洗。
5. 旋转15分钟，在4°C
6. 在4°C颗粒染色30分钟，在47810 XG（20000转）
7. 弃上清，重复洗一次，然后再进行染色质碎片，每步3.4至3.6。另外，商店染色质颗粒在-80°C。

4。破碎的染色质

（视频07:03）

1. 染色质颗粒转移至14毫升聚苯乙烯圆底试管。
2. 加入1毫升0.1％SDS裂解液（PI）的染色质PEllet。确保混合物中有没有泡沫，因为这会影响超声效率。
3. 剪切染色质DNA的200至600个碱基对大小，数字Sonifer 1布兰森细胞破碎仪（幅度35％，9分钟（30秒，30秒关闭）），并保持在所有时间样本冷过热，以防止执行在寒冷的房间超声（ 见图2）。
4. 反向交联染色等分以下步骤检查破碎效率。（以下步骤显示在视频）。
   • 超声染色后分装10μL。
   • 离心机超声染色5分钟，在4°C，16,110 XG（13,200 RPM）
   • 将上清转移到一个新的管，加2μL蛋白酶K溶液。
   • 孵育30分钟，在50°C。
   • 解决反向交联1.5％琼脂糖凝胶染色。
   • repeaţ超声DNA的大小，如果大于预期。
5. 离心16,110 XG（13,200 RPM）剩余裂解为30分钟，在4°C和转移到一个新的管超声磁珠preclearing前染色（上清）。另外，商店超声在-80°C，直到收集足够的染色质的染色启动芯片。

5。洗衣机，Preclearing和抗体涂层珠

（视频08:17）

1. Preclearing染色质
   1. 使用一个IP为300μL磁性G蛋白珠。
   2. 三次洗珠子5毫升珠清洗缓冲液（PBS，0.1％的Triton X-100）。这和未来的洗涤涉及磁G蛋白珠包括以下步骤。确保磁珠不会干出。
      • 回收珠使用磁粉集中的。
      • ðiscard上清。
      • 用缓冲液重悬珠。
      • 旋转5分钟，在4°C
      • 129 XG（800转）离心1分钟，4°C。
      • 回收珠使用磁粉集中的。
      • 弃上清。
   3. 预洗珠结合超声波处理的染色质，染色质结合珠去除背景。
      • 保持10μL超声波处理染色质，定量PCR（qPCR）随后富集支票作为“输入”。保存于4°C。
   4. 旋转一夜之间在4°C。
   5. 离心机超声染色1分钟，在4°C，在129 XG（800转）
   6. 放置磁粉集中管。
2. 涂层抗体磁珠
   1. 磁G蛋白珠到一个新的管分装300μL。
   2. 洗珠子三次用5ml珠洗涤缓冲液（PBS，0.1％的Triton X-100）。
   3. 珠洗涤缓冲液中加入同等体积（5.1.3步）。
   4. 添加35微克的RNA聚合酶II（8WG16）单克隆抗体。
   5. 旋转一夜之间在4°C。
   6. 用5毫升珠洗涤缓冲液洗抗体磁珠两次。
   7. 回收使用磁粉浓缩的抗体磁珠。

6。染色质免疫沉淀

（视频10:03）

为了减少复杂性和背景噪音的水平，针对特定的蛋白质因子的抗体被用来充实接近结扎前⁶感兴趣的特定染色体片段。

在这里，我们用鼠标RNA聚合酶II的单克隆抗体（8WG16）承认的蛋白质的起始形式。通过丰富的DNA片段与RNA聚合酶II，可以增加库的特异性，让远距离之间的积极推动者和其相应的监管区域的染色质相互作用的鉴定。

1. 放弃抗体磁珠磁性粒子集中的帮助下洗缓冲区。
2. 转移超声染色（步骤5.1.6上清），帮助的磁粉集中的抗体包被珠（从步骤5.2.7）。
3. 旋转一夜之间在4°C。

