使用荧光显微镜可视化中的细菌线虫

摘要

要研究之间的互利共生嗜斯氏线虫

摘要

共生，生活在一起的两个或多个物种，广泛分布于所有的王国的生活。作为地球上的最普遍的生物，线虫和细菌形成共生广泛的范围从有利于致病^1-3。一个这样的协会是互惠互利的关系致病杆菌的细菌和斯氏线虫，这已经成为了一个模型系统的共生^4。 斯氏线虫，昆虫，细菌共生体，杀死昆虫^5。昆虫宿主之间传输时，细菌定植于肠道线虫的感染青少年阶段^6-8。最近，几个其他线虫种已被示出利用细菌杀死昆虫^9-13，并调查已经开始研究在这些系统中的线虫和细菌之间的相互作用<SUP> 9。

我们描述了一种内共生菌或一种线虫主机上进行可视化的方法，利用通过显微镜观察时，光学透明度的线虫。这种细菌被设计来表达荧光蛋白，让他们通过荧光显微镜的可视化。许多质粒是可携带荧光在不同的波长（ 例如，绿色或红色），和共轭从一种供体到受体细菌共生体的大肠杆菌菌株的质粒编码的蛋白质的基因是成功的范围广泛的细菌。描述的方法进行调查之间的关联斯氏carpocapsae和嗜线虫致病杆菌 ^14。类似的方法已被用来调查其他线虫细菌协会^9，15-18，因此，该方法是普遍适用的。

的METHOD允许的细菌内线虫的存在和定位的特性，在不同的发展阶段，深入了解协会的性质和过程的殖民统治^{14，16，19。}微观分析揭示了两个殖民频率范围内的人口和本地化的细菌宿主组织^{，14，16，19-21。}监测细菌内线虫的人群，如超声²²或研磨^23，可提供平均水平的殖民与其他方法相比，这是一个优势，但没有可能，例如，歧视的人群高频率的低共生体负载从人口低频率高的共生体负荷。判别的频率和负载的定殖菌筛选时，可能是特别重要或描述细菌殖民表型的突变体^21，24。事实上，荧光显微镜被用于高通量筛选的细菌定植^17，18中的缺陷的突变体，并且是不太费力的比其他的方法，包括超声处理^{22 25日至27日，}和个别线虫夹层^28，29。

研究方案

1。建设一个荧光的细菌菌株，通过共轭

1. 成长的受体菌（共生体进行审查）和供体菌过夜。供体菌株中，通常会大肠杆菌 ，应该是能够通过共轭捐赠DNA应转化的质粒（ 表2）的，携带编码荧光蛋白的基因。根据质粒上，共轭辅助菌株也可能是必需的。如果是这样的话，该菌株应还​​可以生长过夜。供体菌和辅助应变应种植与抗生素选择维护的质粒。
2. 继代培养的捐赠者，助手，受体菌营养丰富的生长介质，缺乏文化到介质中的比例为1:100的抗生素。
3. 每个菌株在温度适宜成长的文化，直到他们达到数中期阶段的增长（OD _{600〜0.6）。} 致病杆菌和大肠杆菌大肠杆菌这一阶段的成长次达到约3至4小时后，传代培养。这可能会有所不同，这取决于在该菌株中，或在某些情况下，该质粒，用。
4. 在离心管中，离心2分钟17,900 XG（13,000 RPM在最microfuges），混合菌株。供体和受体，产生最好的结果的比例会有所不同，不同的组合，并且可以具有可以凭经验确定。 ，对于嗜收件人和E.大肠杆菌供体，我们用一个3:1或1:1的比例。如果一个辅助菌（ 如大肠杆菌 ），它应该被添加到相同的比例作为供体。
5. 滗析出上清液。
6. 细胞沉淀重新悬浮在30μl的新鲜培养基。
7. 现货悬挂到营养丰富的传媒板块没有任何抗生素，并允许当场干燥。
8. 孵育板，倒立，一夜之间在一个受体细菌和允许捐赠者和帮手，（如适用）的最佳温度。板培养至少18小时。
9. 刮掉的斑点和条纹的选择性抗生素板的单菌落。抗生素应选择对供体和含有质粒的收件人。一个或两个额外的隔离条纹可能是需要分离的纯培养物。
10. 确保产生的菌落收件人共生体，而不是供体菌株，通过筛选存在的特殊的表型，如菌落形态，或收件人特定基因的聚合酶链反应检测。筛选对存在的质粒的菌落，通过聚合酶链反应的公知的质粒序列和荧光。菌落下的正确的波长对应的荧光蛋白的荧光。

