单细胞的多巴胺释放，同时电压钳和电流分析法测量

摘要

电化学技术措施，通过检测自发多巴胺的氧化产生的氧化电流从一个单细胞多巴胺的释放。同时钳位电压和安培的方法揭示了整体的“活动”，这种活动对多巴胺的反向运输的多巴胺转运体的调节作用机理之间的关系。

摘要

其释放到突触间隙，多巴胺后发挥其生物学特性，通过其前和突触后的目标^1。的多巴胺信号被终止通过扩散^2-3，胞外酶^4，和膜转运^5。位于周边的多巴胺神经元的突触间隙的多巴胺转运蛋白，清除释放的胺通过向内多巴胺通量（吸收）。多巴胺转运蛋白也可以在相反的方向，在这个过程被称为向外输送或流出的多巴胺⁵从内到外释放胺。 20余年前，苏尔寿等。报道，多巴胺转运可以工作在两种模式的活动：向前（吸收）和反向（流出^）5。通过外排通过释放神经递质转运到细胞外空间移动大量的多巴胺，并已被证明发挥重要的调控作用，在细胞外多巴胺Ĥomeostasis ^6。在这里，我们描述了如何同时膜片钳和安培法记录膜电位被控制以毫秒的时间分辨率时，通过外排机制，可用于测量释放多巴胺。对于这一点，使用Axopatch 200B中放大器（Molecular Devices公司，用一个低通贝塞尔滤波器组在1,000 Hz的全细胞电流记录），全细胞电流和氧化（电流）信号是同时测量的。对于记录的碳纤维电极的安培法连接到第二放大器（Axopatch 200B中），被置于相邻的质膜，并保持在700毫伏。可以被记录的全细胞和氧化的电流（安培），可以使用一个电压阶跃协议生成的电流 - 电压关系。不同于通常安培校准，需要转换为浓度，电流被直接报告，而不考虑的有效容积^7。因此，所得到的数据代表一个下限多巴胺流出，因为有些发射机失去本体溶液。

研究方案

1。设备和用品

1. 安装一个法拉第笼顶部的抗振动台（TMI），以减少背景噪音。
2. 的同时膜片钳安培的记录系统需要一个倒置显微镜具有优良的DIC的光学元件和长工作距离镜头。连接到汽车电池的显微镜灯塔。这个直流系统的光源，用于将进一步降低的电噪声。
3. 液压的微操纵（锡斯基尤）进一步降低噪音。在我们的配置中，我们使用的全细胞记录，用右手的机械手和左手为安培。

2。准备电极记录

1. 拉块电极使用石英移液管上的P-2000拉出器（萨特）。我们的拉持续约5秒后，用两个热循环。在我们的全细胞膜片吸液管，这导致加热时间一致电阻（MΩ3-4​​）。
2. 填充电极与所述液含2 mM多巴胺，它安装于正确的机械手。保持的吸移管溶液包含DA用铝箔包裹的容器。请在冰上。多巴胺是可氧化。保持溶液在冰上，避光将减少多巴胺的氧化速率。
3. （大矸）一个ProCFE低噪声的碳纤维安培电极，轻轻取下的储物盒，填充与汞，安装到安培适配器（在图1所示），然后安装在右边maniupulator。保护免受损害的碳纤维的前端保持的碳纤维的远端。实验室显微镜检查电极的前端，以确保清洁完整。
4. 检查通过把包含外部溶液的玻璃底培养皿中的电极的安培电极的完整性。记录的基准电流，在没有多巴胺。添加10微升的为1mm DA解决方案的菜。一个很好的安培电极重帘线的氧化电流的增加。重复此步骤，在每一个实验的开始和结束，使若干安培电极工作正常。

3。准备主设计，以表达多巴胺转运体的玻璃底培养皿或细胞的多巴胺神经元的神经细胞培养

1. 轻轻洗细胞或多巴胺神经元的3倍，温暖的外部解决方案。
2. 安装玻璃底培养皿，在显微镜阶段。

4。可视化细胞进行实验

1. 找到正确的焦点，清晰地可视化的细胞。将贴片电极上的正压力。然后，轻轻地使两个电极下降到溶液中，并靠近细胞。
2. 旁边的小区（在左侧），和在右边的贴片电极安培电极的位置。
3. 对细胞的修补电极达到一个gigaohm的密封。破裂的密封与吸实现整个单元的配置。
4. 允许5-8分钟含多巴胺进入细胞内部溶液用于透析。
5. 使用所需电压台阶或斜坡协议。同时采集数据而膜电位的补丁移液管通过控制从两个补丁移液器和安培电极测量全细胞电流和反向多巴胺通过多巴胺转运蛋白运输。

结果

组合膜片钳与安培法可以测量电压依赖性DAT介导的DA流出。 图2A示出有代表性的实验配置和记录DAT介导的DA流出当细胞内以及独特的膜电位，通过全细胞膜片移液器夹紧。使用这种技术，细胞表达YFP-DAT蛋白的电压钳位与全细胞膜片移液器而安培电极被放置到质膜（ 图2A）。整个电池用电极的填充用移液管溶液含有2mM DA。安培触摸质膜的电极被保持在700毫伏，大于DA的氧化?...

讨论

同时电压钳位和​​安培法有以下好处。所有类型的细胞都可以访问的，并且可以被用于记录。录音完成后的细胞或神经元的鉴定是简单明了的。特别是，如果该信元被加入荧光标记的兴趣蛋白质的荧光标记的实验者可以很容易地选择目标细胞或神经元。的实验配置允许的药物制剂的均匀和受控的交付，通过修补程序移液管，或通过加入这些试剂的浴溶液^10。在同时膜片钳安培的技术允许...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			设备
抗振动表w /法拉第笼	技术制造公司	63-500系列	我们使用模型63-543
倒置显微镜尼康TE-2000。	尼康	停产	现在Eclipse钛
两个低噪声放大器Axopatch 200B中	Molecular Devices公司		800-635-5577
1-CV 203 BU探头	Molecular Devices公司		800-635-5578
1-HL-U吸管架	Molecular Devices公司		800-635-5579
Digidata 1440A的A / D转换器	Molecular Devices公司		800-635-5580
两个的操控Siskyou，离开和右撇子	锡斯基尤	MX6600R MX6600L	877-313-6418
激光吸管拉马	萨特仪器	P-2000	888-883-0128
低噪声的碳纤维安培电极	ProCFE		www.dagan.com
低噪音石英移液管	萨特仪器	QF100-70-7.5	888-883-0128
12伏汽车电池			广泛使用
汽车电池充电器			广泛使用
			试剂
氯化钠（NaCl）	西格玛	S7653
HEPES	西格玛	H3375
葡萄糖	西格玛	G7528
硫酸镁（用MgSO 4）	西格玛	M2643
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）	西格玛	P5655
氯化钾（KCl）	西格玛	P9333
氯化钙二水合物（CaCl 2的 •2H 2 0）	西格玛	223506
六水合氯化镁（MgCl 2的 •6H 2 0）	西格玛	M2670
EGTA	西格玛	E0396