7。免疫沉淀的DNA-蛋白质复合物的洗涤和洗脱

（视频11:13）

1. 染色质免疫沉淀珠洗3次，5毫升0.1％SDS裂解液。
2. 一次用5毫升高盐洗涤缓冲液（50 mM的肝素钠pH值7.5洗珠，350 mM氯化钠，1 mM的EDTA，1％剂Triton X-100，0.1％去氧胆酸钠，0.1％SDS）。
3. 洗一次用5毫升的氯化锂洗涤缓冲液（10毫米的Tris pH值8.0，氯化锂250毫米，1毫米EDTA，0.5％Nonidet的P-40，0.5％的脱氧胆酸钠）珠。
4. 放弃用TE缓冲液1毫升缓冲和重悬水洗珠。
5. 旋转5分钟，在4°C样品定量和芯片富集检查的准备。一旦已经收集了足够的芯片材料，样品将到嘉义PET库的构建。这一步是至关重要的，必须采取措施来确保成功CHIA-PET图书馆建设。可存储芯片丰富的珠长达2个星期在4°C间同时进行定量，芯片富集检查，并积累足够的物质。
   1. 洗脱和反向交联“输入”DNA和富芯片珠以下步骤（以下步骤在视频显示。）
      • 与200μL芯片洗脱缓冲液的50 mM Tris pH值8.0，10 mM的EDTA，1％的SDS洗脱20％芯片富集珠的。 30分钟旋转37°C。离心1分钟洗脱珠6,100 XG（800转）在4°C。转移洗脱芯片到一个新的管配合的磁粉集中的帮助下（上清）。
      • 芯片反向交联“输入”和洗脱复合物2μL蛋白酶K（终浓度为0.2克/毫升），2小时，在50°C。
      • 转让扭转交联的DNA“输入”和洗脱芯片DNA到2毫升MaXtract高密度（分别）。加入200μL25:24:1酚 - 氯仿 - 异戊醇的pH值7.9在化学通风柜管和反转拌匀。 16,110 XG（13,200 RPM）在室温下5分钟旋转管。
      • 上层水相转移到一个新的管和沉淀扭转交联DNA的机智H 20μL3个M醋酸钠pH值5.5，200μL异丙醇和1μL15毫克/毫升Glycoblue的的。 16,110 XG（13,200 RPM）为30分钟，在4°C，在-80℃孵育30分钟，沉淀的DNA
      • 异丙醇沉淀DNA离心后，用75％冰冷乙醇洗DNA沉淀两次，20μLTE缓冲液重悬DNA沉淀。
   2. 定量DNA的“输入”（从步骤5.1.3）picogreen检测¹⁰和芯片DNA。
   3. 通过定性PCR（定量PCR）执行富集检查。

B.染色质相互作用分析用配对末端标签测序（嘉义PET）

下半年将突出的视频在的嘉PET库建设的关键步骤。

1。最终钝化芯片的DNA片段

本章的视频突出两个中号泉点，一洗磁珠去除酶和缓冲盐前反应（1.1步，12:22至12:54）视频和设立酶促反应过程的分步过程，涉及磁珠在反应混合物（步骤1.2，视频12:54至13:25）。

1. 冰冷的TE缓冲液洗一次芯片丰富的珠。这和未来的洗涤磁珠包括以下步骤。
   • 离心1分钟，6,100 XG（800转），在4°C。
   • 回收珠使用磁粉集中的。
   • 弃上清。
   • 添加缓冲区珠。
   • 与缓冲混合通过轻弹行动珠。
   • 离心1分钟，6,100 XG（800转），在4°C。
   • 回收珠使用磁粉集中的。
   • 弃上清。
2. 为了填补声振overha农工商，准备与70μLT4 DNA聚合酶，7μL10 mM的dNTPs浓度和615.8μL无核酸酶水10 x缓冲器的主结构。调匀，与主混合悬浮水洗珠。加入7.2微升9.7 U /μLT4 DNA聚合酶的终体积700μL。混合和孵育40分钟在37°旋转℃（使用百利高生物智能混频器RM-2L，按F8，30转U = 50，U = 60）。以下步骤执行所有后续的酶反应。
   • 无核酸酶水稀释反应缓冲区。
   • 所有其他试剂（酶除外）加入稀释缓冲。
   • 调匀。悬浮与珠/颗粒反应混合物。
   • 添加酶悬浮珠/颗粒（保持在任何时候都台式保温箱，以确保最大的酶的活性的酶）。
   • 用封口膜封管。
   • 确保珠以及整个incubatio混合N。
3. 丢弃反应混合物，洗去剩余的缓冲盐类和酶三次与冰冷的洗涤缓冲液（10毫米的Tris-Cl的pH值7.5，1 mM的EDTA，500 mM氯化钠）。

2。结扎芯片DNA生物素半交联剂

本章的视频突出CHIA-PET的建设和使用的核苷酸条码组成，区分非特异性和特异性结扎产品（13:28至14:24）中所使用的半连接器的寡核苷酸的特点视频）。本章还显示循序渐进的方式逐步设立半连接器连接反应（2.2步，14:24至15:54）视频程序。

两种类型的生物素半交联剂介绍，在此协议，并设计有四种核苷酸（TAAG或ATGT）内部条码识别位点和类型IIS的限制的酶MmeI（TCCAAC）。在芯片丰富MENT，超声染色质片段同样被划分成两个等份，并首先与过量或者半连接器A或半连接器乙^5,9结扎。

1. 分为两等份DNA的半连接器结扎生物素半连接器或半交联剂B分别芯片丰富的珠子。这两个半交联剂具有相同的核苷酸序列，除了四个服务（半连接器一个与TAAG;的一半交联剂ATGT乙）在中间的核苷酸，核苷酸条码。当在接近结扎，随机与两个不同的芯片配合物的非特异性结扎结合，可以从人口与异AB连接器的序列确定，与二聚体AA或BB连接器，可从序列的人口确定具体结扎相比。
2. 结扎芯片富集珠140μL5×T4 DNA与PEG连接酶缓冲液，3.5μL，200 ng /μl的生物素标记的半连接器A或B，553.5μL核酸自由水和3μL30 U /μLT4 DNA连接酶（T4 DNA连接酶连接酶是不稳定甚至冰台式保温箱在任何时候都保持）。用封口膜封管和孵育过夜，在16°旋转Ç。

