优化细胞分裂监测细胞示踪染料的染色和扩散建模方法

摘要

成功地利用监测免疫细胞的功能和增殖的细胞追踪染料涉及的几个关键步骤。我们描述的方法为：1）获得明亮，均匀，重现性好标签的膜染料; 2）选择荧光染料和数据采集条件; 3）选择一个模型来量化细胞增殖的基础上染料稀释。

摘要

荧光细胞跟踪染料，与流量和图像流式细胞仪组合使用，是强大的工具，与不同类型的细胞在体外和体内研究的相互作用和命运^1-5虽然使用这种染料的出版物有数千个，一些最常遇到的细胞追踪应用包括监测：

1. 干细胞和祖细胞静止，增殖和/或分化^6-8
2. 抗原驱动的膜转移⁹和/或前体细胞的增殖^3,4,10-18和
3. 免疫调节和效应细胞的功能^1,18-21。

市售的细胞示踪染料有很大的不同，它们的化学性质和荧光性质，但绝大多数落入两班的基础上他们的标记细胞的机制之一。 “膜染料”，以PKH26，高度亲脂性染料吨帽子分区稳定，但非共价结合到细胞膜^1,2,11。 “蛋白质染料”，为代表的CFSE的氨基形成稳定的共价键的反应性染料与细胞蛋白^4,16,18。每个等级都有其自身的优势和局限性。他们的成功使用的关键，特别是在多色多种染料的研究被用来跟踪不同类型的细胞，因此，实现最佳的使用每类^{2-4,16,18,24的}了解的关键问题。

这里突出的协议包括三种常见的原因的穷人或不同的结果，当细胞示踪染料。这些是：

1. 未能达到明亮，均匀的，可重复的标签 。这是一个必要的任何单元格追踪研究的出发点，但不同的变量时，用膜染料，而不是用蛋白染料或平衡结合，如抗体的试剂时，需要注意。
2. 次优荧光合并ND /或不包括关键的补偿控制。跟踪染料的荧光一般是10 - 10 ^的3倍亮度比荧光抗体。因此，这是必需的验证，跟踪染料的存在下，不侵入的能力来检测正在使用的其他探针。
3. 没有的峰值建模软件，以获得一个不错的选择 。这种软件可以定量比较不同人群或前体频率或其他指标的基础上刺激的增殖反应。获得一个不错的选择，但是，需要排除的死/死细胞，它可以扭曲染料稀释配置文件和匹配的基本特点，所观察到的染料稀释曲线模型的假设。

这里给出的实施例示出了如何将这些变量可以影响的结果，当使用膜的染料和/或蛋白质，以便监测细胞增殖。

研究方案

1。一般的薄膜标签用PKH26细胞示踪染料（编号25，图1）

1. 使用无菌技术的步骤1.1 - 1.9。准备〜10 ⁷人末梢血单核细胞或淋巴细胞（人外周血单个核细胞，hPBL），此外，最后的300 xg离心自旋使用实验室的标准方法，以尽量减少血小板污染。重悬细胞于10 ⁷个/ ml，在HBSS 1％BSA中，置于冰上，保留500μl的等分试样（5×10 ^6个细胞），在步骤2中使用。
2. 地点5×10 ^6个细胞（500微升）在12×75毫米同轴的聚丙烯管中。用3.5毫升HBSS洗涤一次。小心吸出上清液，留下残留的液体不超过15-25微升，但小心不要删除单元。使用此管准备2倍的细胞悬浮液的步骤1.4。
3. 在细胞洗涤在步骤1.2中，加入0.5ml的稀释液的Ç标签车辆（从PKH26GL套件）一个12 x75毫米的圆锥形的聚丙烯管中。使用此管的准备2倍的PKH26解决方案，步骤1.5。
4. 洗涤后的细胞沉淀中加入0.5毫升稀释液的的Ç标签车辆从步骤1.2和吸液和分配的3-4倍，得到单细胞悬浮液（2×细胞）。避免泡沫的形成和过度的混合，这可能会降低细胞活力和恢复。
5. 后，立即在步骤1.4中制备的2倍的细胞悬浮液中，准备了2倍（4μM）染料溶液中加入2.0微升1.0mM的PKH26染料库存在乙醇（从PKH26GL套件）的稀释液的制备在步骤1.3和旋涡的C管均匀分散。
6. 步骤1.5后，立即准备2倍的染料溶液，迅速 ​​移液管的2倍细胞悬浮液从1.4到2倍的染料溶液步骤，并同时吸液和分配的3-4倍，完全分散细胞的染料。 不要加入1.0毫米染料直接细胞;倒到2x染料的2个细胞，或增加2个细胞的2倍，而涡旋式染料。由于染色几乎是即时的，这种方法产生统一强度比推荐的方法（ 图2）。
7. 1分钟后，加入1.0毫升的热灭活血清或HBSS 5％的BSA停止染料吸收到细胞膜。如果使用足够的蛋白质，形成染料聚集体，颗粒细胞在洗涤步骤，导致意想不到的标签与其他细胞的实验中存在的风险。如果与10％热灭活血清（CM）或HBSS 1％BSA的介质是被用来作为停止的试剂，在15毫升锥形聚丙烯管中进行染色，并添加至少为5.0毫升停止试剂，以确保所有的吸附未掺入的染料。
8. 标记的细胞离心5分钟@〜400×g下。小心吸出上清液，而不删除单元。洗涤沉淀两次用4毫升CM或HBSS 1％BSA的，分散粒料之前recentrifugation的。为了尽量减少残留的染料吸附在管壁上，最大限度地提高洗涤效率，转移到一个新的聚丙烯管细胞后，网络连接第一个悬浮。注：充分染的细胞会表现出不同的颗粒粉红色的色调。
9. 洗过的细胞沉淀重悬在1.0毫升的HBSS 1％BSA。计数细胞，测定细胞恢复，以及调节音量，得到的最终浓度为10 ⁷个/ ml。通过仔细的愿望，电池回收应≥85％。如果细胞恢复<70％时，应查明原因，然后再继续。提款150微升等分试样（1.5×10 ^6个细胞）和在步骤2中使用的在冰上地方。

