糖基谱研究植物细胞壁聚合物，用微阵列

摘要

一种称为 C omprehensive M icroarray P olymer探查（CoMPP）植物细胞壁聚糖的特性进行说明。该方法结合了与一个微型芯片分析平台允许筛选聚糖发生在一个广泛的范围内的生物上下文定义的聚糖-抗原决定簇特异性的单克隆抗体。

摘要

植物细胞壁复杂的异构聚糖在生理和植物的发展，并发挥了重要作用，提供原料，为人类社会（ 如木材，造纸，纺织，生物燃料行业^）1,2矩阵。然而，这些成分的生物合成和功能的了解仍然充满挑战。

细胞壁聚糖的化学性质和构象不同的复杂的构建块，糖基。这些形式在多个位置之间的联系，并在环结构的不同，同分异构体或端基异构体的配置，此外，被取代的与非糖残基的一个数组。糖基组合物在不同的细胞和/或组织类型或什至单个单元格的壁^3的子域变化。此外，它们的组合物¹在开发过程中，或在响应于环境线索⁴也被修改。

在EX制程的2000基因植物细胞壁异构聚糖被预测要参与细胞壁聚糖的生物合成和修改在拟南芥 ⁵是复杂的矩阵。然而，相对较少的生物合成基因功能特点^4,5。反向遗传学方法是困难的，因为基因通常差异表达，往往在低的水平，细胞类型之间的^6。此外，突变体的研究往往阻碍了的基因冗余或代偿机制，以确保适当的细胞壁功能是保持^7。因此，新的方法，需要迅速表征各种不同的聚糖结构和功能基因组学的方法，以方便了解细胞壁的生物合成和修改。

单克隆抗体^（mAb）8,9已成为确定在植物中的糖链结构和分布的重要工具。这些识别区INCT抗原表位存在于植物细胞壁聚糖的主要类别，包括的果胶，xyloglucans，木聚糖，甘露聚糖，葡聚糖和阿拉伯半乳聚糖。最近，他们的使用已经扩展到大规模筛选实验，以确定相对丰富的多聚糖广泛的厂房及组织类型，同时^9,10,11。

在这里，我们提出了一种基于微阵列聚糖的检查方法，使多个样本的全面的微阵列名聚合物的分析（CoMPP）（ 图1和图^{2）10,11（100}秒）进行筛选，使用小型化的芯片平台，减少了试剂和样品量。在微阵列上的点信号可以正式量化约聚糖抗原表位发生，得到半定量数据。这种方法非常适合于跟踪聚糖变化的复杂的生物系统^12，并提供一个全球细胞壁的组合物的概述，特别是当先验知识òF这是不可用。

研究方案

1。组织收集和准备

1. 收集100毫克植物组织的鲜重（至少10 mg干重）的至少一式三份的每个组织的利益。以下步骤描述了从植物组织中的细胞壁物质的准备。在存储组织的情况下，不想要的淀粉酶进行提取细胞壁聚合物如先前所述¹³之前除去。
2. 均质化样品使用Qiagen公司的TissueLyser II，24管适配器集和3毫米的碳化钨珠（30赫兹，2×30秒），用液氮成细粉。或者，如果只有少数样本正在处理中，使用研钵和杵。
3. 匀浆转移到10 ml塑料锥形管。
4. 准备细胞壁材料洗涤匀浆在10毫升80％v / v乙醇在RT和涡旋大力，持续2分钟。
5. 在3500 XG离心样品，弃去上清液。重复的70％乙醇洗涤至少3次，或直到上清液是清楚的，特别是对于含叶绿素的组织。
6. 执行最终用100％丙酮洗涤和离开的粒料含有酒精不溶残留量（AIR）空气干燥过夜。
7. 筛为0.4毫米²目，实现了精细，均匀粉末，能够去除较大，不良一段时间保持匀浆中的颗粒的空气样品。
8. 称取10毫克AIR范例成微管，每个都包含一个3毫米的玻璃珠以帮助混合样品。