3。芯片的DNA片段的洗脱和接近结扎

本章的视频解释说，在珠质复合物洗脱缓冲EB，SDS和Triton X-100的作用，也显示了设立函证反应（3.9步，15:54分步过程17:10视频）。

结扎半连接器的染色质片段后，这两个分数相结合，洗脱珠。相互作用的DNA片段，然后将一个完整的连接器序列连接在靠近结扎。

使用核苷酸条码组成，序列可分为三类，即序列无线日异AB连接器（的条码ATGT / TAAG）和二聚体AA或BB连接器（条码TAAG /的TAAG或ATGT / ATGT）来区分非特异性和特异性结扎产品，分别为⁹序列。

因此，允许使用不同的核苷酸条码的两个半连接器规格不同的实验，或重复，以及非特异性嵌合体之间不同的芯片配合物⁵结扎率监测。

1. 半连接器结扎珠洗三次与冰冷的洗涤缓冲液（10毫米的Tris-Cl的pH值7.5，1 mM的EDTA，500 mM氯化钠）。
2. 以下列方式结合两个半连接器结扎珠管。
   • 半连接器结扎使用磁粉集中的珠管回收（“一管”）。
   • 保持半连接器结扎冰珠（“B管”）的其他管。
   • 丢弃清洗液（3.2.1步）fROM管和半连接器结扎珠（从步骤3.2.2）从B管转移到管一管时，仍是上磁粉收藏家。
   • 加入700μL冰冷的洗涤缓冲液管B收取任何剩余的半连接器结扎珠，并确保两个半连接器结扎珠管结合。转移到管答：洗涤缓冲丢弃的空管B.
3. 半连接器结扎珠70μL10×T4 DNA连接酶缓冲液（NEB），616μL无核酸酶的水和14μL10 U /μlT4 DNA多聚核苷酸激酶的磷酸化。旋转在37°C孵育50分钟。
4. 回收磷酸半连接器结扎珠使用磁性粒子集中和丢弃反应混合。
5. 200μL新鲜配制的洗脱液（TE缓冲液，1％SDS）洗脱半连接器结扎染色质DNA复杂。孵育30分钟，在室温下（22°C）与旋转。
6. 转移到一个新的管洗脱液冲洗珠与900μL缓冲的EB。将上清转移到同一管相结合的洗脱。
7. 收集洗脱液转移到两个离心管过滤器和16,110 XG（13,200 RPM）离心1分钟，在室温（22℃）的过滤杯。
8. 加入90μL20％的Triton X-100隔离SDS和反转拌匀。在37°C孵育1小时
9. 函证是极稀的条件下进行，以有利于个人交联染色质复合物内结扎活动，同时尽量减少不同的染色质复合物，这会引起不良的嵌合DNA分子之间结扎事件。冰工作，淬火洗脱液转移到50毫升猎鹰管，并加入7776μL无核酸酶水，1000μL10×T4 DNA连接酶缓冲液（NEB），33.33μL，30 U /μLT4 DNA连接酶。在16孵育过夜°C。

4。逆向交联和DNA纯化

本章的视频显示苯酚一步一步的过程：氯仿抽提（步骤4.3，17:11至17:59），在4.4步离心后沉淀DNA特写。

1. 反向交联和降解蛋白加入100μL20 mg / ml的蛋白酶K的解决方案。在50°C孵育2小时
2. 染色质DNA转入50毫升MaXtract的高密度和添加9毫升无核酸酶水19毫升，以获得最终成交量。
3. 加入19毫升25:24:1酚 - 氯仿 - 异戊醇的pH值7.9在化学通风柜管和反转拌匀。自旋为5分钟，在室温下（3000转）在1800 XG管。
4. 上层水相转移到50毫升橡树岭离心管（铁氟龙FEP）的和沉淀物的染色质DNA与1.9毫升3个M醋酸钠pH值5.5，19毫升isopropanOL和5μLGlycoblue。 glycoblue添加沉淀以提高能见度。
5. 在-80°C孵育至少一个小时。允许冷冻解冻的解决方案，在4°C离心30分钟前，在38,720 XG（18000转）
6. 异丙醇沉淀DNA离心后，用75％冰冷乙醇洗DNA沉淀两次，重悬DNA沉淀在34μL缓冲的EB。 DNA混合物转移到1.7毫升的基因LoBind管的。
7. 重悬DNA沉淀在34μL缓冲的EB。
8. （核糖核酸酶处理是可选的服务，为随后的清洗和纯化步骤在嘉PET协议，消除污染的RNA和从我们的内部图书馆嘉义PET序列的人工检查显示没有污染RNA的痕迹）。
   • 履行加入一核糖核酸酶10μL10×反应缓冲液，55μL无核酸酶水和1μL，10 U /μLRNase的一核糖核酸酶消化。在37°C的一个小时。
   • 转移到染色质DNA 2毫升MaXtract的高密度。加入100μL25:24:1酚 - 氯仿 - 异戊醇的pH值7.9在化学通风柜管和反转拌匀。 XG在室温（22℃）16,110（13,200 RPM）管旋转5分钟。
   • 上层水相转移到一个新的管和沉淀反向交联的DNA与10微升3个M醋酸钠pH值5.5和100μl异丙醇。 16,110 XG（13,200 RPM）为30分钟，在4°C，在-80℃孵育30分钟，沉淀的DNA
   • 异丙醇沉淀DNA离心后，用冰冷的75％的乙醇，DNA沉淀两次，重悬DNA沉淀在34μL缓冲的EB。

