临床试验和脊髓去除在肌萎缩性侧索硬化症的小鼠模型（ALS）

摘要

一个肌萎缩性侧索硬化症（ALS）的小鼠模型研究，临床和行为。作为一个伴随的免疫组织化学分析的前提下编制的脊髓详细描述。

摘要

肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）是一种致命的神经退行性疾病导致运动神经元逐渐退化。零星的疾病，约50多年的家族性疾病的发病高峰是60岁。由于它的前进方向，50％的患者症状发作后30个月内死亡。为了评估这种疾病的新型治疗方案，基于对人类家族中的超氧化物歧化酶基因突变的SOD1（G93A）突变，如ALS的遗传小鼠模型已产生。最重要的方面，必须评估模型是整体存活率，临床过程和运动功能。在这里，我们证明了临床评价，显示两种行为的电机测试的传导，并提供所有参数的定量评分系统。因为在ALS小鼠模型的深入分析，通常需要的脊髓免疫组化检查，我们展示了其应用做准备详细RSAL椎板方法。模范病理结果证实。 ALS小鼠模型的研究中描绘的检查方法的综合应用，将使研究人员能够可靠地测试未来的治疗方案，它可以提供一个为以后的人体临床试验的基础上。

研究方案

动物购自杰克逊实验室^{（＃002726）1。}他们在临床上得分和遭受的运动功能（旋转试验），肌力（悬丝试验）测试。所有这些测试，并以准备脊髓后杀害动物已按照非常接近当地的指引适当进行动物实验。

1。临床评分

除了 ​​体重小鼠的评估检查以下4点计分制²电机赤字的迹象：

4分：正常（无运动功能障碍的迹象）

3点：后肢震颤是显而易见的，当尾巴暂停

2分：步态异常是目前

1点：至少有一个后肢拖

0点：对称瘫痪，不能以自己的权利或损失最大体重的20％;在这种情况下，立即安乐死动物实验终止

2。运动功能和肌肉力量的测试

吊线

这个测试是用来评估肌力^3，4。所有的动物进行旋转试验后，至少有一至两天的测试。每个鼠标被放置在一个0.8厘米的间隔定制丝盖和谨慎天翻地覆，60厘米以上的稻草覆盖的底部。经过培训至少180秒连续三次下降的延迟测量。每个鼠标三次尝试举行倒盖一个180秒的最高和最长记录。

旋转试验

3，4。良好的性能，需要高度的感觉协调。本机应放置在一个平静和非令人不安的环境，以避免对试验动物的牵张刺激。它由计算机控制的电动机驱动旋转主轴和五鼠五车道。小鼠的瀑布是在底部的塑料板自动检测压力。培训后连续三年至少有180秒的时间，在15转的时间，动物可以保持旋转杆的恒定速度进行了测量。每个动物都经历了三个试验和最长潜伏期，没有下降记录。被选为截止时间180秒的时间，在这段时间内检测，因为大多数的动作协调性的显着性差异。

3。脊髓制备

1. 动物被杀害的CO ₂气腹，根据当地的指引立即transcardially灌注4％多聚甲醛溶液PBS溶液。
2. 为了准备牺牲鼠标的脊髓，动物被放置到一个操作表和四肢上侧固定，为了揭露鼠标的背面。
3. 一个短洗了70％的乙醇溶液清洗清扫现场，平坦的被毛。
4. 用锋利的手术刀在中线皮肤切开。为了方便切割皮肤向两侧伸展。如果腿部肌肉应做好准备，他们的皮肤也被切开。
5. 皮肤切口完成后，被拉到一边，一个镊子，暴露身体的底层浅筋膜。
6. 颈部肌肉和颈部韧带被删除，是CArefully准备。要小心，不要切开深入病灶脊髓。肩膀肌肉也可以被删除，以便更好地暴露脊柱。
7. 然后从整个脊柱椎旁肌。
8. 为了打开脊柱几个laminectomies必须执行。每个人都应该从颅上的部分，在寰枕关节部位。
9. 这是最简单的删除上两肢固定和量力的颈部，能够更好地执行第一腰椎椎板。这些被拉走，而不触及暴露的脊髓型颈椎病。
10. 更多的椎骨被删除第一横断直角剪刀两侧椎拱门，然后拉背进程。应删除余下的椎骨的侧部，便于以后的脊髓完全去除。
11. 腰脊柱的解剖标志升线是在颈髓，这也是目前的肿大。
12. 说完整个脊髓椎板，确保你也横切所有腹侧根和释放脑膜脊髓硬膜。
13. 然后颅颈脊髓被切断，你开始清除脊髓。
14. 最后在远端马尾，马尾也切断脊髓完全释放。
15. 最终，脊髓被放置到postfixating解决方案（如4％多聚甲醛）过夜，并可以进一步处理。我们通常冰冻切片脊髓免疫组织化学分析准备。

4。代表结果

脊髓制备技术代表本视频文章的重点。这是一个必不可少的先决条件，为以后的组织切片和免疫组化分析，最终为脊柱升线部分。作为最终结果的一个例子，鼠标的前角区域的鼠标一个野生的脊柱脊髓腰（WT）和免疫组化的SOD G93A转基因（TG）相关检验证明。运动神经元，可确定一个主抗胆碱抗体和随后的次要Cy3标记抗体荧光标记。此外，用DAPI（4,6-diamidino-2-苯基）核反污渍已完成（ 图1）。

可视化与抗胆碱抗体（红色）和反染色细胞的细胞核用DAPI（蓝色）的野生型（WT）鼠标腰脊髓前角（左）和运动神经元的免疫检测的荧光显微图1。 G93A转基因是一种SOD（TG）（右）在130天的年龄鼠标。比例尺：40微米。

由于免疫组化分析G93A小鼠的超氧化物歧化酶是不是这篇文章的主要范围，请咨询原始出版物在这些转基因小鼠已特点和治疗方法的研究进一步参考文献^1，5，6最近的。如果治疗效果，应区分明确了免疫组化水平定量评估算法应适用于支持由体视软件（例如见^7）。

讨论

的SOD1（G93A）基因小鼠模型是一个有价值的动物模型，研究病程渐进的运动神经元的损失相比，人类肌萎缩性侧索硬化症^8。在这个模型中，各种不同的治疗模式已被评估，并表示以后在人类的临床研究^8-10测试的基础上。为了能够检测这些小鼠的实验治疗研究中的显着性差异，这是著名的重要性，包括至少24产仔匹配的性别平衡相同的遗传背景的小鼠和遵循双盲设计^8。媲美...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
	生产厂家	订购信息
行为测试
对小鼠的旋转杆	乌戈·巴西莱，Comerio，意大利	＃47600
吊线装置	定制
脊髓制备
操作表 操作灯 防护手套
“鸢尾花”剪刀，到另一边的角度	精细的科学工具，德国海德堡	14063-09
科恩的Vannas弹簧剪刀，直	精细的科学工具，德国海德堡	15000-10
微型镊子	hammacher，索林根，德国	HWC 111-10
手术刀“präzisa加”	dahlhausen，科隆，德国	11.000.00.510，图10