实时监控的配体 - 受体相互作用的荧光共振能量转移

摘要

我们表明FRET之间的共轭聚合物的聚二乙炔（PDA）和荧光基团连接到PDA脂质体的生物分子的传感表面。 PDA脂质体也包含在其表面上的生物分子的受体分子可以用作探针。配体 - 受体相互作用导致这是传感机构的基础的荧光团和PDA之间的FRET效率的变化。

摘要

荧光共振能量转移是一个过程，非辐射能量是从激发供体分子转移到基态的受体分子通过远程偶极-偶极相互作用^1。我们在本传感检测，利用PDA的一个有趣的特性：蓝移后的UV-Vis的PDA的电子吸收光谱（ 图1）中的分析物相互作用与受体连接到PDA ^2,3,4,7。这种在PDA中的吸收光谱的移位提供了在光谱重叠（J），PDA（受体）和若丹明（供体）之间的变化导致在FRET效率的变化。因此，分析物（配体）和受体之间的相互作用是通过FRET检测到供体荧光和PDA之间。特别是，我们显示了一个的模型蛋白质分子链霉亲和素的检测。我们还证明了牛血清白蛋白（BSA）的脂质体的表面用共价键结合的FRET机制。这些t之间的相互作用他双分子层脂质体和蛋白质分子可以在实时感测到。所提出的方法是用于感测小的化学和大型生物化学分子的一般方法。由于荧光本质上是更敏感比比色法，测定的检出限，可以在子纳摩尔范围或低^8。另外，PDA可以作为一个通用的受体，在FRET，这意味着，多个传感器可以开发PDA（受体）官能化与捐助者和PDA的脂质体的表面上附着的不同的受体。

研究方案

A. PDA脂质体^4,5,6的合成与表征

注1：保护PDA解决方案，光在所有的实验步骤，每一容器上使用的铝箔包装。

注2：两个不同的脂质体溶液（B和C）以下步骤A（PDA脂质体的合成与表征）。

1。合成N-羟基Diacteylene（NHS-PCDA）

1. 为了准备脂质体，PCDA-NHS的一个重要成分是必需的。我们已经合成PCDA-NHS使用下列程序：
2. 添加10,12 - pentacosadiynoic酸（PCDA）（0.267克，0.713毫摩尔），N-羟基琥珀酰亚胺（0.0914克，​​0.786毫摩尔）和1 - （3 - （二甲基氨基）丙基）-3 - 乙基碳二亚胺盐酸盐（0.144克，0.713毫摩尔）在无水CH ₂ Cl _2（20毫升）中。
3. 在室温下搅拌该溶液2小时。
4. 小心地取下溶剂的使用rotary蒸发器，得到干燥的薄膜。
5. 使用分液漏斗中提取残余物，用乙醚（25毫升）和水（25毫升）的三倍。
6. 干燥有机层，用MgSO _4（1.0克）为半小时。过滤并通过旋转蒸发除去溶剂，得到白色固体粉末（0.24克，> 90％）。
7. 根据核磁共振（NMR）分析最终的化合物。
8. ^{1 H} NMR（300兆赫，DMSO），δ（ppm的）：0.893（吨，3H），1.268（米，26H），1.512（米，4H），1.754（米，2H），2.252（吨，4H）， 2.365（1H），2.610（米，1H），2.842（2H）。

2。脂质体制备^5,6,7

1. 溶解PCDA：PCDA-NHS：1,2 -二肉豆蔻酰-sn-甘油-3 -磷酸胆碱（DMPC）:: 8：1：1在20毫升二氯甲烷中。
2. 用滤纸过滤溶液以除去团粒。
3. 完全蒸发溶剂，得到的薄膜的单体。
4. 过夜真空干燥的薄膜UUM。
5. 水合物的膜用去离子水（50毫升），使所需的浓度（0.65-1毫摩尔）的脂质体溶液。
6. 超声处理将所得的悬浮液用探针超声波仪，在76℃〜18分钟。
7. 小心地通过该溶液通过一个纸过滤器，以除去脂质团聚体
8. 在4℃过夜，以促进自我组装的单体溶液冷却。最终的解决方案应该是光学透明的。
9. 聚合自组装的联乙炔单体（脂质体），通过照射与〜2分钟使用钢笔射线UV源（4.5毫瓦/平方厘米^2）在空气中的254 nm的紫外线辐射。
10. 的脂质体溶液在室温下是稳定的，至少两个星期。解决的办法是更稳定的冷藏时。

