一个荧光识别GIRK通道调制器的筛选试验

摘要

一个确定药物相互作用与G蛋白门控内向整流钾实时甄别 ^-（GIRK）通道描述。该法采用膜电位敏感荧光染料来衡量GIRK通道活性。这项技术是适应的细胞株上使用。

摘要

G蛋白门控内向整流^钾 （GIRK）通道功能广泛的激素和神经递质的细胞介质，并在大脑，心脏，骨骼肌和内分泌组织^1,2表示。 GIRK通道成为激活后的配体结合（神经递质，激素，药物等），其细胞膜结合，G蛋白偶联受体（GPCRs）。这种结合使G蛋白_（G I _GØ），随后结合并激活GIRK通道的刺激。一旦打开了GIRK通道允许的K运动导致细胞静息膜电位变得更负^+。因此，GIRK通道激活的神经元减少自发性动作电位的形成和抑制兴奋性神经递质的释放。在心脏，激活GIRK通道的抑制起搏器的活性，从而减缓心率。 3类=“jove_content”的GIRK通道代表的新的目标。然而，这些通道的药理学仍然人迹罕至。虽然一些药物，包括抗心律失常药物，抗精神病药和抗抑郁药阻止GIRK通道，这种抑制是没有选择性的，发生在相对 ​​较高的药物浓度^3。

在这里，我们描述了一个实时的筛选试验，确定新的调制GIRK通道。在这个实验中，神经AtT20细胞，表达GIRK通道，装有膜电位敏感荧光染料，如双（1,3 - dibutylbarbituric酸）的三甲oxonol [DiBAC _4（3）]或021-152 HLB值（ 图1 ）。染料分子成为强烈荧光以下的摄取进入细胞内（ 图1）。治疗GPCR的配体细胞刺激GIRK通道打开。由此产生的K ⁺外流的细胞，导致膜电位变得更负，荧光信号降低（ 图1）。因此，GIRK通道通过调节^钾离子流出的药物可以用荧光酶标仪测定。不同于其他离子通道筛选试验，如原子吸收光谱法⁴或放射性分析^5，GIRK通道荧光检测提供了一种快速，实时和廉价的甄别程序。

研究方案

1。单元的制备

1. 垂体AtT20细胞生长在杜尔贝科的改良Eagle培养基（DMEM培养基）10％马血清和保持在5％ _二氧化碳培养箱的气氛中，在37°C培养为辅。
2. 保持文化的传代细胞，每5至7天，使用标准的胰蛋白酶消化过程。
3. 被毛黑色，清澈见底的井，50μL聚-L-赖氨酸的96孔板。允许井干在孵化器30分钟。
4. 板30000每孔细胞密度和细胞储存在3-4天的孵化器含有200μL的媒体在96板细胞。
5. 使用一个愿望设置，组成4公升1塞的一端连接到真空的罐子和一个200μL枪头在另一端，慢慢地吸从单层细胞培养液中。
6. 洗细胞与正常缓冲溶液200μL（132 mM氯化钠，氯化钾，1米5毫米中号₂氯化钙，氯化镁₂ 1毫米，5毫米葡萄糖，5毫米肝素钠，用NaOH的pH值7.4）。
7. 加入200μL缓冲区包含敏感染料膜电位_{（MPD），4（3）DiBAC}或HLB值021-152（5μM）解决方案，每口井和40分钟的细胞置于37°C。

2。测试化合物的制备和细胞治疗

1. 准备测试化合物的化合物库的连续稀释（股票= 10毫米在DMSO）（96格式）使用1 Versette（ThermoFisher）自动化液体处理系统。
2. 取出96孔板，AtT20细胞，从孵化器，并允许板恢复到室温。吸了旧的缓冲区，并适用于新鲜的缓冲溶液中含有细胞的MPD。
3. 使用液体处理系统，适用于不同浓度（10纳米到10μm）的测试化合物（2至20μL）和控制解决方案（0.1％二甲基亚砜）（在缓冲溶液containi吴MPD），含有细胞的96孔板。
4. 测试化合物荧光测量前5分钟孵育细胞。