2。制备仪器和实验设置控制（ 表1）

1. 等分试样50微升^{（5×10 5），}从保存在步骤1.1的细胞悬浮液到每个五1.8 ​​毫升Eppendorf管中：1，3，4，5，和7的未染色细胞。等分试样50微升^{（5×10 5），}的PKH26 ^位置细胞到每个三级管从步骤1.9：2，6和8。
2. 管1-8，加入10μl的IgG嵌段（100微克/管的IgG;见表试剂）并在环境温度（20-25℃）孵育10分钟。
3. 加入饱和量的抗体（们）表示于表1中的管4，5，7，和8，并孵育30分钟，在室温和避光的所有样本（管1-8）。
4. 加入1.5毫升的HBSS 1％BSA的所有样品，沉淀细胞通过离心分离（5分钟@ 400 xg离心），并用1.5毫升1％BSA的HBSS洗一次，用小心抽吸，以避免细胞的损失。
5. 每个样品重悬在500微升的HBSS 1％BSA的。您的流式细胞仪上进行分析的样品，如果需要转移到一个12×75毫米的圆形底部管。管3，第6，第7和8中加入10μl的100微克/毫升7-AAD每日工作库存（见表试剂），如表1中所示。在冰上孵育30分钟，在使用前，在流式细胞仪安装和染色验证（步骤3）。

3。流式细胞仪安装和染色验证

1. 验证流量cytome后运行正常，使用实验室的日常质量控制程序。验证信号可以很容易地被检测到在要使用的每个光谱窗口，和检测器响应是线性正比于在窗口中的信号强度，用于增殖监测^14。
2. 收购管1 FSC与SSC数据使用线性显示比例。调整每个检测器的放大的淋巴细胞群，使得落在点图的左下象限，是不是断开规模两个参数中的任何一个中，并且不被中断，由于阈值化。收集所有的样品在步骤3.3 - 3.7非门FSC与SSC数据。
3. 采集数据管1，不使用色彩补偿所有4个荧光检测器和对数显示比例。调整各检测器的高电压（HV）放置规模少/无细胞积聚在第一信道的未染色的淋巴细胞的自发荧光。设置每个直方图的分析边界对应于最亮的2％的未染色细胞。
4. 不使用色彩补偿和HV设置在3.2和3.3，采集数据，收集管2 FSC，SSC，在所有4个荧光检测器的信号。 PKH26荧光用于监视检测，确认所有的的PKH26 ^POS细胞出现规模作为一个单一的对称峰在^第三 -4 ^个十年，数/细胞中的最后一个通道。如果有多个峰，或峰形歪斜，重复步骤1，，与盐小心注意尽量减少和混合技术（ 图2）。如果有必要，调整染料的浓度。
5. 使用步骤3.3的设置，采集数据，收集管3 FSC，SSC，在所有4个荧光检测器的信号。用于监视7-AAD荧光检测，确认7-AAD的^POS细胞下降2％以上步骤3.3（ 即非活细胞得到很好的解决边界建立可行的7-AAD ^阴性细胞）。
6. 使用步骤3.3的设置，采集数据，收集管4 FSC，SSC，在所有4个荧光检测器的信号。检查未染色的细胞（ 即 ，秋天的FITC检测步骤3.3建立高于2％的边界），CD8的^POS细胞得到很好的解决。管5重复和验证未染色细胞（ 即下跌超过2％的边界成立于APC检波器的步骤3.3），CD8的^POS细胞得到很好的解决。
7. 使用步骤3.3中设置，采集数据，收集管6，第7和第8 FSC，SSC，在所有4个荧光检测器的信号。
8. 使用收集管1-5和色彩补偿软件，建立一个重叠矩阵，每个荧光探测器被用来监视其他三个荧光染料的颜色列表模式下的文件。应用此矩阵样品6到列表模式文件，并确认存在PKH26实验室鹅岭不改变的能力来检测7-AAD ^位置细胞。
9. 应用颜色重叠矩阵，列表模式下的文件，样品7和第3.8步验证是：a）很好地解决亚群（CD3 ^负的 CD4 ^负 ，的CD3 ^POS CD4 ^neg和的CD3 ^位置 CD4 ^POS）可以识别的FITC与APC散点图，和b）的存在下，抗-CD3-FITC和抗-CD4-APC不改变7-AAD ^位置细胞的能力来检测。如果存在下，抗-CD3-FITC改变PKH26检测器上收集的数据的高2％的边界，调整所要求的边界。
10. 应用的颜色重叠矩阵，从步骤3.8样品8到列表模式文件。如果存在的PKH26标记改变那些使用自体荧光的步骤控制在3.3 FITC 7-AAD或APC探测器的2％的边界，调整边界（IES）需要使用管7 表1，并确认其仍然是能够disting的uish CD3 ^位置 CD4 ^POS机 ，的CD3 ^POS CD4 ^负 ，和CD3 ^负的 CD4 ^阴性细胞使用调整后的边界（IES）。