5。固定CHIA-PET的DNA链亲和素磁珠

引进约的存在本章会谈在MmeI识别网站和目前在半链接寡核苷酸标记链接标记结构（“宠物”，18时02分至19:10）的视频，以便提取的生物素牛逼。此外，本章视频也给出了5.2步骤，循序渐进的方式，步骤程序设立PCR反应（6.1步，19时10分至20:00）的视频和切除成功快速的总体看法CHIA-PET的DNA（6.9步，20:00至20:30）。

半连接器A和B包含MmeI识别位点侧翼，使这种类型的IIS限制性内切酶切割18/20个碱基对，他们的目标结合位点下游产生短的染色体片段的“标签”，生产配对标记链接标记结构（“宠物”）。

为了使净化PET的结构，链亲和素磁珠，两个半交联剂A和B与生物素修饰，CHIA-PET的结构允许捕捉和净化。

1. 释放C嘉PET aptured DNA加入5μL10 x NEBuffer 4，5μL新鲜配制的500微米（10×）S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和1微升2ü/μLMmeI的再悬浮的DNA。淬火可以通过添加5μL非生物素半交联剂反应混合MmeI的过剩MmeI自我抑制过剩。在37°C孵育2小时
2. 为了捕捉嘉PET公布再悬浮的M-280链霉亲和素磁珠的DNA，转移50μL的DNA LoBind管。两次洗珠2个绑定和洗涤缓冲液（2 x B＆W的：10毫米的Tris-HCl pH值7.5，1 mM的EDTA，2 M氯化钠）。在50μL2×B＆W缓冲液重悬珠和混合消化50μL（5.1步）转移到同一管内。拌匀，静置45分钟，在室温旋转。
3. 使用磁粉浓缩回收珠，弃上清。洗珠与150μL1×绑定和洗涤缓冲液（1×B＆W的5毫米的Tris-HCl pH值7.5，0.5 mM的EDTA，1 M氯化钠）的两倍。
4. 结扎454 GS20适配器与CHIA-PET的5μL10×T4 DNA连接酶缓冲液（请注意，在这一步中使用的连接酶缓冲液是从步骤3.9不同的DNA连接酶缓冲液，在这一步是因为这其中，来自同一公司供应的T4 DNA连接酶），4μL200 ng /μl的454 GS20适配器，4μL的200 ng /μl的454 GS20适配器乙，36μL无核酸酶的水和1μL30 U /μLT4 DNA连接酶。在16℃孵育过夜旋转。嘉PET DNA也被结扎与Illumina公司的神经网络适配器，在这种情况下，我们建议扩增使用引物从Illumina公司购买的PE1.0和PCR引物PE 2.0的库。
5. 使用磁粉浓缩回收珠，弃上清。三次与150μL1 x的B＆W缓冲液洗珠。
6. 尼克翻译CHIA-PET的DNA与5μL10 x NEBuffer 2，2.5μL10 mM的dNTPs浓度，38.5μL无核酸酶水和4μL10 U /μL大肠杆菌DNA聚合酶一孵育过夜室温（22℃）旋转。
7. 使用磁粉浓缩回收珠，弃上清。三次与150μL1 x的B＆W缓冲液洗珠。
8. 重悬于50μL缓冲的EB珠。

6。嘉PET DNA扩增

1. 建立PCR反应与2μL珠悬架，21μL的核酸游离水，1μL10μM的Illumina的1-454底漆，1μL10μM的Illumina的2-454引物和25μLPhusion高保真预混。
2. 周期要产生足够的PCR产物进行测序，以确定数量，设立了16，18和20个周期的三个测试PCR反应。库的复杂性非​​常低，这样做这样的结果，因为我们已经找到了，不超过20个周期。

初始步骤	30秒	98℃。	（变性）
18日至25次	10秒后	98℃。	（变性）
	30秒	65℃	（退火）
	30秒	72℃	（分机）
最后一步	5分钟	72℃	（最后一次延长）

