人类多能干细胞的神经元在一个Multititre的板格式的快速和高效地生成

摘要

人类多能性干细胞（神经元分化hPSCs）的协议往往是费时的，并需要大量的细胞培养的技能。在这里，我们已经适应了小分子的分化过程，一个multititre板格式，可以简单，快速，高效的人类神经元的产生可控制的方式。

摘要

现有的协议从人类多能干的细胞（hPSCs）的神经元的产生往往是繁琐的，因为它们是多步程序涉及的分离和扩增的神经前体细胞，细胞的终末分化之前。在这些耗时的方法相比，我们最近发现，从hPSCs，随后立即分化为功能性神经元相结合，抑制信号转导通路，TGFβ/SMAD2，BMP/SMAD1，和FGF / ERK，促进快速诱导神经外胚层。在这里，我们已经适应了我们的程序一种新型的multititre板的格式，以进一步提高其可重复性和吞吐量的应用程序中，使其符合。它包括四个天的神经外胚层形成在浮动球（胚状体），其次由进一步4天，分化成神经细胞的粘附条件下。本协议获得的大多数细胞是双极性感觉神经元。此外，高效的程序，是不需要特别的专业技能，是基于一个简单的化学介质，具有成本效益的小分子。由于这些特点，该过程可作为一个有用的平台，为进一步功能研究以及基于细胞的筛选采用，但需要的任何类型的人体感觉神经细胞或神经元。

引言

hPSCs，其特征在于，包括胚胎衍生的人胚胎干细胞（胚胎干细胞），诱导式多能性干细胞（人iPS细胞），是多能干细胞的，这意味着它们可以带来各种体外^1-2细胞谱系。许多已分化的细胞类型，支持最新的来自人类胚胎干细胞，这些细胞的科研和基于细胞的筛选方法，提出了有价值的工具和细胞为基础的治疗方法有希望的概念。

人胚胎干细胞的神经元的分化协议通常是复杂和耗时的，因为它们通常是基于第一引导整体神经命运，然后通过手动隔离的神经祖细胞，分化成一个给定的神经元类型感兴趣的^3-6和随后的终端。在某些方面，这种复杂性是不令人惊讶的和不可避免的，因为这种状态的最先进的定向分化协议，以逐步趋向模仿人类发展的早期，which是在本身极为复杂。另一方面，它可能会在部分也反映了我们缺乏了解潜在的分子过程，造成分化的协议还远远没有得到充分的优化。

的未分化的hPSCs转换成神经外胚层，佩拉等方面。发现，抑制BMP / SMAD1/5/8的信令增强了人类胚胎干细胞神经诱导^7。此外，SMAD2 / 3信号的失活已被证明能促进神经外胚层形成^8。因此，结合这两种途径的失活会导致更有效的神经诱导hPSCs ^4,9。最近，我们已经表明，三分之一的信号转导通路，FGF / ERK，作为最早的步骤的神经外胚层承诺在人类胚胎干细胞强大的阻遏。相反，同时压制所有这三种途径导致近均匀的胚胎干细胞转化成神经外胚层在短短的四天^10。随后，高效的终端分化为功能性神经元观察到八天之内。得到的神经元可能是感觉神经元的外周神经系统，这可能部分解释了他们的快速推导^10。感觉神经元的维护中的缺陷被认为是某些人类疾病如家族性自律神经失调¹¹的一个原因。对于这类疾病的建模基于hiPSC技术^12，为进一步的功能特性，以及为应用的目的，不需要任何特定类型的神经元，这种分化过程可能存在一个有用的基础。

然而，我们最初采用差异化策略参与胚体形成的团块（EBS）从人类胚胎干细胞的殖民地^10，这造成了相当程度的异质性EB尺寸，也出现了妥协神经元形成在某些行政长官效率LL线。此外，由于的异质性EB尺寸，能力，系统测试期间和之后的额外生长因子或小分子神经元形成的影响似乎有点混淆。