4。细胞分裂的监测染料稀释扩散模型选择

1. 确定代与代之间的间距，这是依赖于在您的流式细胞仪的数目的信道和对数十年。对于数字仪表，确定这个值，通常为4或5几十年来，在数字信号处理器的数目的箱柜。在模拟仪器，数十年来很少是整数，精确的建模需要的准确数字几十年来用实验方法确定。要做到这一点，从校准与制造商分配的相对强度的荧光珠的混合物获取的数据在相同的检测器在实验中使用的高电压设定。胎圈的峰的位置在int的方面允许的对数刻度的校准每个日志十年的ensity范围。具体而言，这是通过绘制每个胎圈类型对日志的制造商指定的值的信道数目。胎圈的数据值的最佳拟合直线的斜率给出了每个通道的相对强度单位的数目。乘以的信道数，然后将这个值是日志数十年的满刻度，从其中可以计算出到2倍的强度降低的现象（ 即 ，女儿代间距）相对应的数量的信道¹⁴的数目。
2. 决定是否使用一个固定的几代人之间的间距，或允许浮动的间距。 A 标准 （固定）设置将使用在步骤4.5确定指定的位置，每一代代间距值时通常使用的直方图没有明显的峰值。一个浮动设置允许的直方图的形状来确定每个代峰值位置时，通常使用distinguishablË代峰是显而易见的。
3. 决定是否使用一个固定的峰宽各代或浮动宽度。一个固定的宽度使用SD未刺激的对照样品各代建模和计算时，通常选择的样本缺乏区分的代峰。一个浮动的宽度允许程序独立地改变SD每一代都最适合用于区分的代峰。
4. 执行程序中的扩散分析模块（ModFit LT版本3.3）。刺激PKH26 ^位置设置为进行分析（ 例如 ，刺激96小时培养PKH26 ^位置细胞复染按照在表1中管8）的数据文件从装入。
5. 选择的参数进行分析，在这种情况下PKH26（585/42）上可行的门控（7-AAD ^负。）CD3的^POS淋巴细胞和FSC与SSC排除小碎片和大团聚体（ 图3）。在定义这些地区要小心爆炸通常包括前向散射面积，并注意CD3的表达可能是下调制刺激的培养。
6. 使用扩散向导创建一个新的扩散模型。使用打开数据文件 （“开始”选项卡上）中，装入未刺激PKH26的^POS控制文件和定义的位置高峰在父母的信道分配相应不可分割的细胞。
7. 分析该文件为刺激时PKH26 ^位置控制，注意到父母峰的位置和宽度（标准差）的值。如果需要一个固定的峰宽（SD），检查锁定SD。
8. 负载：PKH26 ^负控制（ 例如 ，PKH26 ^阴性细胞培养96小时的复染的管7 表1）。调整世代数 ​​的通过设置峰值通道的最暗的代以上的PKH26 ^负控制。这就决定了NUMBER的女儿代模型可以准确地适应，通常是6-9代。
9. 打开刺激的样本（ 例如 ，刺激96小时培养PKH26 ^位置细胞复染管8在表1中）的数据文件，并确认父母的峰值位置和SD，如在步骤4.7中定义的区域不变。如果需要固定的世代间隔，选择“ 标准”模式的选项，否则选择浮动选项。
10. 分析每一个实验性的文件中的数据集，在步骤4.9中定义的使用相同的模型。父母的峰值位置的一些小的调整可能是必要的视觉和减少的卡方值（RCS）最适合。
11. 记录所需的增殖的最佳拟合数据集合中的每一个实验性的文件产生的度量。可能指标的全面描述见参考文献。 22。

结果

膜像PKH26染料染色近乎瞬时的分区到细胞膜，而不是通过化学反应（CFSE）或平衡结合（抗体）。缺乏注意在图1中列出的重要问题，可能会导致在昏暗的或非均相的染色图2中所示的类型。与此相反，使用的优化标记条件（ 图1，表2）的结果，在明亮的均匀分布，适合于各种细胞跟踪应用程序，包括基于染料稀释（ 图3）的细胞分裂监测。死/死细胞失去了数额不等的跟踪染料，它可以扩大和/或歪斜的女儿代强度和复杂的扩散模型的基础上染料稀释^3,4,16,18。使用时，因此，建议的可行性染料的染料稀释收集数据的条件下显着的死细胞可以预先发送，如刺激的培养物（ 图3）或更旧的标本（ 图4）。

