高分辨率实时成像发展中的神经上皮细胞的行为

摘要

实时成像胚胎组织挑战过很长一段时间。在这里，我们提出了一个小鸡脊髓细胞和亚细胞的变化，具有高时空分辨率的长期监测分析。这种技术可以适应其他地区的神经系统和胚胎发育。

摘要

胚胎脊髓由骑自行车引起的中枢神经系统（CNS）的神经元和神经胶质细胞的很大比例的神经祖细胞。虽然被称为格局脊髓的分子机制，并引起神经细胞的分化^1，2，我们还缺乏深刻的理解了这些细胞的行为水平的早期事件。为他们进行神经再生研究实时的神经祖细胞的行为，因此，这是关键。

在过去，实时成像早期胚胎组织细胞/组织的可行性以及在文化荧光成像的光毒作用受到限制。在这里，我们提出一种新的分析，长时间成像等组织利用一种新型的体外片文化协议和宽视场荧光显微镜（ 图1）。这种方法实现长期鸡胚S的时间推移监测高时空分辨率的的皮纳尔线与祖细胞。

此法可修改一系列胚胎组织^3，4，除了观察细胞和亚细胞的行为，发展新型基因活性和高度敏感的记者形象（例如，Notch信号^5）使此法了解如何信令与强大的工具，调节胚胎发育期间细胞的行为。

研究方案

1。菜的制备

1. 用于片文化的菜玻璃底船（作为基地盖玻片）（WillCo菜）。这些都是摆在镜头上组织了6厘米的组织培养皿，保持干净的玻璃底部。
2. 在实验前的一天，加2毫升0.1％的聚-L-赖氨酸的解决方案，以平底的玻璃盘在室温下孵育5分钟，让聚-L-赖氨酸涂层的玻璃底部。
3. 删除聚-L-赖氨酸的解决方案，并在去离子水冲洗三次，再一次在70％的乙醇。
4. 离开干通宵。菜也可以干，轻轻在低功率微波加热30-45秒。

2。胚胎的电穿孔

1. 37鸡蛋在孵化°C间汉堡 - 哈密尔顿（HH）阶段10（〜36小时）（或其他所需的阶段）。
2. 开始之前准备玻璃针（我们使用火焰/布朗模型P87微毛细管拔），打破了尖端的needlE使用在解剖显微镜下细的镊子。针到底应该足够清晰地刺穿，而不是如此狭窄，阻碍DNA溶液注射的胚胎。
3. 胚胎两侧的窗口鸡蛋和地方电极（5毫米外）
4. 成神经管，注入的DNA（0.025 - 0.5微克/μL去离子水与少量的快速绿色着色）。
5. 适用于电流 - V THREE 12-17倍，与脉冲之间的950毫秒，50毫秒脉冲长度。
6. 我们使用低浓度的DNA和低电电压来实现马赛克，使我们可以按照单个细胞的表达。
7. 覆盖在蛋壳的窗口cellotape，并确保它是密封的。
8. 允许胚胎为3-4小时或隔夜恢复在37°C。

3。胶原蛋白和切片培养基制备

1. 前准备切片胶原蛋白组合和片约一个小时的培养基。
2. 到300微升ţYPE 1胶原蛋白加入100微升0.1％乙酸溶液和100μL5×L15培养基。每次加入后彻底涡。该解决方案应该变黄。
3. 现在加入15-20微升7.5％碳酸氢钠，彻底旋涡。解决方案应该成为略带粉色的，这需要碳酸氢钠量可能会有所不同。保持在冰上，并作出新的每一次。
4. 到10毫升的Neurobasal培养基中添加的B-27补充和Glutamax的，1×终浓度为10μL庆大霉素溶液。
5. 地方在37℃孵化介质缓冲5％的CO _2。离开容器的顶部松动，使其能够平衡的CO _2。