B.罗丹明标记牛血清白蛋白（BSA-RH）修改PCDA脂质体的制备

1。到脂质体表面的结合BSA-Rh型

1. BSA-RH溶解在PBS BUFFER（离子浓度为0.01M，pH 7.2）中，以使最终浓度达到1.2μM的BSA的罗丹明B溶液。
2. 加入2毫升（1.2μM）BSA-罗丹明A.2在步骤（见上文），在室温下制备的脂质体溶液至10毫升。
3. 一直沿袭古典的结合从蛋白质的赖氨酸残基的羧酸由NHS组激活的胺基反应（反应方案在图2中）。 NHS-PCDA使用NHS-胺的反应（ 图2，步骤2）的脂质体的共价结合的蛋白质分子的设计（ 图2，步骤1）。 NHS是一个极好的离去剂，在向前的方向驱动的胺羧酸反应。在适当的条件下，反应收率是定量的。
4. 取消的免费BSA-RH：一个光谱浸泡在去离子瓦特/ POR生物纤维素酯（CE）膜（MW C O：100000）ATER为15分钟。该膜是用于透析的未反应的BSA-罗丹明（分子量〜66000沓）在去离子水中。
5. 小心地将溶液转移到透析膜。
6. 在透析过程中的水在2小时，8小时，14小时，24小时，和36小时变更。
7. 收集用铝箔覆盖的最终溶液的小瓶中。

C.制备的SR-二胺和生物素标记的脂质体

1。而不是使用DMPC与在步骤2.1中，我们将使用生物素标记的-（1,2 - 二油酰-sn-甘油-3 - 磷酸乙醇胺-N-（生物素基）（生物素-DOPE）。

1. 所有的步骤2.2至2.9。
2. 相反，在步骤B中的BSA-Rh型，使用的二胺的标签Sulphorhodamine（SR-二胺）。
3. 在B.按照所有进一步的步骤
4. 在此制备含有生物素的脂质体，并在其表面上的SR-二胺。随后的步骤A和B（见上文），但有一个例外：链霉亲和素的的解决方案生物素 - 链霉亲和素相互作用，通过改变荧光共振能量转移效率。

D.代表性的成果

题名图。卡通反应说明和FRET在脂质体的表面上的过程中发生的（按照步骤B制备的）。

A.监测蛋白质附着脂质体使用荧光共振能量转移¹

罗丹明和PDA准备步骤B中的脂质体之间的荧光共振能量转移监控

BSA-Rh型的激发和发射光谱和吸收光谱的PDA（ 图3A）。我们可以清楚地看到，发射光谱的吸收光谱PDA BSA-RH重叠。 FRET的机制，这满足谐振条件。 BSA-罗丹明标记的脂质体聚合之前和之后，分析用UV-V光谱和荧光光谱。对于隔离的施主和受主，FRET效率是高度依赖于供体-受体的距离（r）和 J ¹第（j-值）。观察中的排放量的淬火（ 图3B），因为若丹明和PDA由于电子吸收光谱的蓝色的光聚合后的PDA的外观之间的FRET。在我们的例子中，FRET效率是零的未聚合的脂质体与罗丹明因为 J = 0，在可见光区域的未聚合的脂质体。

