复发性单纯疱疹性角膜基质性角膜炎小鼠模型研究人类HSK

摘要

疱疹性角膜病变的大多数研究使用的主要感染模型。然而，与HSV-1的原发感染通常不导致人类疾病。在这里，我们描述了一个经常性疱疹性角膜病变，更加紧密地模仿人类疾病模型。

摘要

疱疹性眼部疾病，被称为疱疹性角膜基质炎（HSK），是一种潜在的致盲的角膜感染，超过30万的临床治疗每年访问的结果。 1至2％的临床疾病的患者将体验到失去视力的角膜受感染的。这些案件的绝大多数是由疱疹病毒潜伏感染的激活单纯I型病毒，而不是由于急性疾病。有趣的是，在急性感染是最经常被用来研究这种疾病的模型。然而，有人认为，汉语水平考试将是一个经常性的模型更能反映过程中所发生的临床疾病。经常性的动物模型，为HSK，兔子和老鼠。兔子的优点是，他们的经验重新从潜伏期没有任何已知的刺激。这就是说，它是艰难探索的作用，许多免疫因素在复发性HSK，因为兔模型没有IMMUN，，目的论和遗传资源的鼠标。我们选择使用的小鼠模型，因为它具有复发性HSK的优势，有许多资源，也是我们知道什么时候就会重新激活，因为重新激活诱导暴露于UV-B光。到目前为止，这种模式已使这些实验室用它来定义一些免疫方面的因素，这种疾病是非常重要的。它也使我们能够测试治疗和疫苗的有效性。

研究方案

动物保健注：在这个模型中不使用止痛药，因为它们是抗炎和无效的模型。

1。制备病毒

1. 成长HSV-1在Vero细胞（80％汇合），使用0.01多重感染（在T-150烧瓶中，约5×10 ^5个噬斑形成单位）的起始稀释3-4天，直到所有的细胞都四舍五入容易脱落击中烧瓶中。
2. 删除媒体无菌离心管中，离心SORVALL传奇RT在4°C和3500转每分钟为15分钟。取出后上清液（见1.3），重悬大颗粒从每次50毫升管，用5毫升的媒体总。超声清洗1分钟，在两个30秒的爆发。
3. 去除上清液，并放入50毫升无菌橡树岭管和离心机以9,000 rpm，1小时，在4℃下在Beckman J2-21离心机。这是一个产生一个小的病毒颗粒。弃上清。
4. 1.2机智结合超声Ĥ颗粒从1.3和超声再次，持续45秒。离心机在联想RT SORVALL在1500 rpm离心5分钟，在4°C。保存上清液。这构成的病毒原液等分并存储在-70℃下
5. 滴度的病毒在Vero细胞上。我通常盘10 ⁰ 10 ^-8稀释液（10倍稀释）2个2个独立的稀释套。 12孔无菌板进行病毒滴定。

2。小鼠感染

1. 每只小鼠注射麻醉cocktail/20克小鼠体重用0.1毫升（60毫克/千克氯胺酮，+甲苯噻嗪5毫克/公斤，在HBSS稀释）。这种鸡尾酒是因为它是最安全的麻醉方法时，使用适当的剂量和药物的影响，这是非常短命的。
2. 当小鼠麻醉划伤角膜的右眼用30号针，用解剖显微镜，以确保，角膜是不穿孔的。
3. 每个鼠标RECEived汇集的人血清（Sigma公司，加利福尼亚州特曼库拉，抗-HSV反应性的有效剂量为50％的病毒中和为1:800），以保护角膜从原发性感染的过程中损坏的腹腔内注射1毫升。
4. 无论是耳夹或耳冲数的老鼠。
5. 后，所有的小鼠都被编号;使用20微升移液器，我们用10 ⁶ PFU（5μl）中感染每只眼睛。我们只感染一只眼睛和通常右眼。我们也将5微升的HBSS另一只眼睛保持湿润，而他们麻醉。星ul是因为程序执行在少于10分钟，和动物相应的与麻醉剂量，足以维持水合眼睛。在确认感染了通过抽汲小鼠感染后第3天，用无菌棉棒1毫升的Vero介质中水合。然后加入100μl添加到在48孔板中生长的Vero细胞。这些板块监测每天的细胞病变效应 （CPE）。