在这份报告中，我们调整了我们的前面的过程中等吞吐量兼容，被迫聚集为基础的新技术，将EBS的一个高度规模控制的方式，也显示在其他情况下^13。随后，生成的类胚体在V形的96孔板的孔中，被转移到U形的超低附件96 - 孔板中，，发起神经外胚层形成悬浮液中。四天之后，胚体可以镀出，引起终末分化的神经元，在高效率和均匀性。或者，天-4类胚体分离成单个细胞，这样，这导致人类的神经元的低密度单层镀出。迄今获得的两个独立的相干结果甚巨，人类胚胎干细胞的线，HuES6和三氯化氮。

作为先决条件，成功的EB形成严格依赖于使用的是合成聚合物，聚乙烯醇（PVA），连同已知可促进胚胎干细胞的生存^13-14的 ROCK抑制剂的Y-27632。其结果是，形成的类胚体的均匀性在96-V-板大幅提高相比，作为基于随机分裂技术的大规模培养的类胚体中的形成。因此，该系统提供了一种显着改善的平台神经外胚层形成悬浮培养，然后通过粘合条件下的高度控制的神经元形成。

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研究方案

1。的基质胶涂层钢板和媒体的制备

1. 基质胶涂层钢板基底膜的制备已被发现是一个优选的基板胚体分化附件，也促进了有效的产物，从这些^10个神经元。
   1. 解冻10毫升的Matrigel上冰过夜。
   2. 第二天，稀释果冻状的基底膜与两体积的冰冷的DMEM/F-12和准备的1毫升的等分试样，在预冷的15毫升锥形管，它可以被存储于-20℃下冷冻
   3. 决定一盘格式为神经细胞的分化。例如，作为一个起点，我们建议在12孔格式执行初始一轮的分化。预冷却4个12孔板中，在4℃下溶解冰冻Matrigel的一个等份通过加入9毫升预冷DMEM/F-12，然​​后通过移液向上和向下，直到所有的预稀释Matrigel的解冻并溶解。
   4. 然后的内容传送到一个​​新的50毫升试管中含有15毫升的DMEM/F-12冰（最后Matrigel的稀释：1:75）。然后，添加0.5毫升稀释的基质胶的预冷却的12孔板的各孔。用Parafilm包裹板，静置过夜。
   5. 第二天，转移板至4℃。涂覆后的板，可以被存储在使用前几个星期。
2. 媒体

EB形成培养基（〜15毫升需要执行在一个96孔板中的分化- 见表1和图2中的计划）：
DMEM/F-12与0.4％的聚乙烯醇（PVA）
1个N2
1个B27
0.05％BSA
20毫微克/毫升FGF2
10μMY-27632
1个PenStrepGln

分化培养基（〜30毫升，随后需要执行在一个96 -孔板的分化神经元形成在一个基底膜涂层12孔板中，请参阅表1）：
DMEM/F-12
1个N2
1个B27
0.05％BSA
0.5μMPD0325901
15μMSB431542
0.5μMDorsomorphin，
1个PenStrepGln

2。强制EB的形成

1. 您的首选的无饲养层条件下成长hPSCs。我们使用MEF条件培养基对基质胶涂层的6孔培养板^15。然而，其他文化系统，如自制或商业媒体也应该工作。在开始分化实验的时间，hPSCs应该子汇合生长活跃的。
2. 机械去除自发分化的殖民地，在立体显微镜下用消毒过的塑料吸管头。
3. 用剩余的未分化的殖民地，用PBS和摘要单细胞Accutase含有1X Y-27632。佩莱通过离心分离的单细胞在200×g离心2分钟，重新悬浮在少量体积的EB形成介质，并用血细胞计数板计数测定细胞滴度。
4. 细胞的等分试样加入到其它EB形成介质导致在40000和80000之间的每毫升细胞滴度。
5. 使用多通道移液管，每孔100μl转移到96V型底的板，从而在4000至8000每孔细胞。自旋96 - 孔板中在400×g离心1分钟的摆动离开板离心机在井的底部，以收集细胞，并转移到细胞培养孵化。胚体过夜，将形成在图1中所示。

