制备髓源性抑制细胞从幼稚和胰腺癌荷瘤小鼠，用流式细胞仪和自动磁性细胞分选（AutoMACS）（MDSC）

摘要

这是一个迅速和全面的免疫髓源性抑制细胞（MDSC）和丰富GR-1的方法 ^-从小鼠脾脏白细胞。这种方法使用流式细胞仪和AutoMACS细胞排序丰富可行的GR-1 ^-白细胞之前使用的MDSC排序，以流式细胞仪在体内和在体外检测。

摘要

的MDSC是一个不成熟的巨噬细胞，树突状细胞和粒细胞积聚在病理条件下的淋巴器官，包括寄生虫感染，炎症，创伤后应激，移植物抗宿主病，糖尿病和癌症^1-7异构人口。在小鼠的MDSC明示的Mac-1（细胞CD11b）和GR-1（Ly6G和Ly6C）表面抗原。重要的是要注意的MDSC荷，它们显着扩大在各个主机研究和压制^7-10天真对口相比抗肿瘤免疫反应。然而，根据病理状态，有不同的MDSC亚与不同的机制和抑制^11,12的目标。因此，有效的方法来隔离可行的MDSC人口是重要的，在阐明各自不同的分子机制抑制在体外和体内 。

近日，在Ghansah组报告的MDSC在小鼠胰腺癌模型的扩展。我们的肿瘤轴承的MDSC显示动态平衡的损失，并增加抑制功能比较幼稚的MDSC ^13。的MDSC的百分比显着天真与荷瘤小鼠的淋巴车厢。这是一个重大的警告，这往往阻碍了这些的MDSC准确的比较分析。因此，丰富天真小鼠GR-1 ⁺白细胞荧光激活细胞分选（FACS）前提高纯度，活力和排序的时间显着降低。然而，丰富的GR-1 ⁺荷瘤小鼠的白细胞是可选的，因为这些丰富的排序快速流式细胞仪。因此，在这个协议中，我们描述了一个高效的方法，免疫的MDSC从排序的MDSC及时天真小鼠脾脏和丰富的Gr-1 ⁺白细胞。免疫C57BL / 6小鼠接种小鼠Panc02 CE的LLS皮下而天真的小鼠接受1XPBS。大约30天接种后脾脏被采伐和加工成单细胞悬液采用细胞分离筛。脾然后红细胞（RBC）的裂解，这些白细胞等分对MAC-1和GR-1免疫的MDSC百分比用流式细胞仪使用荧光标记抗体染色。在一个类似的实验，从整个天真的小鼠白细胞染色与荧光标记的GR-1抗体，培养与PE的微珠和正选择使用一个自动化的磁性活化细胞分选（autoMACS）分离。接下来，GR-1 ⁺白细胞等份与Mac-1抗体染色，以确定在使用流式细胞仪的MDSC百分比增加。现在，这些GR1 ⁺丰富的白细胞是准备用于比较分析（天真与荷瘤） 在体内和体外的MDSC排序流式细胞仪

研究方案

开始之前，请准备以下解决方案：

3％，染色媒体（SM）：

-3％的胎牛血清（FBS），1X的磷酸盐缓冲液（PBS）

磁珠缓存（MB）：

- 牛血清白蛋白（BSA）的0.5％白蛋白在1XPBS

1。收获从小鼠脾脏

1. 皮下注入1.5×10 ⁵小鼠Panc02细胞悬浮在100μL1X PBS 6-8周岁的C57BL / 6小鼠（哈伦）（荷瘤;结核病）。对照组（幼稚）收到100μL1XPBS。
2. 注射后约4周，安乐死小鼠二氧化碳窒息。
3. 收获从小鼠脾脏钝性使用镊子和剪刀剥离，然后重使用平衡。脾脏在不同的地方，打成50毫升含1×PBS的锥形管。