3. 通过运行在4-20％的梯度TBE凝胶和SYBR Green I荧光染色PCR反应，确保存在一个带223个碱基对，这是嘉PET DNA的长度，确定尽可能低的周期数。
4. 其余嘉PET在大型PCR的DNA结合链霉珠用尽可能少的PCR循环扩增，测序，同时还获得了足够的产量。
5. 重新所有PCR反应，用磁性粒子浓缩池上清液两个新鲜的DNA LoBind管索赔珠。加入60微升3个M醋酸钠，2μLGlycoBlue和600μL异丙醇汇集反应沉淀每个管上清。
6. 在-80°C孵育30分钟。在4°C离心30分钟16,110 XG（13,200 RPM）
7. 异丙醇沉淀DNA，洗DNA沉淀后离心，用冰冷的75％乙醇的两倍，并在DNA沉淀重悬于100μLTE缓冲液5μL6×上样染料。
8. 均匀地分布到6％TBE凝胶井PCR产物。在35分钟的200至五运行在1×TBE缓冲液凝胶和染色的SYBR Green一，可视化与黑暗读者透射凝胶。
9. 仔细消费的223 bp的条带从凝胶和执行“凝胶粉碎”DNA的提取如下协议：
   • 将在0.6毫升的MicroC切除凝胶碎片entrifuge底部已与21-G的针管刺穿。
   • 放置5分钟，每管内1.5毫升螺丝帽管和离心机在16,110 XG（13,200 RPM）在4°C
   • 每管加入200μLTE缓冲液pH值8.0，并确保凝胶块完全沉浸在缓冲区。
   • 在-80℃冻结了一个小时，在37℃过夜孵育。
   • 转让凝胶块，连同在每个管的缓冲区，在4°C离心管过滤器和离心机在16,110 XG（13,200 RPM）为10分钟，过滤杯
   • 200μLTE缓冲液pH值8.0和转移漂洗缓冲每个第一自旋完成后的过滤装置，冲洗管每次1.5毫升。
   • 过滤池，通过异丙醇沉淀。
   • 15μLTE缓冲液重悬DNA沉淀。

7。质量检查一个嘉PET的DNA扩增ð

1. 继续使用安捷伦DNA 1000检测或安捷伦高灵敏度DNA检测安捷伦生物分析仪2100的质量检查。
2. 安捷伦DNA检测的电泳显示，沿着平坦的基线进行Illumina的Genome Analyzer的IIx的测序之前，只有一个高峰。
3. Illumina的Genome Analyzer的IIx的测序之前，CHIA-PET的DNA应该有一个10纳米的最低浓度。执行4点定量PCR根据Illumina的定量PCR定量议定书指南，以确定样本量加载到流细胞。另外，执行如下所示的单点的定量PCR：
   • 控制模板稀释100分，10分和下午1时。在Illumina的定量PCR定量议定书“中所述，控制模板被定义为测序Illumina平台上编写任何库，它应该尽可能类似的条款模板的大小，GC含量和库类型。
   • 淡化嘉PET DNA到晚上10点。
   • 建立PCR每个稀释一式三份与0.1μL定量PCR引物1.1 0.1 2.1μL定量PCR引物，5μLLightCycler480基因的SYBR Green I主混音，3.8μL无核酸酶水和1μL模板，罗氏应用科学部的LightCycler 480实时PCR反应体系。包括两个阴性对照组为模板1μL无核酸酶水。
     • 初始变性
       • 95℃5分钟4.8°C / S
     • 放大
       • 95℃10秒4.8°C / S
       • 60℃1分钟2.5°C /秒
       • 72℃30秒4.8°C间/ S
     • 熔解曲线
       • 95℃5秒4.8°C / S
       • 65℃1分钟2.5°C /秒
       • 95°C的收购每°C
     • 冷却
       • 40℃10秒2.0°C /秒
   • 确保阴性对照显示无扩增，Ct值的标准偏差小于0.1之前计算基于从控制模板稀释产生的标准曲线库的模板浓度。
4. Illumina的流动细胞表面上的集群生成加载下午1时05分诠释ØIllumina的CBOT集群发电系统，根据屏幕上的说明。
5. 进行序列CHIA-PET Illumina的Genome Analyzer的IIx能3-454 Illumina的测序引物和4-454 Illumina的测序引物的DNA，用一条单线库质量。剩余CHIA-PET的DNA存放于-20°C如果库具有良好的数据，准备样品，需要样品车道结果的基础上，取得18日至20万元的独特读取4至8车道的额外运行。
   • 对流动细胞装入CHIA-PET的DNA量在很大程度上取决于对测序数据分析软件，Illumina的测序控制工作室的版本。 2.9版本，读取装载的浓度范围从三分之一到每瓦，相当于约21万通滤波的最大容量的一半，约9.5万读取宠物。
   • 减少负荷是必要的，以确保正确的基础上调用f或连接器的条形码序列。这个错误发生时，一批类似的核苷酸序列，是的情况下，如果连接器测序，获得条码信息。如果不理想的条码信息，连接器都没有看过，然后可用于满负荷浓度。
6. 由的离线基地来电qSeq转换后的文件可以进一步分析，根据嘉PET工具安装手册（4.1版^）8，使用的嘉PET的工具。