由于跟踪染料标记通常给出了荧光强度大于免疫几个数量级，它是重要的，包括适当的补偿控制（ 表1），并验证，跟踪染料的存在下，不损害能力解决抗体阳性和阴性细胞（ 图4）为了避免过多的色彩补偿的需要，优选将明亮的荧光染料，或一个没有发现如染料排除由活细胞的细胞上的利益，在光谱通道（）相邻的跟踪染料（ 图4A＆B 与 4C＆D）。当使用峰值量化的扩散的程度，获得良好的拟合的建模软件内的模型的特性的染料稀释prof的要求匹配的假设尔斯被分析（ 图5和表3）。随着跟踪的染料和生存能力试剂的适当的选择，但也可以同时表征在多个淋巴细胞亚群的增殖反应。例如，如在图6中示出，另外，第二跟踪染料简化调节T细胞（标记枣红与CellVue）和高度增殖的效应T细胞之间的歧视（CFSE标记），并提供了更为详细的有关它们之间的相互作用比可以得到用^{3 H-}胸苷标记^18,27。

图1。分区这些高亲脂性染料到细胞membra中一般膜标签协议PKH26，PKH67和CellVue的的染料。未列名的发生基本上即刻混合后与细胞进行染色时，在无盐的稀释剂Ç车辆提供最大限度地提高染料溶解度和染色效率。这个原理图中所概述的一般膜标签与PKH26，明亮，均匀的和可重复性的染色，因此，最容易通过以下方式获得：1）的量最小化的蛋白质和/或其盐中存在的染色工序和2）使用的混合技术，确保快速均匀的散布染料（ 即 ，同时公开的所有单元格，以相同浓度的染料）中的细胞。

图2。染色条件的影响PKH26荧光分布 （转载自参考文献18）。复制的样本对数生长期，培养ü937细胞进行染色，用PKH26（最终浓度：1×10 ⁷个细胞/毫升，12 - 15μM的PKH26）为3分钟，在环境温度下，有或没有立即混合后，加入2倍的细胞的2倍的染料。经过洗涤，染色细胞在Beckman Coulter公司青色流式细胞仪采用恒仪器设置进行了分析。 直方图1：PKH26染色的控制与检测电压调整，将所有的细胞数/细胞中积累的第一个通道的第一个十年，上规模。 直方图2：15μM染料使用另外的2个细胞的2倍，即时混合染料染色在明亮，均匀染色，细胞置于对称的人口在第四个十年，数/细胞堆积在最后一个通道（gMFI 2548，GCV = 26.2％）。 直方图3：在15μM使用另外的2个细胞，以2倍的染料，但没有直接的混合染料染色降低强度和更广泛的CV（gMFI = 505 ，GCV = 116％）以及昏暗染色的亚群，可能是由于细胞管壁上，而不是在2x染料溶液分配一滴直方图4：染色错误导致3微升浓乙醇染料股票被直接添加到2倍稀释ç细胞没有进一步的混合，而不是被用来准备了2倍的染料溶液的稀释液C.这导致了最后的染料浓度为12μM，但给了极其暗淡和异构染色（gMFI = 32.9，GCV = 1020％）。所观察到的权歪斜最有可能反映联合作用：ⅰ）不良，由于各种不同的细胞和染料卷混合;和ii）的事实染料分配点最近的，细胞会暴露于较高浓度的染料比那些更远点击这里查看大图 。路程。

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图3。生存能力探头的使用简化了门控的T细胞增殖的档案。人外周血单个核细胞进行标记PKH26（最终的细胞浓度：3×10 ⁷ /毫升;最终的染料浓度：10μM）。在存在96小时（刺激）或不存在（未刺激的）的抗-CD3和IL-2的培养后，将细胞与抗-CD3-FITC，抗CD19-APC和7-AAD复染，并进行了分析上FACSCalibur流式细胞仪（有关详细信息，请参阅参考文献13）。色彩补偿进行使用硬连线的补偿电路，在数据采集的时间。被建模为在步骤4中描述，使用扩散LT3.3 ModFit向导在扩散的程度。从PKH26 ^阴性对照组（ 表1，地铁7）被覆盖的数据，以供参考（灰色填充柱状图在第3列）。存活率为无刺激和性传播疾病的mulated文化分别为76％和62％（非栅控面板数据A和B，分别）。 面板A. PKH26染色细胞培养介质中的96小时门控可行的（7-AAD ^{负。）CD3 POS}细胞（R1）。除了抗体包容和7-AAD的死细胞排除栅极，前向散射（FSC）对侧向散射（SSC）的栅极（R2），用于排除碎片和聚集。请注意没有死细胞，在此面板在过去的情节。 PKH26增殖档案中（第3栏）的最佳拟合模型，得到一个单峰，RCS = 2.1（捐赠6， 表3），表明良好的对称性，并用来定义的父母的位置和用于分析的刺激起始峰宽样品从该数据组（B组）。 面板B.甲复制等分PKH26染色细胞与抗-CD3和IL-2培养96小时和门控面板A.浮动峰值位置的模型与以同样的方式浮动峰宽了 RCS = 1.3（捐赠6， 表3）。面板C.面板A中相同的数据文件，而不使用的7-AAD数据分析这个数据与最适合。当一个主FSC和SSC用来部分地排除死细胞和聚集体（R 2）和一个次级CD3阳性的活动（R3）的栅极连接到选择，一个小的残余的死细胞仍然人口的门控事件（0.2％）。最合适的模型给了一个单峰，RCS = 2.2。 面板相同的数据文件D.在B小组门控在面板C.注意较大的剩余人口的死细胞刺激样品中门控事件（1.29％）这门控策略。最合适的模型是一个浮动峰的位置和浮动峰宽（RCS = 1.3）。 点击此处查看大图 。

