非侵入性光学成像淋巴血管的鼠标

Holly A. Robinson; SunKuk Kwon; Mary A. Hall; John C. Rasmussen; Melissa B. Aldrich; Eva M. Sevick-Muraca

doi:10.3791/4326

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摘要

最近开发的成像技术，利用近红外荧光（NIRF）可能有助于阐明淋巴系统在肿瘤转移中发挥的作用，免疫反应，创面修复，以及其他相关的淋巴管疾病。

摘要

淋巴血管系统的循环系统，保持体液平衡，提供了免疫监视，并介导对脂肪的吸收，在肠道中的重要组成部分。然而，尽管其关键的功能，有相对较少的了解淋巴系统如何适应为这些功能在健康和疾病的^1。最近，我们表现出的能力，动态图像淋巴管架构和淋巴结在正常的人类受试者以及患有淋巴功能障碍的近红外荧光（NIRF）染料的使用跟踪管理和自定义的“抽水”行动，第三代强化成像系统^2-4。 NIRF成像显示出了巨大的变化，在淋巴管的结构和功能与人类疾病。目前还不清楚这些变化是如何发生的和正在开发的新的动物模型，阐明它们的遗传和分子基础。在这个协议中，我们提出了NIRF淋巴管，S使用吲哚菁绿（ICG），已被用于在人类⁷⁵⁰年的染料，和一个NIRF染料标记的环状白蛋白结合结构域（CABD-IRDye800）肽，优先结合鼠标和人白蛋白⁸商场动物成像^5,6 。约5.5倍的亮度比ICG，CABD IRDye800有一个类似的淋巴间隙轮廓比，ICG以实现足够的的NIRF信号为成像^8，可以在较小的剂量注入。由于组织间隙⁸白蛋白的的CABD-IRDye800和ICG绑定，它们都可以描绘出活性蛋白运输和淋巴管内。皮内（ID）注射液（5-50微升）的ICG（645μM）或CABD-IRDye800（200μM），在盐水给药每个后爪和/或左，右侧的基极的背侧尾的异氟醚麻醉的小鼠。在动物所得的染料浓度是83-1,250微克/千克的ICG或113-1,700微克/千克CABD，IRDye800。紧随注射剂，功能性淋巴成像长达1小时，使用一个定制的，小动物NIRF成像系统进行。可以描绘整个动物的空间分辨率为100微米或更小的荧光淋巴管，和图像的结构至3厘米的深度可以获取^9。图像采集采用V + +软件，并使用ImageJ或MATLAB软件进行分析。在分析过程中，连续绘制地区的利益（投资回报率），覆盖整个容器直径沿淋巴管。每个ROI测量定量评估通过血管淋巴移动的“数据包”，对于一个给定的容器和NIRF强度，每个ROI的尺寸保持不变。

研究方案

所有动物的研究进行了大学，得克萨斯大学健康科学中心（休斯顿，德克萨斯州），比较医学系，分子成像后，审查和批准该协议由各自的机构动物保健中心的标准和使用委员会（IACUC）或动物福利委员会（AWC）。

1。制备动物24小时之前，成像

必须完成下面的步骤中（如需要）的前一天，淋巴造影发生。

将动物的感应箱与异氟醚和稳重。
一旦动物是状态的深刻麻醉（用脚趾夹机动监测），在尿片/的绒毛垫和位置鼻的鼻锥连接到异氟醚气体的地方镇静动物。
所有头发夹/皮草（如有）周围的区域进行成像。
脱毛剂（NAIR）应用的裁剪区域，并把它Øn的皮肤3分钟。
与温暖，潮湿的纱布或纸巾轻轻擦去所有的脱毛剂。
皮肤用温水轻轻冲洗，并用纱布或纸巾轻轻地擦干地区。
让动物恢复加热垫或加热灯，并返回到他们的笼子。

2。一天的影像

复溶显像剂，然后用无菌水稀释使用无菌的，正常的（0.85％）生理盐水CABD-IRDye800 ICG或200μM（680μg/10微升）的达到645μM（5μg/10微升）， 保持在黑暗中的解决方案重建后的6小时内的条件和使用。
将动物的感应箱与异氟醚和稳重。
一旦动物是在深刻麻醉（用脚趾夹机动监测），在其一侧连接到气异氟醚在鼻锥上的尿片/的绒毛垫和位置的鼻子的地方镇静动物的状态。
关灯（所以房间暗）。如果需要的话，一张小桌子卤素光源，可用于光看注射少量的。
用31号针头用胰岛素注射器，注入ID为5微升50微升的ICG或CABD IRDye800在每个后爪和/或背侧基地的尾巴上的左侧和右侧，这取决于该地区的利益（见讨论）。每个注射剂量的范围可以从0.083到1.25毫克/公斤（ICG），或0.113至1.7毫克/公斤（CABD-IRDye800）。注射体积将随动物应变和注射部位。对于无胸腺小鼠中，注射的体积可以是5微升（后肢）或10μl（基尾）， 如果动物是没有的成像系统下的喷射（），将动物的成像系统下后立即注射（）。
如果没有染料的吸收是在淋巴管可见，需要重复步骤2.5将作为每只动物协议需要。
一旦被视为淋巴管，包括注射部位用黑色电工胶带或黑色PA元。
长达1小时使用获取淋巴图像V +软件和小动物，NIRF成像系统。（动物镇静异氟醚和呼吸时监视图像获取）。虽然小动物，NIRF成像市售的，我们利用一个定制的，小动物NIRF成像系统组成的785纳米激光二极管（1005-9mm的78503的，强烈的，位于North Brunswick，NJ）配备（-B C24TME，Thorlabs公司，牛顿，新泽西州）的非球面透镜，扩散器（ED1-C20，Thorlabs公司），和过滤器（LD01-785/10-25的，Semrock，纽约州罗切斯特市），以产生均匀的照射动物的激励磁场的入射积分通量率小于1.4毫瓦每平方厘米^10。电子倍增电荷耦合器件（EMCCD，PhotonMax512，普林斯顿仪器，特伦顿，NJ）系统有两个830纳米的的滤波器（AND11333，Andover的公司，在新罕布什尔州Salem）和28毫米的尼克尔镜头（1992年，尼康相机，纽约州Melville）是用来捕捉到淋巴的图像融合添ES 200毫秒的动态影像和800毫秒的静态影像^5。请参阅图1系统配置，表中的每个组件的更多细节，并讨论了简短的讨论关键的成像性能。
让动物恢复加热垫或加热灯和返回到他们的笼子，或安乐死。
使用ImageJ或MATLAB软件分析图像。参见图6。