C.代表CHIA-PET的结果

我们成功构建了嘉PET库使用672纳克的芯片材料，如上所述，使用RNA聚合酶II抗体（8WG16）在MCF-7细胞（CHM160和^{CHM163）9。}初步诊断凝胶运行库PCR扩增，CHIA-PET的协议“第6.2步中提到的，显示出明亮的和明确的乐队所有PCR循环使用（ 见图4）的223个碱基对的预期大小。

16个PCR循环使用，以放大嘉PET的库和获得的总收率17.1纳克。安捷伦DNA 1000分析通过观察一个单一的，激烈的电泳峰嘉PET协议（ 见图5）7.1步中提到的在223个碱基对的预期大小。

图1。芯片概述。MCF-7细胞是双二EthylGlycol（SuccinimidylSuccinate（EGS的）和甲醛顺序在空间相邻的染色质之间的共价链接，交联，交联的染色质是从固定的MCF-7细胞获得细胞裂解和染色质核裂解。然后碎片到200-600个碱基对的尺寸范围。经过预结算声振与Protei的染色质N G磁珠，以消除非特异性DNA，清除预染色一夜之间捕获感兴趣的染色质免疫沉淀抗体涂层珠。

图2。超声波处理的染色质片段凝胶电泳分析。一个100 bp的DNA梯状条带，显示在第一个和最后一个车道大小的参考。超声波处理染色显示200至600基点之间的强度强，是理想的捕捉远距离的染色质相互作用。

图3。 CHIA-PET的概述。零碎的染色体片段，最终减弱和结扎生物素半含侧翼MmeI限制网站的链接器。完整的染色质复合物，然后关闭珠洗脱接近结扎受到极稀的条件下，这样相互作用的DNA片段县erentially结扎到另一个。交联后反向删除相关的DNA-蛋白质进行了，MmeI消化释放标记链接标记（PET）的结构，然后再由选择性结合链亲和素磁珠纯化。 PET的结构结扎与高通量测序适配器。

图4。嘉PETS PCR扩增后的电泳分析 25 bp的DNA梯状巷1号和5所示大小的参考。 2至4车道16日之后产生的PCR产物，18和2μL珠固定的模板，分别PCR扩增20个循环。这是一个成功的图书馆，由明亮的，定义良好的，预计规模在223 bp的带。产生的非特异性涂片时，PCR循环数的增加，而最低的乐队，每个PCR反应引物二聚体。

图5。安捷伦2100生物分析仪分析纯化安捷伦2100生物分析仪分析一个成功的图书馆，一个单一的223 bp的预期大小的激烈高峰电泳Illumina公司-454适配器连接上佳的宠物。屏幕捕获。需要注意的是安捷伦生物分析仪检测通常报告略微高于市场预期的大小，在这种情况下，期望的峰值在237基点，而不是223 bp的显示。这是安捷伦检测10％的误差范围内。

讨论

CHIA-PET是开发，以确定转录调控中的长程相互作用的方法。确定的嘉PET库质量的关键因素之一是芯片材料的质量。

在视频显示的协议，采用交叉连接细胞（EGS）和甲醛的使用。交联的第二个轴承较长的间隔臂的试剂结合使用甲醛，可能有助于蛋白质不能甲醛的约束，仅^3,11,15约束力。我们已经构建库，此方法已显示出强大的结合位点和长程相互作用^9。然而，交联和芯片的条件应为每个感兴趣的因素优化，重要的是不要过度的交联，作为交联太多会导致碎片中的困难，通过超声，并可能导致虚假的染色质相互作用。染色质相互作用应当验证由不同的方法，如荧光原位杂交^4，由嘉义PET标识。

我们建议至少100吴质材料。虽然我们已经构建从50吴质材料质量好的库，我们已经指出，允许起始原料的大量嘉PET少于16个PCR循环，从而最大限度地减少每个库的扩增和冗余库建设。这种较低的冗余与较高的独特的映射标签和高比例的可用数据，从而使染色体的测序较少的车道更全面的互动地图。最终每管装珠量应该是50μL和100μL的磁场和琼脂糖珠分别。如果包装珠体积小于说，同样预先清除空白磁或琼脂糖珠的最小包装量，以尽量减少损失的DNA-轴承珠S在随后的步骤。个子矮的小技巧大核心提示应使用移液琼脂糖珠。

继先前公布的CHIA-PET的协议被纳入下列修改。首先，磁性Ğ珠被用来在清洗，以尽量减少样品的损失。此外，我们发现非特异性条带，大小约100个​​基点和138基点，是自我结扎半连接器或/和适配器的扩增。因此，我们减少生物素的一半，连接器和454 GS20适配器，以尽量减少非特异性条带，PCR扩增过程中的浓度。接近结扎量减少，从50毫升至10毫升，在随后的纯化步骤，以尽量减少样品的损失，也节省试剂成本。我们还增加了孵化时间固定嘉PET DNA珠，链霉亲和素珠CHIA-PET的DNA，以确保最大的捕获。