4。片文化

1. 从鸡蛋中取出胚胎和L15培养基洗。
2. 在组织培养皿中，在底层和sylgard引脚通过周围的多余胚胎膜出来，使他们都拉直的地方。
3. 使用一个麦克风roknife，通过地区的利益，尽可能地直片胚胎。脊髓，切片厚1-2体节之间。离开胚胎切片，当你切其他的胚胎，这样你就不会失去他们。
4. 准备切断〜1毫米的小费和附加到P2或P10 200μL微量尖。这篇文章将被用来传输脊髓片玻璃底菜。 10μl的秘诀是不广泛，足以拿起片。
5. 大衣内的胶原吸取1μL胶原混合，提前准备的一角。离开1-2分钟，然后用L15培养基冲洗。这将防止从坚持以尖端的内部组织。
6. 分离使用microknife的胚胎切片和删除使用装有200μl的尖端，并设置为1μL的P2或P10的菜。尝试以尽可能少的介质。
7. 涡胶原蛋白的结构和降5-8μL这对聚-L-赖氨酸涂层菜。
8. immediately到位胚胎切片一双细镊子将胶原蛋白和位置。片的位置应使成像的一面是用盖玻片冲洗。组织应坚持以聚-L-赖氨酸涂层盖玻片。
9. 重复此盖玻片上，直到你有几片。我们通常可以把一盘6-9片。
10. 一旦所有的片到位，盖菜，让胶原蛋白为20分钟。最早放置的胶原蛋白，有些人可能已经开始干涸。为了防止这种情况添加少量的L15这些前覆盖。
11. 一旦设置，小心加入2ml片培养基一直平衡在37°C在5％CO _2，至少一个小时。必须小心，不要接触从盖玻片的胶原蛋白。
12. 1 37°/ _5％CO2培养箱的地方，并允许片恢复至少3个小时前成像。如果是没有湿度，在有机玻璃盒子机智的地方菜公顷的湿纸巾位在一个角落里。

5。成像胚胎切片

1. 我们使用1 DeltaVision核心的宽视场显微镜与环境WeatherStation室安装图像片。室经常保持在37°C，与CO ₂灌流装置维持在5％CO _2/95％空气显微镜阶段。
2. 通常进行成像采​​用40×/ 1.30 NA油浸镜头和图像捕获与CoolSnap HQ2冷却CCD相机。
3. Z轴部分被捕获每1.5微米至45微米的组织。应保持尽可能低的曝光时间。我们通常会为每个Z-节公开为5-50毫秒。拍摄的图像，每7分钟，并使用该DeltaVision系统的精确点访问功能，可以参观到9片。

6。代表结果

脊髓祖细胞的一个例子时间推移顺序是如图。 2a和相应的电影1。影像开始在为期两天的岁（时时阶段12）胚胎的脊髓切片。这种细胞转染与表达GFPαTubulin结构。在这个早期阶段，神经祖细胞经历主要是在此期间，细胞分裂产生两个进一步的循环内皮祖细胞的祖祖模式师图。 2b和相应的电影2显示了一个细胞转染绿色荧光蛋白，磷脂（GPI锚，GFP）标记细胞膜。这种细胞经过表决，在此期间，基底的过程分成两个子细胞同样继承。

图1。时间推移成像片文化协议。

图2。单元Behavior在正常脊髓开发。（一）选定的帧从电影1。 GFP-微管蛋白表达细胞分裂与切割面是垂直的根尖表面（2小时20分钟），产生两个子细胞再次分裂（24小时23分钟和25小时54分钟）。 （二）从电影2选定的帧。与GFP的GPI转染细胞进行细胞分裂期间，基底过程被分割（白色箭头）和同样由子细胞继承。

电影1。 点击这里观看电影 。

电影2： 点击这里观看电影 。

讨论

我们在座的一种新型的时间推移成像法监测细胞在鸡胚胎切片文化行为。此法可长达70个小时的活组织高分辨率成像，虽然24-48小时之间的时间框架是更容易捕捉。使用高NA石油的目标和时间点之间的相对短的时间间隔，使图像采集分辨率高，以及允许我们监视细胞的行为，常常迅速发生，并可以很容易地错过了在常规时间推移，利用共聚焦成像显微镜。