3。恢复从潜伏期小鼠

1. 小鼠麻醉后至少5周原发感染。应当指出，我们已重新小鼠至一年以下的原发感染，并没有观察到显着的不同的反应。
2. 一旦麻醉，它们被放置TM20色谱Vu所属透射，它发出的UV-B的峰值波长为302 nm，使得只有一个单一的眼睛暴露于UV-B的光。每只小鼠暴露在250毫焦耳的UV-B光厘米^2。
3. 重新激活，确定1毫升的Vero媒体中，首先被放置在第0天（之前的UV-B的曝光控制的自发的推料机），然后在1至7天UV-B照射后用无菌棉棒擦拭眼睛。该拭子材料被评价为在2.5中描述）。对于那些具有感染性的病毒的拭子的病毒量窃笑通过标准的空斑测定使用12孔板。

ove_title“> 4。临床评价

1. 一个蒙面的观察员使用的双目解剖显微镜进行评估的临床眼科疾病的小鼠。
2. 角膜混浊评估的规模为0〜4，其中0表示清晰的基质，1表示混浊轻度基质，2表示中度不透明可辨别光圈功能，3表示致密的不透明度与除瞳孔边距，和4的定义的虹膜细节损失表示总不透明度与无后视图。
3. 新生血管的额定除以角膜分成4个相等的象限，以及确定在每个这些象限血管生成的程度上的范围为1至8。
4. 睑缘炎的测定方法如下：0，无病变，1，最小的眼睑肿胀; 2，中度肿胀和易怒的眼分泌物; 3，严重肿胀，温和眼周脱发，和皮肤损伤; 4，严重肿胀的眼睛结痂关，严重的眼周脱发，皮肤损伤。
5. 脑炎包裹体的证​​据DED驼背，头发竖起，有明显的神经系统异常。小鼠安乐死时，显示明显的迹象脑炎。

5。代表性的成果

如上所述的复发模型首先被出版由Shimeld， 等 ^。1-3。他们测试了，我们的实验室一直在使用这个模型的修改版本发布许多手稿多年来^4-15。该模型被用来定义作用的细胞因子干扰素-γ戏剧经常性HSV-1疾病^10。 如图3所示，缺乏IFNγ显示更糟糕的角膜疾病的小鼠比野生型小鼠^14。它也被用来成功地定义了几个不同的疫苗构建^6,10,11的治疗价值。请注意，在一种情况下，疫苗的测试工作以及预防性但没能证明可有效治疗^6。但是，时，一个的复制不称职的病毒疫苗进行了测试，这是唯一有效的预防，但也是非常有效的治疗^10,11（参考文献10，参见图5）。近来，我们利用该模型，以确定性别差异阳性率分别为小鼠进行经常性的HSK。正如图1表明，雄性C57BL / 6小鼠显示显着角膜混浊少比雌性C57BL / 6小鼠。同样地，当评价角膜新生血管，雄性小鼠表现出显着较少的新血管的生长比雌性小鼠（ 图2）在角膜。我们目前正在测试这种表型是在其他品系的小鼠进行类似的分析菌株特异性。我们也将确定的差是否是由于缺乏的睾丸激素或雌激素的存在。

图1。角膜疾病在男性和女性C57BL / 6小鼠品系UV-B引起的重新启动。潜伏感染的小鼠诱导重新激活与UV-B照射，监测小鼠的35天的角膜混浊。用于这些研究的小鼠的数目如下：男性中，n = 15;女性中，n = 15。结果表明：平均值±SEM。 *显着更大的病毒引起的疾病，在14-35天（P = 0.001〜0.01）的雌性C57BL / 6小鼠。

图2。角膜疾病在男性和女性C57BL / 6小鼠品系UV-B引起的重新启动。潜伏感染的小鼠诱导重新激活与UV-B照射，小鼠角膜新生血管35天监测。用于这些研究的小鼠的数目如下：男性，正= 15;女性，N = 15。结果表明：平均值±SEM。 *显着更大的病毒引起的疾病，在14-28天（P = 0.001〜0.01）的雌性C57BL / 6小鼠。

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讨论

这里的单纯疱疹性角膜基质性角膜炎（HSK）中的经常性模型使研究者研究人类的HSK在一个模型与人类疾病的过程中观察到，更符合。因此，模型的优势是疾病发生的背景下的免疫系统，已经在原发病的刺激。由于这些小鼠已经有HSV-1的免疫反应，重新激活，免疫反应的因素，是可能不同于那些最初生成。因此，治疗性干预，以防止初级HSK并不总是会导致复发性HSK的改善，这是我们在各种出版物进?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Sigma	D5796
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11150
Human Serum	Sigma	S7023
L-Glutamine	Cellgro	25-005-C1
Pen/ Strep	Sigma	P4333
Fungizone	Invitrogen	15290018
Centrifuge	Sorvall	Legend RT
Centrifuge	Beckman	52-21
Transilluminatior	UVP	95-0452-02
Sonicatior	Branson	Sonifier 450
Oak Ridge Tubes	Nalgene	Z 720410
Flasks- 7150	Corning	430823
Plates- 12 well	Corning	CLS 3513
Plates- 48 well	Corning	CLS 3548
Sterile Conical Tubes- 30 ml	Corning	CLS 430828
Sterile Cotton-tipped Applicators	Fisher	23-400-125
30G Needles	Becton-Dickinson	305106
25G Needles	BD	305122
10 ml Syringe	BD	309602
10 ml Syringe	BD	309604