2。生成一个单细胞Suspensio的n的脾脏白细胞

所有程序应在无菌环境下的生物安全罩及细胞和抗体放在冰上。

1. 组装插入朝下方杯开幕丝网细胞分离筛。然后，扣环插入螺纹面积的开槽端和使用环的关键，拧紧固定环，从而控股到位的屏幕。将聚集在一个Petri菜含有10毫升1×PBS筛。
2. 池脾脏和使用玻璃杵研磨脾脏对细胞分离筛的筛网进入培养皿。各治疗组小鼠的重复。
3. 到50毫升锥形管使用70微米的细胞过滤器和5毫升血清移液器过滤细胞悬液。 12,000 RPM（250-300 XG）离心5分钟。
4. 取出5毫升1×每脾红细胞裂解液上清，重悬沉淀。吸取积极向上和向下。在室温下孵育5分钟。停止反应，加入20毫升1×PBS。吸取积极向上和向下。 12,000 RPM（250-300 XG）离心5分钟。
5. 取出20毫升无菌1×PBS上清，重悬沉淀。吸取积极向上和向下。
6. 50μL，相当于5X10 ^{5-1×10 6}细胞（1×10 ⁷细胞/ ml - 2×10 ⁷细胞/ ml）计数细胞，用台盼蓝和血球和所需的浓度在3％的SM重悬。

3。细胞表面染色/使用流式细胞仪免疫表型的MDSC

1. 96 V为控制和补偿控制的实验样品和单污渍底板标注的井（没有污点，生理盐水;的Mac-1-FITC; GR-1装甲运兵车和DAPI）。
2. 添加5X10 ^{5-1×10 6}细胞，相当于50 /脾到各自的井井液在96孔V型底板。离心分离板在5分钟转速12,000 rpm（250-300 XG）。
3. 准备“预混”鼠标BD FC块在3％的SM 1.5毫升离心管上的冰，稀释（大鼠抗小鼠CD16/32单克隆抗体）（MM）。作为一个起点，最终体积为50μL使用1微克，在3％的SM FC块，每口井。
4. 仔细取出上清液从每个井的96-V型底板的快速反相板和背面，不破坏细胞颗粒在一个废物容器或水槽。
5. 涡，短暂离心5秒FC块MM和添加50μL，在96孔V型底板所有颗粒。拌匀，轻轻吹打下来，留在他们的水井样品。孵育15分钟，在黑暗冰板。离心5分钟转速12,000 rpm（250-300 XG）板。
6. 准备“师父混合”（MM）的3％，在冰上的1.5ml离心管中的SM稀释的荧光标记抗体，而样品与FC块孵化。抗体应该被滴定染色程序，以确定最佳的稀释。作为一个起点，在3％的SM结合的Mac的1-FITC 1:25稀释和1:20稀释的GR-1-APC最终体积为50μL，每个样品以及。
7. 从每个井的96-V型底部小心取出上清液，作为先前所描述的。
8. 旋涡，短暂离心5秒共轭荧光染色抗体的MM，添加50μL，对照组和实验颗粒。轻轻吹打上下拌匀。对于单染色的赔偿，添加的Mac的1-FITC 1:25稀释，1:20稀释的GR-1-APC和75毫微克/毫升的DAPI，最终体积为50μL每口井的3％的SM各自的水井。加入50微升3％的SM不染井（无污点）。拌匀孵育细胞在96孔V型底板块在黑暗的冰上30分钟。
9. 标签流式细胞管（5毫升，12毫米×75毫米的聚苯乙烯圆底管）对应到每口井在96孔V型底部的板块。加入200μl3％的SM每个流式细胞仪管。
10. 离心转速12,000 rpm（250-300 XG）板为5分钟，去除上清。洗净加入100微升3％的SM每个颗粒颗粒混合，轻轻吹打上下。离心5分钟转速12,000 rpm（250-300 XG）板。重复洗涤步骤一次。
11. 从每个井的96-V型底部小心取出上清液，作为先前所描述的。每个颗粒和悬浮在100微升3％的SM，拌匀。
12. 转让的96-V型底板，以及从每100μL悬浮颗粒，他们分别标记的流式细胞仪管。
13. 流式细胞仪分析之前，添加75毫微克/毫升的DAPI控制和实验样品和单一的DAPI染色补偿控制。
14. 执行流式细胞仪数据采集的MDSC百分比。使用负（没有的污渍控制）和单阳性对照执行赔偿。设立这样一个点的情节，显示日志规模远期（FSC）与侧散射（SSC），白细胞人口可确定利益。画一个大的门，但不包括所有白细胞最低的前部和侧分散的碎片和团块。从这个父门，创建一个新的散点图显示南南合作的DAPI（直播）细胞与DAPI和门。选择这个新门的人口，并创建一个点图上显示您的双阳性的Mac-1与GR-1和门（MAC-1 ⁺ GR-1 ^+）的MDSC。