在接近结扎一步，THA嵌合结扎t没有代表在体内染色质相互作用的真实，都不可避免地在一个非特定的和随机的方式产生。因此，任何CHIA-PET的实验数据的质量评估，嵌合率估计从两个不同的特定核苷酸条码TAAG和ATGT的⁵半交联剂的使用。 CHIA-PET的序列高通量测序后，首先来自特定结扎产品和非特异性结扎产品的链接条码组成和序列分析可以区分^8。被称为嵌合体的比例（即异AB连接器）呈现在我们的内部MCF-7 RNA聚合酶II CHIA-PET的图书馆是低于15％。

嘉PET序列，其后分为两大类，即自我结扎宠物间结扎宠物。自我结扎宠物获得自我函证结扎染色质片段，而从我而得间结扎宠物NTER结扎两种不同的DNA片段。后者再细分为三个不同的类别，基于相同的染色体（染色体内间结扎宠物）或标签都被映射到两个不同的染色体（interchromosomal间结扎宠物）的基因组上的每个标签距离。我们已经开发了1 CHIA-PET的工具软件包，理清不同类别^8。这将根据库中的DNA片段。一般来说，小的芯片碎片会给一个更高的分辨率，并切断这些RNA聚合酶II嘉PET库大约是4 KB。

此外，真正的染色质相互作用可以从随机噪声区分计数间结扎宠物互动集群的数量，换句话说，高PET计数集群据说有更高的概率是一个真正的染色质相互作用⁸ 。

来过滤误报1上升，从高浓缩铀的锚定能形成随机机会间结扎宠物，统计分析框架也已制定占到任何两锚⁸间结扎宠物随机形成。

总之，CHIA-PET的技术允许映射在全球范围内的染色质相互作用网络。嘉义PET芯片的实施，使图书馆的复杂性和背景噪音减少。此外，芯片增加特异性染色质相互作用，使特定的染色质相互作用与特定的转录因子^5的考试。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
4-20％梯度TBE凝胶	Invitrogen公司	EC6225BOX	步骤b，6.3
5×T4 DNA与PEG连接酶缓冲液	Invitrogen公司	46300018	步骤B，2.2
6％TBE凝胶	Invitrogen公司	EC6263BOX	步骤b，6.8
安捷伦DNA 100含量	安捷伦科技公司	5067-1504	步骤B，7.1
安捷伦高灵敏度DNA检测	安捷伦科技公司	5067-4626
安捷伦生物分析仪2100	安捷伦科技公司	G2940CA
离心管过滤器（自旋X）	康宁	CLS8160	步骤B，3.7和6.9
黑暗读者透射	克莱尔化学研究	DR46B	步骤b，6.8
数字Sonifier细胞破碎	布兰森	450D-0101063591	步骤一，4.3
DynaMag-2磁体（磁粉浓缩）	Invitrogen公司	123-21D	步骤，7.5.1步骤B，磁珠洗涤步骤
DynaMag-15磁体（磁粉浓缩）	Invitrogen公司	123.01D	步骤一，5和6
DynaMag聚合酶链反应（磁粉选矿厂）	Invitrogen公司	49-2025	步骤b，6.5
大肠杆菌 DNA聚合酶I	NEB	M0209	步骤b，5.6
GlycoBlue	Ambion公司	AM9516	步骤一，7.5.1步骤B，4.3和6.5
Illumina的CBOT集群发电系统	Illumina公司	SY-301-2002	步骤B，7.4
Illumina的基因组分析仪IIx能	Illumina公司	SY-301-1301	步骤B，7.5
Illumina的体育引子	Illumina公司	PE-102-1004	步骤B，5.4（如有必要）
智能混合机	百利高技	RM-2L	步骤b，任何孵化与旋转
的LightCycler 480实时PCR系统	罗氏公司	04 640 268 001	步骤一，7.5.3步骤B，7.3
LightCycler480 DNA SYBR Green I的MasterMix	罗氏公司	03 752 186 001	步骤B，7.5.3
的M-280链霉亲和素磁珠	Invitrogen公司	11206D	步骤b，5.2
磁（磁珠）G蛋白	Invitrogen公司	100.03D	步骤一，5.1.1和5.2.1
MaXtract高密度（2毫升）	Qiagen公司	129056	步骤一，7.5.1
MaXtract高密度（50毫升）	Qiagen公司	129073	步骤B，4.2
MmeI	NEB	R0637	R0637
核糖核酸酶一核糖核酸	Promega公司	M426C	步骤B，4.8
RNA聚合酶II（8WG16）单克隆抗体	Covance公司	MMS-126R	步骤一，5.2.4
橡树岭离心管（聚丙烯）	NALGENE	3119-0050	步骤一，3.1
橡树岭离心管（铁氟龙FEP）	NALGENE	3114-0050	步骤B，4.3
phus离子高保真预混	finnzymes	架F-531	步骤b，6
picogreen（QUANT-IT）双链DNA试剂	Invitrogen公司	P11495	步骤一，7.5.2
聚苯乙烯圆底试管	BD公司	352057	步骤一，4.1
蛋白酶抑制剂片（完整，EDTA免费）	罗氏公司	11873580001	步骤一，1.6起
蛋白酶K溶液（20mg/mL时）	Fermentas公司	E00491	步骤A，4.4，7.5.1 步骤B，4.1
T4 DNA连接酶	Fermentas公司	EL0013	步骤B，2.2，3.9和5.4
T4 DNA连接酶缓冲液（NEB）	NEB	B0202S	步骤B，3.3和3.9
T4 DNA聚合酶	Promega公司	M4215	步骤B，1.2
T4 DNA多聚核苷酸激酶	NEB	M0201	步骤b，3.3
TruSeq SBS的工具包V5-GA	Illumina公司	FC-104-5001	高中会考的Illumina的Genome Analyzer的IIx能系统
TruSeq体育群集工具包V2-CBOT-GA	Illumina公司	PE-300-2001	利用Illumina的CBOT集群发电系统
SYBR Green I的	Invitrogen公司	的S-7585	步骤B，6.3和6.8
Xcell的的SureLock迷你细胞电泳系统	Invitrogen公司	EI0001	步骤B，6.3和6.8