我们进行了类似的实验，只有PDA不包含NHS在其表面的脂质体。在这些情况下，未标记BSA-Rh型的脂质体的表面。在这种情况下，若丹明和PDA相关（r _平均值 ）之间的平均距离远大于福斯特半径（R ₀ = 2.8纳米）。因此，我们并没有观察到荧光强度下降幅度大。这种看法。莱索托的荧光猝灭是占主导地位，当r <2.8 nm的。

J和R _0的值，使用以下公式计算：[1]

_{J（λ）=∫F ^{D（λ）εA（λ）λ4Dλ}}

R ₀ = 0.211 K ^{2 N-4} _Q D J（λ）] ^1/6

蓝PDA的消光系数（ε）的范围是在〜2000-10000 M ^-1厘米^-1之前，加入链霉抗生物素蛋白。蓝PDA的消光系数是依赖于光聚合条件。 [2]对于例如，ε的值将是较大的溶液聚合的时间较长。另外，自组装体的联乙炔单体也可能会影响的ε值。 在 J演算ations需要考虑这些变化，又反映了由于生物素-链霉亲和素分子间的相互作用在PDA消光系数的变化。用实验的PDA的吸收和SR-101发射数据，J值计算。 J值的变化是由于转移后，加入到该溶液中（ 图4C）的链霉抗生物素蛋白的PDA中的电子吸收光谱。 J值的单位是M ^{-1 cm -1的}纳米^4。

B.监测FRET，加入链霉抗生物素蛋白的生物素标记的脂质体溶液

注1：监控罗丹明​​准备在上述步骤C和PDA脂质体之间的荧光共振能量转移。

激发和发射光谱Sulphorhodamine标签二胺（SR-二胺）和吸收光谱的PDA（ 图4A）。未聚合的聚合生物素标记的脂质体进行了分析使用的UV-Vis光谱和荧光光谱。聚合（ 图4B），表明由于FRET的荧光淬灭后，若丹明（SR-101）的排放量降低45％左右。加入40μl等分试样（1μM）的链霉抗生物素蛋白溶液至2毫升脂质体溶液。链霉抗生物素蛋白与添加到该溶液中，在J值的变化被观察到（ 图4C）。图4D示出了作为生物素结合的链霉抗生物素蛋白，蓝色的PDA，脂 ​​质体（中心在图1中在〜645 nm）的峰强度的下降，而在540 nm处的吸收峰的增加，观察到（F IGURE 1S）。在FRET的变化效率。荧光共振能量转移效率下降，链霉亲和素浓度的增加，也与我们的预测一致。

记录每40微升等分此外，链霉亲和素的的SR排放后。我们观察到一个稳定增长后，在罗丹明排放增加的链霉抗生物素蛋白（ 图5）。罗丹明排放这增加是由于为sulphorhodamine生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用后的发射光谱和PDA的吸收光谱中的J值减少。在分子水平上，生物素-链霉抗生物素蛋白的相互作用导致有效的共轭长度的微妙的变化，这将导致减少在蓝PDA的形式到热力学更稳定的红色PDA表单²的PDA。这是在J个值中的变化的基础。有趣的是，分子间的相互作用为共价键或非共价键合的生物素到PDA脂质体的微妙差异可以探测使用我们检测测定^4。

我们也进行对照实验中，在相同的实验条件下的那些链霉抗生物素蛋白 - 生物素系统监测的对照样品的发射。对照实验包括：（1）脂质体的解决方案，包含生物素在他们的表面中加入​​相同的体积和浓度的缓冲溶液中，和（2）无生物素受体在其表面上的脂质体溶液中加入链霉抗生物素蛋白的相同的体积和浓度。生物素标记的脂质体溶液后，加入链霉抗生物素蛋白的强度表现出增强的强度，但对照实验的脂质体溶液中的强度（例如，请参阅图2S），另一方面，具有在发光强度下降。这是归因于该溶液稀释。这些实验清楚地表明，该解决方案的增强发射是由于特定的分子间的相互作用。