4。 GR-1 ⁺白细胞磁富集

1. 等分1×10 ⁷到适当标记的流式细胞仪管和离心机在12000转5分钟（250-300 XG）剩余未染色白细胞。
2. GR-1-PE抗体的MM准备在1.5 ml离心管。高达10 ⁷细胞，用50μLMB的一个GR-1-PE抗体1:10稀释，每个样品。对于更大的手机号码，相应扩展卷。短暂离心5秒钟，流式细胞仪管中的白细胞和孵育15分钟，在4°C黑暗环境中。
3. 加入2毫升的MB流式细胞仪管，离心5分钟转速12,000 rpm（250-300 XG），弃上清。
4. 准备在1.5 ml离心管的反体育微珠MM。高达10 ⁷细胞，用200μLMB的1:4稀释的反PE微珠，每个样品。对于更大的手机号码，相应扩展卷。短暂离心5秒钟，流式细胞仪管中的白细胞和孵育15分钟，在4°C黑暗环境中。
5. 加入2毫升的MB流式细胞仪管，离心5分钟转速12,000 rpm（250-300 XG），弃上清。重悬浮颗粒在3毫升的SB。通过70微米滤网过滤到一个新的，标有50毫升锥形管。
6. 准备和总理汽车磁珠临分离。所有笔芯瓶，如果有必要与适当的解决方案和空废液瓶。打开仪器检查液容器和初始化后列（S）的状态。所有的符号应该是绿色的。在菜单上，选择上“分离”其次是菜单栏“洗”从较低的菜单栏。选择“冲洗”，从弹出的选项“运行”开始启动过程。一旦启动过程成功完成后，仪器将显示，这是“分离”状态“菜单下。
7. 馏分收集和B行负在行C.积极馏分收集的15毫升锥形管排，50毫升锥形管的磁标记细胞选择适合管的尺寸和地方的50毫升锥形管冷冻试管架
8. 选择“POSSEL_S”积极选择敏感的模式，从样品中标记的靶细胞的细胞分离方案。磁标记的靶细胞被保留在自动贩卖机列;未标记的细胞释放到负的馏分收集管行B.在磁铁自动回缩，将标记的靶细胞释放到积极的收集管，行管ç机架。

5。 GR-1 ⁺浓缩白细胞后排序分析

1. 验票GR-1 ⁺和Gr-1 ^-使用台盼蓝和血球的分数。重悬细胞所需的浓度在3％的染色介质，使50μL相当于5X10 ^{5-1×10 6}细胞（1×10 ⁷细胞/ ml - 2×10 ⁷细胞/ ml）和50μL转移到相应标记的流式细胞仪管。
2. 准备仅适用于Mac-1的MM，在3％的SM终体积为50μL样品1:25稀释。染色细胞和单GR-PE，MAC-1 FITC和DAPI染色赔偿准备流式细胞仪分析。加入200微升3％，SM和DAPI可行性染料如前所述。
3. 执行流流式细胞仪的数据采集，以确定GR-1 ⁺和Gr-1 ^-比例也比较的MDSC百分比前和后autoMACS的富集。