2。生产的无菌线虫虫卵

1. 细菌共生的自然增长5毫升过夜。要开始一种文化，细菌接种到溶原性肉汤（LB）或其他立方米lture媒体直接从冷冻柜股票或条纹板。
2. 消息传播600微升的细菌培养到10毫米脂质琼脂（LA）的板^29上 。八至十个板块将产生足够的线虫大多数物种。
3. 孵育在25℃在黑暗没有水分两天。
4. 添加5000感染性线虫，或其他阶段取决于正在使用的线虫，在500μl的媒体到细菌的草坪。板在25℃下孵育3天。
5. 检查您的板存在的成年线虫和鸡蛋。到显微镜玻片上，将20微升的水。使用无菌棒刮少量的线虫从细菌的草坪。将棒入水，让线虫游泳。在低倍镜下看在您的幻灯片。对于外观的更多信息，请参阅讨论和图2。
6. 如果卵子和女性是可见的，继续，否则，孵化板25＆D例如，C和检查适当发展每6-12小时。当女性包含鸡蛋，放置几毫升水，在板的表面上。轻轻旋转板，将水倒入50毫升锥形管。线虫应该脱落的板，并不再是可见的板表面上。几个漂洗可能是必要的。
7. 允许线虫沉淀到该管的底部。
8. 冲洗线虫。移液器多余的水从该管的顶部。补充用干净的水和允许成人线虫解决。移液器多余的水。
9. 填写锥形管与鸡蛋的解决方案。一旦鸡蛋溶液中加入的所有步骤的定时用鸡蛋溶液必须继续进行与所述的相同的最大产蛋率。孵育管，同时轻轻摇晃了整整10分钟。大多数线虫应溶解的培养结束。
10. 立时离心机的圆锥形管正好是10分钟（这包括使离心机，以加速在1250 XG但没有下降到0×克。使用制动）。
11. 立即倾倒出上清。
12. 立即重新悬浮的颗粒用鸡蛋液，用移液管。
13. 立即填写锥形管中与鸡蛋的解决方案和拌匀反转的3-5倍。然后立即旋转在2.10。
14. 立即倾倒出上清。
15. 重新悬浮颗粒在LB移液转移到一个15毫升锥形管，以提高制粒过程中的洗涤步骤。 LB是斯氏菌的标准。根据线虫和细菌，同时要注意缓冲区必须不造成伤害的线虫或细 ​​菌，可用于其他缓冲区（ 例如，一个最小的盐介质）。
16. 填充管LB和自旋在2.10。
17. 滗析出上清液，并重新悬浮在LB。
18. 冲洗线虫共3次重复2.14和2.15。
19. 再悬浮线虫虫卵稀释至适当的体积。应该有至少10只蛋每微升。例如：gs的可以存储至少4天，通过在6厘米的陪替氏培养皿在5毫升LB培养基中加入抗生素，抑制定植细菌的生长，并在封口膜包装板。鸡蛋将需要洗涤一次，在15毫升的LB（如在2.13和2.14）的前，接种到细菌草坪。请注意，在此期间，卵孵化和使用时定植分析可能不同步发展。

3。共培养法与荧光杆菌

1. 一夜之间荧光细菌成长，选择的质粒如有必要，。
2. 消息传播600微升的细菌培养到10毫米脂质琼脂平板上，用无菌的棒。在25℃孵育2天。
3. 发布500-5000无菌线虫鸡蛋在总共100至400微升（最佳2000的线虫在200μl）到脂质琼脂平板上每个。
4. 不含水分在黑暗中在25℃下孵育直至IJS，或其他感兴趣的，形式阶段。 IJS将是可见的为富中资源的白色环的板的边缘上。要在其他生命阶段，协议4。
5. 将板的变形的白色阱^30。取下盖子的脂质琼脂平板上和放置到一个空的100毫米×20毫米陪替氏培养皿底部的底部。填写与水的大培养皿中，或其他适合您的线虫的缓冲，中小板包围。水位应该是约小板的高度的一半。
6. 孵育水到缓冲区中，直到后代的IJS已经出现的陷阱。
7. 在组织培养烧瓶中，水可被存储在感染性线虫幼虫。