2。细胞壁聚糖的提取

1. 从样品中提取的果胶，和与果胶的聚合物由向每个样品中加入500微升50μM的CDTA（pH为7.5）。
2. 简言之涡管，以确保溶剂是在与样品材料接触，然后混合3小时8赫兹TissueLyser使用。
3. 以12,000 xg离心样品，仔细ŕemove上清并储存在4°C
4. 洗净粒料在1毫升的去离子水，以稀释和除去任何剩余的溶剂，旋涡和在13000×g下离心。重复此步骤，而不会干扰颗粒，并删除所有的液体从管，然后再进行下一个步骤。
5. 从其它细胞壁颗粒的交联聚糖中依次提取用500μl的4M的NaOH，用0.1％w / v的硼氢化钠，使用相同的程序中描述的步骤2.1 - 2.4的CDTA提取。加入NaBH ₄被添加到减少的醛（或酮）基团的多糖的还原性末端的醇，从而防止基多糖的剥离。
6. 离心后，再次除去上清液，在4℃下储存，​​并继续到下一个提取之前，该颗粒在去离子水洗涤两次。
7. 作为一个可选步骤，剩余的聚合物，如纤维素，用500μlcadoxen（31％体积/体积1,2-diami萃取noethane与CdO的0.78米），使用相同的程序中描述的步骤2.1 - 2.4。或者，其它粒料绝对纤维素含量可确定使用乙酸/硝酸法（见讨论）。

3。印刷微阵列

1. 在13000 XG离心上清液中提取的细胞壁聚合物，以去除任何颗粒物质。
2. 将每个样品的50微升到聚丙烯384孔微量滴定板使用一个预先设计的自定义布局根据组织类型和提取类型的样品被布置。
3. 在0，5和25×串行系列稀释液，用去离子水稀释的细胞壁聚合物样品。
4. 如针高度，收集和停留时间，和洗涤步骤的参数设置的软件控制的微阵列上。
5. 印刷室的湿度控制在60％，以防止样品的蒸发。
6. 被开始使用LabNEXT软件，打印作业re和一个程序，它对应于微阵列布局。
7. 机器人使用的毛细通道引脚，20×20厘米的硝酸纤维素膜在机器，其安装在一平板，从样品板到打印的解决方案。在阵列上的每个点包含15个NL解决方案，并打印一式三份。
8. 相同的微阵列上的膜和切成单个阵列彼此相邻的印刷后的打印作业完成后。
9. 在每个实验中的阵列可以被修改，以容纳更多或更少的样品，稀释或复制。

4。聚糖微阵列技术探讨

1. 印刷后，阻止个别芯片在5％w / v的脱脂奶粉溶解于磷酸盐缓冲盐水（MPBS），在室温下2小时，以减少非特异性结合。
2. 与细胞壁聚糖抗原决定簇特异的单克隆抗体2小时，在MPBS探针微阵列。的大多数单克隆antib的对细胞壁聚糖odies是从三个公司市售; Biosupplies（ www.biosupplies.com.au ），Carbosource服务（ www.carbosource.net ）和PlantProbes（ www.plantprobes.net ）。
3. 包含一个阴性对照，仅MPBS没有主抗体孵育的微阵列。
4. 微阵列洗净3次，在磷酸盐缓冲盐水（PBS）5分钟，以除去非特异性结合。
5. 探测芯片与二次抗体结合到辣根过氧化物酶（HRP）在2小时的MPBS。对细胞壁聚糖需要大多数单克隆抗体抗小鼠或抗大鼠二次抗体。
6. 重复3次，用PBS缓冲液中5分钟的洗涤步骤，以除去非特异性结合。
7. 开发微阵列使用显色（3,3 - 二氨基联苯胺）或切米尔uminecent（鲁米诺）基板。