6。代表结果

在这里，我们显示ŕ GR-1 ⁺汇集，天真的MDSC（ 图1）排序随后流式细胞仪脾脏白细胞富集autoMACS之代表结果。幼稚白细胞1×10 ⁶的Mac-1-FITC和GR-1-APC抗体染色，以确定使用的BD LSRII仪器的MDSC百分比，前到autoMACS排序。幼稚白细胞1×10 ^7，然后染色，抗GR-1-PE和PE的微珠富集GR-1 ⁺使用一个autoMACS临分离的白细胞抗体。后autoMACS富集，GR-1的百分比GR-1 ⁺和Gr-1 ^-收集馏分使用流式细胞仪进行了评价。 1×10 ⁶ GR-1 ⁺白细胞被拆除的Mac-1-FITC抗体进行分析和比较丰富的MDSC百分比，汇集非丰富，汇集通过流式细胞仪检测荷瘤白细胞的幼稚白细胞染色。

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图1。朴素GR-1 ⁺排序的MDSC流式细胞仪白细胞AutoMACS富集。胰腺癌荷瘤和天真的小鼠脾脏收获并加工成单细胞悬液。幼稚白细胞表面流与Mac-1和GR-1荧光标记的抗体染色流式细胞仪分析，autoMACS富集（一）前。流流式细胞仪分析GR-1 ^+（乙）和GR-1 - ^（）分数后autoMACS GR-1 ⁺细胞GR-1-PE抗体和抗PE的微珠染色汇集天真leuckocytes的富集。流仪分析的MDSC和Gr-1 ⁺百分比后GR-1-autoMACS富集汇集幼稚白细胞（四^）+细胞相比，非浓缩汇集来自荷瘤小鼠的白细胞（五）（天真的小鼠，每组5荷瘤小鼠，N = 3）。门代表的等高线图和直方图的MDSC和GR-1的百分比。

讨论

这是一个详细的方法处理和immunophentyping的MDSC人口，是适用于各种动物模型不同的淋巴组织。特别，autoMACS富集，可用于各种白细胞的人口，包括GR-1枯竭脾^4，从脾和淋巴结肿大⁵粒细胞亚群的净化，分 ​​离骨髓中性粒细胞¹⁴和纯化的CD8 ⁺ T细胞从脾隔离和淋巴结^15。无论所需的淋巴组织产生白细胞的单细胞悬液的细胞群体的利益，需要最佳表面染色，流式?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂	公司	目录号	评论
1X磷酸盐缓冲液	热科学胎牛血清	SH30028.02	的Ca 2 + /镁2 + /苯酚红
白蛋白牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich公司	A7906	让牛血清白蛋白溶解在PBS原状;无菌环境
胎牛血清（FBS），	热科学胎牛血清	SV3001403HI	热灭活;无菌环境
大鼠抗小鼠单克隆抗体CD16/32（FC块）	BD公司	553142	无菌环境
抗鼠细胞CD11b（MAC-1）FITC标记	eBiosciences	11-0112	不育环境
抗鼠Ly6G（GR-1）APC	eBiosciences	17-5931	无菌环境
抗鼠Ly6G（GR-1）PE	eBiosciences	12-5931	无菌环境
的DAPI	Invitrogen公司	D1306	连续稀释无菌环境
细胞分离筛	Sigma-Aldrich公司	CD1-1KT	使用高压灭菌前
70微米过滤器	BD公司	352350	无菌环境
1X红细胞裂解液	eBiosciences	00-4333-57	温暖到室温后使用无菌环境
培养皿	Fisher Scientific则	08-757-12	无菌环境
50毫升CONICAL管	Thermo Scientific的	339652	无菌环境
5毫升12X75mm聚苯乙烯圆底管	BD公司	352054	无菌环境已知流式细胞仪管;
96-V型底板	康宁	3897	无菌环境
台盼蓝	cellgro	25-900-CI	无菌环境
体育微珠	美天旎生物技术	130-048-801	无菌环境
AutoMACS临分离	美天旎生物技术	130-092-545
AutoMACS列	美天旎生物技术	130-021-101
AutoMACS运行缓冲液	美天旎生物技术	130-091-221