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图4。能力与PKH26标记的免疫细胞荧光染料选择，染料浓度的影响。人外周血单个核细胞中分离到24小时陈旧性血液和标记PKH26在步骤1中所描述的，不同之处在于染色进行了12×75毫米的圆形底部聚苯乙烯管，而不是12×75毫米锥形的聚丙烯管中。与PKH26标记后，立即进行复染，细胞与指定的免疫和活力的试剂，并分析图3A和光学配置如下：488 nm激光：FSC-A（488 nm）的使用门控策略的LSRFortessa流式细胞仪; SSC -A（十分之四百八十八BP），FITC-A（三十分之五百三十○BP）; PKH26-A（575/26 BP）; 7-AAD-A或PerCP-A（40分之695BP）。 640 nm激光：APC-A或TOPRO的-3-A（一十四分之六百七BP）。在数据采集的时间使用BD DIVA软件进行色彩补偿。 “自动”表明自体荧光相关光谱窗口中无抗体控制（APC板A和B，C和D PerCP为）。从PKH26 ^阴性对照组（ 表1，地铁7）被覆盖的数据，以供参考（灰色填充柱状图，第5栏）。染色后的存活率分别为类似的所有样本（88-92％）。 面板A. PKH26标记的最终浓度为2μM的细胞，用抗-CD3-FITC，抗-CD4-APC，和7-AAD（复染管8， 表3）。门控可行的（7-AAD ^{负。）CD3 POS}淋巴细胞（第1栏）和排除碎片和聚集的基础上FSC和SSC（ 见图3A），PKH26强度进行了评估，结合APC CD4（列2和3）。无论是无补偿（第2栏）或补偿（第3列），荧光结合导致在CD4 ^POS T细胞和CD4 ^阴性 T细胞之间的良好的分辨率），作为验证的没有一个ntibody，自体萤光控制（管6 表1第4栏），CD3 与两种颜色的情节。 ，CD4（第6栏），B组 。使用相同的荧光组合在A组，但最终PKH26浓度增加至4μM没有不利影响的能力，解决CD4 ^POS T细胞，CD4 ^阴性 T细胞。 面板C.甲使用抗-CD3-FITC，抗-CD4-PerCP，并TOPRO-3复染复制的等分的细胞独立地与PKH26标记在最终浓度为2μM。可行（TOPRO-3 ^负 ）CD3 ^位置淋巴细胞（第1栏）和排斥基于FSC和SSC（参见图3A）的碎片和聚集后选通，PKH26强度进行评价，与抗-CD4-PerCP（第2列和组合3）。在未补偿的数据（第2列），主要光谱重叠的PKH26的PerCP通道中是明显的，分辨率PKH26 ^POS CD4之间的 ^{POS机和的PKH26 POS CD4 负事件是微不足道的补偿后的应用（比较第3列与无抗体，自体荧光在第4栏所示）。 面板D.当PKH26浓度增加至4μM，它不再是可能的使用的荧光染料的组合面板C.光谱重叠从进入PerCP通道的PKH26超过从CD4（第2栏）和CD4的信号的强度的位置的 PKH26 位置事件不再能够解决从CD4 阴性 PKH26 位置 T细胞（第3栏与第4列）， 点击这里查看大图 。}

图5。扩散模型选择的影响善适合染料稀释公司。人外周血单个核细胞进行标记PKH26（最终的细胞浓度：3×10 ⁷ /毫升;最终的染料浓度：10μM）。在存在96小时（刺激）或不存在（未刺激的），抗-CD3和IL-2的培养后，收获细胞复染与抗-CD3-FITC，抗CD19-APC和7-AAD，在FACSCalibur分析流式细胞仪（具体方法见参考文献13）。色彩补偿使用硬连线的补偿电路，在数据采集的时间执行。 面板A。PKH26施主杂质5星，温和的响应，从一个未刺激的96小时培养的强度分布是门控的，如在图3A中所示的，和用于提供ModFit增殖向导的峰不可分割的亲本细胞，B组第一的位置和宽度估计为培养96小时。PKH26从一个并行的刺激强度分布进行了分析使用估计连续女儿代面板的增殖向导“设置A和4种不同的组合，对应的固定或浮动峰强度，和固定的或浮动的峰宽，如图所示。 表3中 ，所观察到的数据给最合适的模型，该模型中所概述的（最低减少卡方; RCS）是“浮动/浮动”的组合，其中不仅峰值位置，但也允许女儿生成峰的标准偏差变化（RCS = 1.5）。同样的模型，得到施主杂质6，高反应者（ 图3B和表3）是最适合的。