5。量化

1. 经过发展，个人微阵列采用了高解析度（1200 dpi）的桌面扫描仪扫描并保存图像为负，16位TIFF文件（ 图3）。
2. 计算Xplore数据库图像处理软件（LabNEXT），配有自动网格工具使用的每一个点的积分强度。积分光斑强度来自周围各点的格子区域中的像素的总和。
3. 每个芯片的网格数据导出为txt文件，并可以手动导入到Excel电子表格进行分析。在线的工具（ http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ ）已被自动翻译和处理从单个txt文件中的数据。
4. 的积分光斑强度的平均印刷复制和稀释以获得一个“平均的点对每个样品的强度的值（ 图2）。可选地，对应于阵列上的值只是一个稀释的点信号是用来量化聚糖抗原表位相对丰度对每个样品。
5. 平均相对强度不同样品之间的点作为热图（ 图4），使用条件格式在Excel或网上的heatmapper的工具（ http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ）。对每个抗体类型的数据被校正到100，和5％的临界值被施加来去除背景信号和误报。

结果

的相对丰度聚糖在烟草阿拉塔花6个类型的组织（花药的花丝，花粉，子房，花瓣，萼片和耻辱）被确定使用CoMPP。图3A示出了有代表性的微阵列已与mAb JIM5部分（低）的甲基酯化homogalacturonan（HG），果胶多糖¹⁴上发生的表位特异的探测。 CDTA提取物中检测到的所有花组织JIM5表位不过是最高的，在花粉和最低的柱头组织（ 图3A和4A）。有趣的是，JIM5表位也检测到在NaOH在花?...

讨论

分析的聚糖组成的数百植物性样品在短短几天内，CoMPP是一种快速，灵敏的方法。此方法的补充已经可用的细菌或哺乳动物聚糖阵列平台与多糖结合的蛋白质，如外源凝集素，受体，和抗体¹⁶的碳水化合物的相互作用的高通量筛选。随着多样性的探头可用于检测细胞壁聚糖，它有可能获得糖链抗原表位属于多糖在植物细胞壁^8,9的所有主要类别的详细信息。然而，这些已查明的^8,9...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号	评论（可选）
3毫米碳化钨珠	Qiagen公司	69997
收集管（1.2毫米）	Qiagen公司	19560	1.5毫升微量离心管中，也可以使用
Qiagen公司的TissueLyser II	Qiagen公司	85300
3毫米的玻璃珠	Sigma Aldrich公司	Z143928
CDTA	Sigma Aldrich公司	34588
氧化镉	Sigma Aldrich公司	202894
1,2 - 二氨基乙烷	Sigma Aldrich公司	03550
硝酸纤维素膜（0.22微米孔径大小）	GE水处理及工艺过程技术	EP2HY00010	不同孔径大小的膜适用于不同的引脚类型
XACT的II微阵列机器人	Labnext	001A	XACT的II机器人装有一个自定义的20×20厘米陶瓷板附着的硝酸纤维素膜
XTEND RM芯片引脚	Labnext	0037-350	引脚必须适合用于探测细胞膜上的
384孔微量滴定板（聚丙烯）	格雷纳	781207
反聚糖单克隆抗体	植物探头/ CarboSource / Biosupplies		网站PlantProbes（ www.plantprobes.net ），Carbosource（ww.carbosource.net“目标=”_blank“> www.carbosource.net）和Biosupplies（ www.biosupplies.com.au ）。
的抗大鼠IgG（整个分子） - 过氧化物酶的山羊生产的抗体。	西格玛	A9037	二次抗体的类型依赖于使用的初级抗体（ 例如大鼠，小鼠，山羊等中提出）。
SIGMA FAST 3,3' -二氨基片	西格玛	D4293	显影试剂的类型，取决于使用的二次抗体和检测方法（色彩值，或chemiluminecent的的）。
SuperSignal West Pico化学发光底物	Thermoscientific	34080	看到以上
Xplore数据库图像处理软件	LabNext	008	自动网格工具是许多软件类型微阵列点的像素值来衡量。
植物多糖	SIGMA / Megazyme的