4。的生命早期筛查收集

1. 使用步骤3.1至3.4建立检测。
2. 孵育板，直到所需的生活阶段。每日目视检查，可能是必要的，以确定定时。要检查板，使用过程中描述的协议2.5。对于S. carpocapsae eggsgrown 与 X 线虫上LA板块，怀孕的女性会在4-5天，未成年人将出现在7天，感染青少年，将开始生产的15-17天。
3. 当所需的生活阶段，采集样品。填补了的96孔板的孔中，用200μl的PBS中，或其他合适的缓冲液中。轻轻地刮去一些含有线虫的细菌草坪。豌豆大小的量（约50毫克），将提供至少几百线虫一旦产生后代，但更多的可能是必要的较早的时间点。将棒以及含缓冲。
4. 孵育30秒到一分钟。取出棒刮去剩余的残渣。使用棒，以消除任何琼脂从井里。线虫应该是在缓冲区内可见。将缓冲区混合物到一个干净的微量离心管中。
5. 治疗用左旋咪唑或其他瘫痪代理的线虫。几粒左旋咪唑溶解到30＆亩;升的水。每50μl的样品中加入1-2μ​​l这种混合。左旋咪唑治疗后，线虫将不可行。
6. 在以后的日子，如果样品将被视为解决所描述的这一步。如果没有，请跳到步骤4.6。加入200μl含有1X缓冲液和4％多聚甲醛固定液。轻轻混匀，移液可能会导致裂解精致生活阶段。用铝箔纸覆盖，，孵化的低振动筛在室温下至少18小时。
7. 将反应管的管架中，并允许线虫沉淀到该管的底部。
8. 冲洗线虫来去除背景。用移液管把多余的液体，添加200 - 500μl的缓冲，轻轻混匀。重复以上步骤。这可以重复几次，以去除更多的背景，如果需要的话。
9. 允许线虫沉淀到该管的底部，并重新悬浮在所需的量的。
10. 如果线虫是不固定的，屏幕上立即。可被存储在冰箱中最多固定线虫两个星期。存放在黑暗中。

5。细菌在显微镜下观察协会的筛选线虫

1. 选择一些线虫在显微镜下查看你的混合物取出一个小样本。
2. 为了确保线虫的图片，为麻痹代理协议4.5中描述的治疗。如果你不拍摄照片或的线虫已固定，这一步可以省略。
3. 20-30微升的线虫在水中添加您的显微镜幻灯片，并把顶部的盖玻片上。
4. 整个使用光学显微镜下的线虫，以确保线虫的视野。
5. 查看线虫使用荧光设置对应于由细菌表达的荧光显微镜。
6. 要确定细菌的本地化，在荧光灯下的设置和光镜设置，拍照的线虫，然后叠加图像。照片需要是相同的FIELD的观点。这可能需要尝试几种不同的放大倍率和意见的线虫的细菌。
7. 分布线虫定植可以量化通过计数线虫人口，得分为存在或不存在的细菌，并计算％定植。我们建议使用计数，直到至少30线虫内的人口在每个类别进行计数（带或不带定植），得到一个可靠的值。
8. 当只有少量线虫在人口定植，它可能是必要的30日前的观察计数几千线虫。对于高通量的计数，请使用以下步骤。
9. 相反单独计数的线虫，等分人口成多孔板（ 例如 24孔板）。后线虫已结算的菜的底部，各孔可扫描显微镜可以拿下和定植线虫的数目。
10. 线虫的总数我NA人口可以被识别的系列稀释线虫井。例如，1毫升的线虫可以被添加到一个井，充分混合搅拌用移液管尖，和3μl可以除去为定量的总人口在阱计数。
11. 定植由总数的线虫在阱的数目除以殖民线虫的百分比可以通过以下方式获得。

6。代表性的成果

斯氏线虫与致病杆菌细菌相关的实施例的显微镜图像示于图3。要创建的合成图像， 如图3A所示 ，一个相位的对比度的图像的荧光图像重叠。 图3A中的箭头表示的细菌内的感染性线虫（巴= 100微米），以类似的方式构建， 如图3B示出了少年线虫的Wi日绿色荧光蛋白标记细菌（绿色棒）定位在整个线虫肠腔（巴= 20微米）。从两个媒体线虫的人口计数，取得了殖民细菌共生体（ 表1）。对于可靠的统计数据，最好是至少有30属于每个类别中，计算每个样品至少100线虫。在表1中可以看出，这些线虫定植上生长脂质琼脂和68.6％时，在约14.6％的水平，肝，肾琼脂上生长时。其他线虫和细菌物种已被证明有不同程度的殖民统治。例如X。线虫寄生99％的S. carpocapsae感染青少年（马滕斯2003年），P. 0813-124殖民26％的H.嗜菌感染的少年（Ciche 2003年）。

图1。纲要的方法。 A.细菌设计，以表达荧光蛋白。B.线虫虫卵从成人线虫分离生产无菌线虫C.无菌线虫与荧光细菌共培养。D.被视为下一个人生阶段的显微镜来评估范围内的线虫的细菌存在。