图6。添加第二小区跟踪染料简化歧视效应和调节性T细胞之间在流式细胞仪抑制测定（适于从号18）。从TRIMA除去白细胞的过滤器制备的单核细胞贫淋巴细胞染色，用抗-CD127-PE，抗-CD4-PE-CY7，和抗CD25-APC和流动的种群的效应器（TEFF排序; CD4 ^位置 CD127 ^明亮的 CD25 ^DIM），调节（调节性T细胞CD4 ^POS CD127 ^昏暗的 CD25 ^POS），及配件细胞（CD4 ^负 ）。排序条件Treg细胞干红葡萄酒（最终的细胞浓度：1×10 ⁶ /毫升;最终的染料浓度：1μM）和排序条件CellVue TEFF用CFSE（最终的细胞浓度：5×10 ⁷ /毫升;最终的染料浓度，5μM）标记所标记的以不同比例存在的抗-CD3，抗-CD28和辐照辅助细胞共同培养。进行96小时后，收获培养物，用抗-CD4-PE-CY7和LIVE / DEAD绝不紫罗兰复染，并分析LSRII流式细胞仪和彩色补偿的数据习得的时间n使用BD DIVA软件（包括补偿控制的详细信息，请参阅参考资料18）。画眉草和调节性T细胞的扩散指数为蓝本，在步骤4中，使用扩散向导ModFit LT3.3。在板B和C的数据点代表平均值±1个标准差的一式三份样品。 面板A.代表性的数据上所显示的三个一式三份样品之一，在调节性T细胞：TEFF比为0.25:1。 LIVE / DEAD可以解决的紫试剂是用来排除死细胞（R1，左上角的情节;辅助细胞=红褐色，没有自生能力的TEFF =灰，没有自生能力的调节性T =红色）与所有其他数据图。 CellVue干红葡萄酒染色是可行的，但用来区分可行的调节性T细胞（R4，中间偏右的情节;蓝色）高度增殖画眉草（R5，中间偏右的情节;绿色）。细胞的CFSE ^位置 （R 5），CD4 ^位置 （R 3），可行的（未R1），通过选通产生一个单一的参数的CFSE增殖更新TEFF（低级左图）和淋巴细胞SC东北黑钙土性质（R2）。一个参数CellVue干红葡萄酒增殖调节性T细胞产生的细胞，是CellVue干红葡萄酒^{POS（R4），CD4 POS（R3），}可行的（R1）选通，并有淋巴细胞散射特性（R2）。请注意，大方的淋巴细胞地区（R2）定义为包括淋巴细胞爆炸。还请注意，要收集的细胞的总数取决于人口的利益的最低频率。在细胞增殖实验中人口的利益可以分布在很宽的范围内的强度相当于七或八代细胞大量的必须被收集在以精确的建模和计算每一代中的细胞数。研究稀有细胞时，它简单地运行近干的样品管，以便收集的事件的可能的最大数量，可能是必要的。对于此处显示的示例，这样做〜25,000次，其中11,923人是画眉草（增殖我总在ndex 3.85）和1,380调节性T细胞（增殖指数1.83）。 面板B.正如预期的那样，联合培养更大的TEFF细胞增殖的抑制调节性T细胞目前的比重越来越大。两个CellVue枣红染色（ 实线 ），或者未染色的（ 虚线 ）的调节性T细胞，得到相似的结果表明与CellVue枣红跟踪染料染色不影响调节性T细胞的效力。 面板C.调节性T细胞是相对无反应性的，如预期的，没有不能增殖培养时与抗-CD3，抗-CD28，和辅助细胞在没有TEFF细胞（调节性T细胞：TEFF比为1:0）。然而，作为共培养物中的比例TEFF本增加（ 即 ，作为调节性T细胞：TEFF比值下降），调节性T细胞的增殖的程度也增加。一般较大的误差棒至少在一部分的这些数据反映了有限的范围内的扩散，导致较小的号码，与收集的事件相对TEFF和更大的不确定在模拟细胞在每一代TY。 点击此处查看大图 。

管编号（目的）	PKH26	抗体（IES）	7-AAD
1（设置，补偿）	-	-	-
2（设置，补偿）	+	-	-
3（设置，补偿）	-	-	+
4（补偿）	-	CD8-FITC b的	-
5（补偿）	-	CD8-APC b的	-
（没有抗体控制的）	+	-	+
（没有跟踪的染料浓度控制）	-	CD3-FITC CD4-APC 或 CD19-APCÇ的	+
8（T0控制）	+	CD3-FITC CD4-APC 或 CD19-APCÇ的	+