3。激活GIRK通道，荧光测量和分析

1. 插入到百特Synergy2荧光酶标仪96孔板，分别获得在激发和发射波长为520和560 nm的荧光背景信号。
2. 应用GPCR的配体（生长抑素= 200 nm或卡巴= 10μM）或控制解决方案（单缓冲）（20μL）井（总体积为220μL）使用Synergy2喷油系统激活GIRK通道。收集超过300秒的采样周期10秒的时间间隔，在激发和发射波长为520和560 nm的数据点，分别。
3. 获得使用百特GEN5软件的荧光变化的时间过程和峰值幅度，并作进一步的分析数据导出到Excel。
4. 计算的Z'的因子确定了检测的可靠性。因素Z'决心用板包含2行正面（GPCR的配体）和阴性（单缓冲）控制。 ，Z'因子定义为：Z“= 1 - _{（3σ+3σ列印} ）/ |μ _的P - _列印 |μ，μ _{的P＆μ列印}阳性对照和阴性对照信号的手段，和σ _宝洁 Σ _列印阳性对照的标准偏差和负控制信号，分别为^6。在0.5至1.0的范围Z'因素表明，检测质量是优良的^6。板与0.5 Z'以下因素排除在分析之外。
5. 复检中存在BA ^{2 +}或tertiapin - Q调制荧光信号的化合物，以确认内向整流K ⁺通道的特异性。

4。 ŕ之代表结果

使用GIRK通道法测量荧光信号的例子如图2所示。此外GPCR的配体生长抑素（200纳米）的AtT20细胞造成的HLB 021-152荧光信号的一种快速，时间依赖性下降（ 图2）。相比之下，生产控制解决方案，除了在小荧光的瞬时上升，随着时间的推移返回到基线（ 图2）。控制和生长抑素解决方案注入的96孔板峰的荧光值比较了1 Z'因素范围为0.5至0.7。为进一步量化，控制记录减去生长抑素纪录和生长抑素敏感信号分析（ 图2）。

该法提供了一种快速识别药物调节GIRK通道的方法。例如，药物抑制GIRK茶nnel应防止细胞的K ⁺外流减少荧光GPCR的配体介导的跌幅。所示，在图3，治疗的细胞毒素tertiapin-Q块GIRK通道^7，产生抑制生长抑素介导的荧光变化。普罗帕酮，抗心律失常药物，在心脏⁸块GIRK通道，也抑制了荧光的变化（ 图4）。该法也可能是有用确定激活GIRK通道。然而，乙醇的应用（100毫米和200毫米），激活GIRK通道^2,3，造成时相比没有显着的变化的荧光信号控制解决方案（P> 0.5）。

图1。GIRK通道荧光检测的实验设计。 AtT20细胞培养在含有膜上的缓冲区Ë电位敏感荧光染料（四）。染料分子进入细胞后，细胞内蛋白质（顶部面板）结合荧光。结合生长抑素（SOM）的GPCR的刺激了G抑制蛋白（七_）造成激活GIRK通道（底部面板）。随后外流的K ⁺的细胞，导致膜电位变得更消极的染料分子退出细胞。因此荧光信号的跌幅（底部面板）。

图2。代表HLB值021-152荧光信号AtT20细胞的时间来衡量，此外生长抑素或控制的解决方案。荧光强度的比值（F / F _O）的计算除以信号中存在生长抑素（六_）（F O）广告前测得的基线信号（或控制解决方案）的生长抑素dition（或控制的解决方案）。每个点代表平均值±SE 5-6井获得。生长抑素或控制解决方案，增加了在零时间（↓）。控制解决方案，除了造成在小瞬态荧光信号的增加。这导致从溶液注射引起的温度变化。

图3。AtT20与tertiapin问（500纳米）的细胞治疗抑制生长抑素结合并阻断GIRK通道的荧光信号介导的跌幅。每个点代表平均值±SE 4-6井获得。生长抑素在零时间（↓）。

图4。与普罗帕酮（20μM）AtT20细胞的治疗，也能抑制在介导生长抑素减少荧光信号。每个点代表平均值±SE 5-6井获得。生长抑素在零时间（↓）。

讨论

虽然膜电位敏感荧光染料已被用来确定调节离子通道的药物^，9,10，这是他们的神经GIRK通道药物发现中的应用的第一次报告。这里GIRK通道荧光检测提供了快速，可靠，实时的方法，筛选配体门控K ⁺通道。与细胞的永生细胞株（HEK293细胞，CHO等）表达一个外生重组GIRK通道¹¹或克隆细胞株（AtT20，PC-12）表达的内源性通道的广泛使用，可以修改该法。此外，该法可适应在胚胎干...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号
DMEM培养液	CellGro	10-013
马血清	Invitrogen公司	16050-114
96孔板	康宁	3603
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich公司	P4707
生长抑素	Sigma-Aldrich公司	S9129
卡巴	Sigma-Aldrich公司	C4382
HLB值021-152	AnaSpec	89300
versette自动化液体处理程序	ThermoFisher	650-01
synergy2荧光酶标仪	百特
GEN5分析oftware	百特