此法的主要优点是通过长时间的图像细胞的能力。宽视场^{6 7}显微镜激光共焦扫描，而不是使用，这是至关重要的。共聚焦显微镜历来提供了宽视场显微镜的诸多优势，包括采取的光学部分直接消除重点信息的能力 ^{7，但使用针孔导致亏损的光探测器8，不包括相当数量的信息，需要更长的曝光时间。另一方面，宽视场显微镜，使用全域照明，通过客观的光通过发送的探测器。这具有很高的量子效率的耦合冷却电荷耦合器件（CCD）相机相比，共聚焦显微镜，具有非常快的曝光时间，信噪比高信号，确保成像。在我们的应用程序中，我们必须长时间纪录的3D堆栈和最终解决小近衍射有限结构的图像。虽然共聚焦显微镜防止焦永远到达探测器的光，从而显着降低的背景中厚，密集的标记样品7，8，它只是一个可用的信号噪声比达到更大的光输入比宽10场显微镜。对于非常敏感的光sparsel像我们的电穿孔的脊髓切片Y-标记的样本，因此，宽视场显微镜的性能优于共聚焦显微镜。当由卷积相结合的图像恢复，消除了重点信息，提高对比度，宽领域，然后是特别小，11物昏花的检测。虽然并不适合每个组织成像实验，这种方法已经为我们的活细胞成像中的应用非常有效。}

荧光蛋白的选择是一个重要因素，可以影响细胞的存活。我们发现，获得最好的结果是从结构作为标记使用绿色荧光蛋白^{（GFP）12。}目前，我们正在评估一系列的红色荧光蛋白GFP双通道时的失误，可以有效地结合使用。有多种可用这种蛋白质^13。虽然许多蛋白质​​稳定与荧光蛋白融合，一些蛋白质可能呈现不稳定的融合，从而导致细胞活力下降。在这种情况下，使用包含一个内部核糖体进入位点（IRES）的结构是非常有用的荧光蛋白分离蛋白。

当成像脊髓切片，必须小心，以尽量减少暴露于荧光灯。必须使用显微镜目镜透射光（明）片定位和位置。荧光图像应始终获得使用显微镜软件，使用最小的曝光时间。这些应保持在5-50毫秒范围内，应尝试使用中性密度过滤器。虽然更长的曝光时间，最初可能会产生更清晰的图像，荧光灯光线照射的光毒作用，可能导致细胞死亡。第一5-10组织最接近盖玻片微米的不应成像作为本地区包含组织可能已损坏切片。

虽然这里给出的例子是在农户阶段10和影像6-7小时后电穿孔胚胎，这种方法可用于对胚胎HH阶段18。在稍后阶段，脊髓组织大得多，因此很难通过手工切片。在这些情况下，嵌入在低熔点琼脂糖胚胎与vibratome切片可能会产生更好的效果。即使我们提出此法作为一个发展中的脊髓成像细胞的方法，这种方法也被修改图像等胚胎组织，包括感官placodes ^3。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂	公司	目录编号	评论
WillCo美食	WillCo井	GWst-3522
聚-L-赖氨酸	西格玛	P8970	在Tris 0.1％
硼硅玻璃毛细管	哈佛仪器	GC100-10	1.0毫米外直径， 0.58毫米内直径
电极（Genetrodes， 大毛，L形	A型肉毒毒素	10-001850-01	5毫米镀金
流脑830平方脉冲发生器	A型肉毒毒素	45-0002	在OVO electroopration，
快绿	西格玛	F7258
I型大鼠胶原	西格玛	C3857
L-15的介质（粉）	西格玛		2.76克/ l在蒸馏水 5倍的解决方案
碳酸氢钠	西格玛	S8761	7.5％的解决方案
的Neurobasal培养基	Invitrogen公司	12348-017	无酚红
glutamax	Invitrogen公司	A1286001	100X的解决方案
的B-27的补充	Invitrogen公司	17504-044
庆大霉素	Invitrogen公司	15710049	10毫克/毫升
L15培养基（液体1X）	Invitrogen公司	11415-049
microknife	Altomed	A10102	15度倾斜
不锈钢无头管脚	沃特金斯和唐卡斯特	E6871	A1尺寸
sylgard 184弹性体	厂商VWR	634165S
DeltaVision核心显微镜系统	应用精密
coolsnap HQ2 CCD相机	photometrics