表1。仪器设置控制^。一个控件列表中列出的是适合4色CD4 T细胞增殖的监测分析：PKH26（染料扩散），CD3-FITC（泛T细胞标记），CD4-APC（T-辅助细胞标志物），7 -氨基放线菌素D（7-AAD，死细胞排除） ^二牯代理人CD3-FITC，CD4-APC（更好的能力来检测补偿误差^）。c 图3：CD3-FITC，CD19-APC。 ^d 图4：CD3和CD4-FITC-APC。

电池类型	最终的细胞浓度	最终染料浓度</ STRONG>	参考
人外周血单个核细胞b	1×10 7 /毫升	2μMPKH67	10,17
	5×10 6 / ml的	2μMPKH26	12
	3×10 7 /毫升	10μMPKH26	13
	5×10 7 /毫升	30μMPKH26	18
	1×10 6个 / ml的	1μMCellVue干红葡萄酒Ç	18
	3×10 7 /毫升	4μMCellVue干红葡萄酒	13
	5×10 7 /毫升	5μMCellVue干红葡萄酒	18
细胞的培养	5×10 5 / ml的	0.1μMPKH26（1°乳腺细胞）	8
	1×10 7 /毫升	15μMPKH26（U937）	18
	1×10 7 /毫升	12.5 -15μMPKH26（U937）	15
	1×10 7 /毫升	1μMPKH67（K562）	18
	1×10 7 /毫升	1μM的PKH67（T细胞系）	9
	1×10 7 /毫升	10的μMCellVue干红葡萄酒（YAC-1）	23

表2。的非扰动膜染色^。一个调整和更新文献。 ^18，B使用了低的速度洗（300×g离心），以尽量减少血小板污染^的 Treg细胞（流的排序条件CD4 ^位置 CD25 ^位置 CD127 ^阴性淋巴细胞）。

		模型设置		模型结果
捐赠者	治疗	山顶的位置	SD	家长的位置	家长SD	＃峰值的配	RCS	PI	PF
5	未刺激	浮动	浮动	209	4.5	1	5.1	1.0	0
5	刺激	修正	修正	209	4.5	7	35	3.9	31
5	刺激	浮动	修正	209	4.5	8	19	4.3	30
5	刺激	修正	浮动	209	9.2	6	1.9	3.8	30
5	刺激	浮动	浮动	209	9	7	1.5	3.7	29
6	未刺激	浮动	浮动	205	4.0	1	2.1	1.0	0
6	刺激	修正	修正	205	4.0	6	42	6.6	60
6	刺激	浮动	修正	205	4.0	7	12	7.4	60
6	刺激	修正	浮动	205	8.6	6	6.9	6.8	62
6	刺激	浮动	浮动	205	6.5	6	1.3	6.5	59

表3。增殖模型的拟合优度（RCS）和增殖的指标^。样品染色，数据收集和门控图3A＆B的影响。

讨论

这里介绍的方法是在我们的联合实验室hPBMC标签用膜染料^13,16,18的和T淋巴细胞亚群的表型和增殖跟踪，无论是膜或蛋白染料^{2,11,13,16，}使用最可靠提供最佳的结果^{， 18。}正如图1和图2中示出，明亮的统一的标签是最容易实现的生理盐的存在下，通过限制使用的混合技术，快速，均匀的曝光的所有单元格，以相同浓度的染料中的结果。因为划分的脂质双层膜染料染色时，其他变量，改变染料浓度，还可以影响标签的效率。例如，标签圆底聚苯乙烯管效率较低的盐冲洗稀释Ç的悬浮之前也减少由于染料的吸附在管壁上，特别是游离的染料浓度在染料浓度较低。这两个因素往往会得到更广泛的染色分布时相比，标记操作可以使用圆锥形底部的聚丙烯管中（ 图3，图4和 结果未显示）。样本的年龄和类型也可以影响峰宽，甚至被用来优化的染色过程。例如为的PKH26 ^位置淋巴细胞分离出新鲜抽血，范围从14-20％（参考图3，13日和未发表的结果），而24小时老血液样本或TRIMA的pheresis过滤器范围内分离出淋巴细胞的简历，个人简历25-30 ％（ 图4和参考文献18）。

染色的均匀性和非活细胞可以从分析中排除既影响染料稀释曲线，这反过来又影响的扩散模型的选择，以适应所观察到的数据（ 图5和图6是显而易见，是否区分的女儿峰的程度）。这里使用的是，虽然ModFit（真理图软件House，托普瑟姆的。，ME）的软件用于生成等指标的扩散指数和前体频率（ 图3，图5和图6，表3）作为一个例子，其他软件包还包含模块分析增殖的数据。这些：包括FCSExpress（诺和软件，洛杉矶，CA）和FlowJo（树星公司，亚什兰，OR）。所有这些方案都使用一个非线性最小二乘分析，以迭代找到最适合的原始数据通过改变的位置，高度和SD（或宽度）的高斯峰，表示顺序的女儿代。增殖指数（PI）和前驱体频率（PF）是最常用的措施的增殖程度。 PI，定义由ModFit，是在测定过程中的细胞数量增加，类似于“刺激指数'胸苷摄取试验的措施。 PF返回的馏分中的单元格的初始populat离子的刺激增殖。应注意，但是，当阅读文学术语有所不同套装软件之间（ 例如 ，，FlowJo和ModFit使用不同的定义和计算是什么意思“的扩散指数^”）22。