名称	序列		评论
生物素的一半，连接器（200ng/μl）	顶部	5'GG化学计算海巡署/ iBiodT / ATC TTA台泥的AAC 3'	250 nmole的规模高效液相色谱纯化内部生物素DT（9）
	博特	5'滋养细胞的TAA GGA GAT的空中交通管制气相色谱3'	250 nmole的规模高效液相色谱纯化
生物素的一半，连接器（200ng/μl）	顶部	5'GGC政府总部大楼的GA / iBiodT / ATA CAT台泥的AAC 3'	250 nmole的规模高效液相色谱纯化内部生物素DT（9）
	博特	糖耐量GGA ATG的5'达航管气相色谱3'	250 nmole的规模高效液相色谱纯化
非生物素半交联剂（200ng/μl）	顶部	5'GGC GAT的政府总部大楼航管GGA台泥的AAC 3'	250 nmole的规模PCR级
	博特	糖耐量GGA TCC的5'GAT的空中交通管制的GC 3'	250 nmole的规模PCR级
GS20适配器一个（200ng/μl）	顶部	文建大老山隧道的CAT 5'CCC认证炉TGC GTG台泥的CATCTG的交委会建CCC认证TGT的反恐活动星系核的N 3“	250 nmole的规模PCR级
	博特	AGA公司5'CTG造影GGA GGG的AAC AGA公司TGG GAC的ACG的造影GGA热重的GAT的GG 3'	250 nmole的规模PCR级
GS20适配器乙（200ng/μl）	顶部	5'CTG的AGA公司成飞贲门癌ACA的GGG GAT的AGG的民航局GGC ACA的造影GGG的ATA的GG 3'	250 nmole的规模PCR级
	博特	5'建航管CCC认证的TGT GTG建炉TGC税务师台泥建糖耐量GCG TGT的反恐活动星系核的N 3“	250 nmole的规模PCR级
Illumina公司的神经网络适配器	顶部	5'ACA的反恐TTT CCC认证交咨会ACG的ACG的反恐交委会海巡署TC 3'	250 nmole的规模高效液相色谱纯化步骤B，5.4
	博特	5'磷酸 - CGG公司的GAT AAG的AGC的GGT的TCA的GCA的GGA ATG的化学计算公司3'	250 nmole的规模高效液相色谱法净化磷酸的5'端，请参阅步骤B，5.4
Illumina的1-454（前锋）引物（10μM）	5，亚洲空运中心的GAT ACG的图文影像集团行政协调行政协调GAG的空中交通管制交咨会行政协调会税务师台泥建GTG炉TGC CTT的G 1“		250 nmole的规模PCR级
Illumina的2-454（反向）引物（10μM）	5'GCA的棉酚民航局海关总署GGC ATA的海巡署的GAT CGG公司台泥空管TCA的台泥CTG的总工会GTC的3'		250 nmole的规模PCR级
1.1定量PCR引物（10μM）	5'亚洲空运中心的GAT ACG的图文影像集团行政协调行政协调聚糖3'		10nmole规模PCR级
2.1定量PCR引物（10μM）	民航局贲门癌棉酚海关总署5'GGC ATA的海巡署3'		10nmole规模PCR级
3-454 Illumina的测序引物（100μM）	5'TGC GTG TCC的CAT CTG的交委会建CCC认证的TGT反恐公司3'		100nmole规模高效液相色谱纯化
4-454 Illumina的测序引物（100μM）	5'GTG建TGC税务师台泥建糖耐量图文影像集团的TGT反恐公司3'		100nmole规模高效液相色谱纯化