图2。含蛋的成年女性的描写。 A.该图显示了斯氏女性的整体外观。插图：DIC图像的S. feltiae妊娠的女性。黑色箭头表示外阴。白色箭头显示了明显的鸡蛋。图片是在放大20倍，比例尺为100μm。B. DIC图像的开发，但未孵化的S.feltiae线虫卵。图片的放大倍数是40倍，比例尺代表50μm。从S. C. DIC图像的鸡蛋分离feltiae 10倍的放大倍率下的线虫。比例尺为100微米。

图3。的显微镜图像线虫细菌的关联。 A. S. puntauvense线虫与细菌共生，X. bovienii，表达绿色荧光蛋白。该图像是从相同的视场重叠相位与荧光图像的对比度的图像所产生的合成图像。箭头表示荧光线虫主机内的共生菌。比例尺为100μm。B.图中显示的S. carpocapsae少年线虫与GFP表达X.线虫线虫肠道内的本地化。该图像是通过构造超过微分干涉对比度的图像的荧光图像叠加。图中标尺代表20微米。

应变	线虫数与acteria	总线虫计数	线虫的百分比olonized
S. puntauvense脂质琼脂	30	205	14.60％
S. puntauvense肝肾琼脂	72	105	68.60％

表1中。用于细菌的存在的线虫种群的实施例的得分，在该实验中，无菌S. puntauvense线虫生长，其表达GFP的共生体在不同的生长介质（血脂的琼脂，肝肾琼脂^32）测试殖民缺陷。总共有至少一个hundreð每个样品数，并取得线虫细菌的存在。统计力量，应该算在每个类别至少有30线虫三个实验复制。

表2中。荧光蛋白含有质粒。列表潜在的荧光蛋白插入质粒的细菌共生给出列出名称的质粒。包括的其它信息的荧光蛋白质编码，抗生素盒用于质粒保养，其他的使用说明，源的质粒。在括号中指出的浓度的浓度的抗生素用于X。线虫，每种质粒已成功地用于在任一的致病杆菌或，光 。更多的信息可以从著名的引文。根据被测试的细菌上，一些质粒可能无法正常工作，根据荧光蛋白，抗生素的选择，插入部位，或复制原点。上面列出的质粒包含不同的功能，可以使使用在感兴趣的细菌的。例如，小Tn7-KSGFP的插入到attTn7网站的染色体，而pECM20插入的X。线虫通过同源重组的染色体。或者，pPROBE质粒维持染色体外，和每个pPROBE质粒具有相同的骨干和荧光基团，但有不同的可选择的标记物或复制起点，以使它们能够使用在各种生物分类或突变体背景。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

这里所描述的协议提供了一种方法，一种线虫主机（ 图1）内的细菌的光学检测。此方法利用的光学透明度，线虫和荧光标记细菌的能力，使在体内分析的细菌内的线虫主机（ 图3）。具体而言，这种方法在其主机的标识细菌本地化的。横跨线虫种群的细菌定植的频率可以通过计数线虫种群和得分为细菌的存在，来确定（ 表1）。此方法是，可以用于研?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号	评论（可选）
脂质琼脂 （无菌）			营养肉汤8克，琼脂15克，5克酵母提取物，890毫升水，10毫升0.2克/毫升的MgCl 2。 6H 2 O，96毫升玉米糖浆溶液*，4毫升玉米油* 搅拌均匀介质，同时浇注板 *添加高压灭菌后的无菌成分
玉米糖浆溶液 （无菌）			7毫升玉米糖浆，89毫升水 混合和高压灭菌器
鸡蛋的解决方案			16.6毫升12％次氯酸钠，5毫升5M KOH，80毫升水
溶原性肉汤 （无菌）			酵母提取物5克，10克胰蛋白胨，5克盐，1升的水 混合和高压灭菌器
微型离心	费舍尔	13-100-675	将工作任何的离心持有的离心管
离心分离	贝克曼	366802	大台式离心机，持有15毫升和50毫升锥形管
无菌60毫米X 15毫米培养皿	费舍尔	0875713
50 mL离心管	费舍尔	05-539-6
15 mL离心管	费舍尔	05-531-6
无菌100毫米X 20毫米培养皿	费舍尔	0875711Z	深于标准的培养皿
24 - 孔板	格雷纳生物	662000-06
显微镜			荧光功能，兼容的荧光显微镜需要
多聚甲醛	电子显微镜科学	15710
PBS （无菌）			8克氯化钠 0.2克KCl 1.44克Na 2 HPO 4， 0.24克KH 2 PO 4 1升的水 调整到pH为7.4，水至1 L和高压釜中
微型离心管	费舍尔	05-408-138	2毫升或1.5毫升管
振动筛			任何振动筛，使液体轻轻移动工作
二氨基庚二酸	西格玛	D-1377	如果需要，补充介质的浓度或1mM