用蛋白染料时也遇到了标签和膜染料的扩散分析与这里讨论的关键问题。例如，必须小心注意混合技术也可以观察到，随着排除死/死亡的细胞，为了获得均匀的分布和使用的CFSE的（ 图^{6）2-4,13,18,24}区分女儿峰。选用合适的荧光染料的表型和生存能力评估也是很重要的，以避免过度的频谱重叠，无法识别抗体阳性细胞，特别是与可见光的发光蛋白染料如CFSE ^{2-4,11,13,16,18} 。减少跟踪染料的浓度降低赔偿的问题，在相邻光谱通道，但也限制了数量的细胞分裂，可监测的前子细胞与自体荧光强度开始重叠。另外，使用新的细胞示踪染料，如远红外发光CellVue干红葡萄酒（Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，MO）或紫色的发光CellTrace紫（Life Technologies公司，大岛，NY）可能会降低赔偿的问题（ 图6）。最后，虽然膜的染料一般倾向于表现出较少的毒性^11,26，它是可能的过与任一类的染料标记细胞。于是，它总是必要的验证，跟踪使用的染料的浓度并没有改变的细胞，以进行跟踪的功能（ 图^{6）3,13,16,18。}

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂或设备	公司	目录编号	评论
			市售的
7 - 氨基放线菌素D	Sigma-Aldrich公司	A9400
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich公司	A4503
牛胎儿血清（FBS）的	亚特兰大生物	S11150
Hanks平衡盐溶液（HBSS）	Life Technologies公司	14175-079	钙和镁的自由，不加酚红
人IgG Cohn组分II和III球蛋白	Sigma-Aldrich公司	G-4386
小鼠抗人CD3-FITC	BD Biosciences公司	349201	饱和浓度由实验室滴定
小鼠抗人CD4-APC	BD Biosciences公司	340672	饱和浓度由实验室滴定
小鼠抗人CD4 PECy7	BD Biosciences公司	348799	饱和浓度由实验室滴定
小鼠抗人CD8-FITC	BD Biosciences公司	347313	饱和浓度由实验室滴定
小鼠抗人CD8-APC	CALTAG（Life Technologies公司）	MHCD0805	饱和浓度由实验室滴定
小鼠抗人CD19-APC	CALTAG（Life Technologies公司）	MHCD1905	饱和浓度由实验室滴定
小鼠抗人CD25-APC	BD Biosciences公司	340938	饱和浓度由实验室滴定
小鼠抗人CD127-PE	BD Biosciences公司	557938	饱和浓度由实验室滴定
小鼠抗人CD3	eBiosciences	16-0037-85	1.0毫克/毫升;磷酰基叠氮化物的免费
的小鼠抗人CD28	eBiosciences	16-0289-85	1.0毫克/毫升;磷酰基叠氮化物的免费
PBS	Gibco公司	21300-058
PKH26红色荧光的细胞连接器套件，包含10-3M PKH26在乙醇和稀释剂Ç	Sigma-Aldrich公司	PKH26GL-1KT 或 MINI26-1KT	第1步中的程序也适用箱PKH67或其他CellVue的染料
枣红远CellVue红色荧光细胞连接器套件，包含10-3M CellVue的干红葡萄酒在乙醇和稀释剂Ç	Sigma-Aldrich公司	的MINCLARET 1KT或MIDCLA​​RET的-1KT
5 - （和6） - 羧基荧光素二乙酸酯，琥珀酰亚胺基酯（CFDA-SE）	Invitrogen公司（Life Technologies公司）	C34554	非荧光;裂解膜酯酶形成荧光与氨基反应的羧基荧光素琥珀酰亚胺基酯（CFSE）
LIVE / DEAD绝不紫	Invitrogen公司（Life Technologies公司）	L34955
无菌12×75毫米同轴 聚丙烯管帽	VWR	60818-102	提供了更好的膜染色效率（减少染料的吸附，减少细胞损失在上清愿望）
12×75毫米的圆钢ð底部 聚苯乙烯管	Becton Dickinson公司	21008-936
流式细胞仪	BD生物科学	FACSCalibur LSRFortessa	任何能够检测FITC，PKH26，和7-AAD（例如488纳米;时间520纳米，567纳米和655纳米，分别）和APC前的流式细胞仪。 633-640 nm的时间。 660 nm）的
流式细胞仪	Beckman Coulter公司	LSRII青色	任何能够检测FITC，PKH26，和7-AAD（例如488纳米;时间520纳米，567纳米和655纳米，分别）和APC前的流式细胞仪。 633-640 nm的时间。 660 nm）的
			实验室制备
7 - 氨基放线菌素D， 集中持股	NA	NA	在PBS中的1毫克/毫升。冻结分装并储存于-20°C。
7 - 氨基放线菌素D， WOR王股票	NA	NA	在PBS的100微克/毫升，准备每天1毫克/毫升冷冻的股票。
抗体块	NA	NA	HBSS + 10毫克/毫升人IgG Cohn组分II和III球蛋白+ 10毫克/毫升BSA。