福斯特半径（R _0），若丹明和PDA对计算（式（2））为〜2.80 nm的。这意味着，孤立的PDA -罗丹明对罗丹明分子的激发态的50％将有自己的能量转移到PDA 当 r为2.80纳米。

我们OBS erved，当生物素共价连接到PDA的骨干网，排放量增加的非共价键合生物素的脂质体的2-3倍大于⁴这些结果有力地表明，我们所提出的系统是敏感的区分中的相互作用的微妙的差异在换能器（连接器之间的生物素和脂质体双层）由于共价和非共价键连接到脂质体受体。根据分光光度计，实时监控（毫秒为单位的第二时间尺度）的蛋白质的相互作用（在UV-Vis光谱）的扫描和数据采集能力是可能的与该感测系统。

图1的吸收光谱的蓝色和红色的PDA解决方案。 （插图）光学显微照片拍摄的数码相机。

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图2为PCDA-NHS的合成（步骤1）的反应式。 PCDA-NHS反应的胺取代基的蛋白质（第2步）。第2步的基础上的赖氨酸残基的蛋白质的PCDA的羧酸单体的结合。 点击此处查看大图 。

图3A。变动观察到FRET效率是由于在PDA中的吸收光谱的变化。聚合之前有BSA-Rh型发射和PDA的吸收，但在聚合后与BSA-Rh型发射PDA吸收重叠，这是要求对FRET之间没有重叠。罗丹明是施主（红色）和聚合的PDA脂质体作为受体（蓝色）。

图3B。BSA-Rh型标记的脂质体之前（蓝色）和后：PCDA聚合（红色）的荧光光谱。一个大的减少在罗丹明排放的观察由于FRET罗丹明和PDA之间。

图4A。光谱重叠（J）为PDA（蓝色或红色）吸收光谱和Sulphorhodamine的发光光谱（橙色）的变化。 图4A是极端条件下的代表性的频谱，即，当被加入到溶液中过量的链霉抗生物素蛋白。图4A示出了几乎完全的蓝色到红色的PDA变换后，添加链霉抗生物素蛋白的过量。可以清楚地看出，J（光谱重叠）增加与PDA吸收光谱的蓝移

图4B。前荧光光谱（蓝色）和后相关（rED）脂质体的聚合。

图4C。对FRET状态：J之间的变化给体（sulphorhodamine）和受体（PDA）与链霉抗生物素蛋白的另外的脂质体溶液。

图4D。FRET效率的变化之间的给体（sulphorhodamine）和受体（PDA）与链霉抗生物素蛋白的另外的脂质体溶液。

图5。罗丹明到PDA的脂质体溶液后，添加链霉抗生物素蛋白的等分试样的发光光谱。插图显示了一个更大的排放SR-101光谱的变化。

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讨论

我们已经进行了选择性结合脂质体的表面上的蛋白质的赖氨酸残基的使用NHS-胺反应。 FRET为基础的方法是能够进行实时监控，生物素 - 链霉亲和素结合蛋白（BSA）结合到脂质体表面。类似的过程可以被应用到与他们的选择性受体的各种蛋白质相互作用的结合动力学研究。有灵活性是在选择的荧光基团，将提供的荧光的光谱特性，根据J值的变化。 PDA是一个普遍的接受。因此，随着多个荧光?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
的10,12 pentacosadiynoic酸（PCDA）	政府飞行服务队的化学品	3261	光敏感
N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）	Acros Organics公司	157270250	湿度敏感
1 - （3 - （二甲基氨基）丙基）-3 - 乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）	CHEM-IMPEX国际	00050
1,2 -二肉豆蔻酰-SN-甘油-3 -磷酸胆碱（DMPC）	阿凡提极性脂质	850345P
罗丹明标记牛丝氨酸的嗯白蛋白（BSA-RH）	Sigma Aldrich公司	A4537
（1,2 -二油酰-sn-甘油-3 -磷酸乙醇胺-N-（生物素基）（生物素-DOPE）	阿凡提极性脂质	870282