3。神经外胚层感应

1. 第二天（0天），收集的EB从96V盘下立体显微镜和转让，体积小到一个3.5厘米的细菌培养皿中2毫升的分化培养基。轻轻地搅动几秒钟的菜洗的EBS。
2. 分化培养基中加入100μl的超低附着U型底的96 - 孔板每孔。在体视显微镜下洗涤菜到96U井的小卷，转让的EB（1 EB每次我们LL）。 96U板到4天，让神经外胚层形成的细胞培养孵化器。

4。神经元的形成

1. 在第4天，在步骤3.1中制备的洗涤皿和另外取代DMEM/F-12预先温热基质胶涂层的分化培养基（1毫升，每孔）的12孔板中。
2. EBS的电镀
   1. 收集的EB从96U板，洗这些以上，并仔细的种子，他们一成井的基质胶包被的12孔板（每孔约8 EBS）：EBS应均匀地分布在井允许不受干扰的产物，在接下来的日子里的神经元（参见图2中的“5天”的形象）。
   2. 未转让前的12孔板回孵化器，允许，胚体松散地连接在室温下10分钟左右。然后，小心地将12孔板细胞培养孵化器。神经细胞会生长出放射状的镀胚体在接下来的4天中，作为资助自置居所图2中的WN（“8天”的形象在右边）。

5。神经元形成的单层膜

1. 作为一种替代方法的步骤的第4点），在该程序的第4天，收集到一个3.5厘米的分化培养基中含有2毫升细菌培养皿中的类胚体，然后将其转移类胚体在一个小体积的PBS含盘，然后到另一道菜Accutase。
2. 让消化单细胞在200×g离心2分钟，离心，重新悬浮在分化培养基中的小体积，并用血细胞计数板计数测定细胞滴度。调整滴度1-2X10 ⁶细胞分化培养基（无Y-27632），使用每毫升。
3. 板细胞预先温热的基底膜涂层12孔板每孔（1毫升），并转移到细胞培养孵化。神经元形成作为单层之间观察到7至8天（ 图3C）。然而，应当指出，这单层变种的过程对细胞的生存和最合适的衬底是不充分的优化。

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结果

在我们以前的报告中，胚体从hPSCs可能与许多其他，产生，简单的replating到常规的hPSCs分裂聚集在低附着的菜肴^10。这通常会导致一个广泛分布的EB尺寸（ 图1C，上图）。由此而产生的另一个问题是保持在悬浮液中，类胚体彼此倾向于聚集，导致到一个更高的异质性EB体积。为了规避这些问题，因此，我们试图产生的EB电镀单hPSCs到低附着，井multititre板（ 图1A）。这?...

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讨论

大多数分化协议涉及EB形成从hPSCs，包括我们之前发表的过程^10，是基于手动或作为骨料，这不可避免地导致异质性的EB大小的人类胚胎干细胞的酶辅助的收获。这一事实导致分化效率与某些细胞系中的可变性，从而使系统的分析困难的，特别是在一个中等的吞吐量规模。此外，人工清扫是劳动密集型的，这本身损害的可扩展性。

与此相反，这里描述的方法是根据对EB?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
的试剂的名称	公司	目录编号	评论
Matrigel的HC	Becton Dickinson公司	354263	上处理的详细信息，请参阅文本
DMEM/F-12	Life Technologies公司	21331-020
聚（乙烯醇）	西格玛	363170	DMEM/F-12使用超声波水浴溶解在0.4％/避免过热/可以保持几个星期，在4°C
N2补充	Life Technologies公司	17502-048	100X，储存冷冻等份
B27补充	Life Technologies公司	12587-010	50X，存储冷冻等份
牛血清白蛋白	西格玛	A1595	10％= 500X，存储冷冻等份
L-谷氨酰胺与青霉素/链霉素	PAA	P11-013	或同等学历
FGF2	Peprotech公司	100-18B	在10微克/毫升溶解在0.1％BSA / PBS = 1000倍，存储冷冻等份
ROCK抑制剂的Y-27632	abcamBiochemicals	ASC-129	溶解在DMSO = 1000倍，存储10毫米冻结等份
PBS	PAA	H15-002	或同等学历
Accutase	PAA	L11-007
96孔V底板	Nunc公司	277143
PD0325901	轴突MEDCHEM	Axon公司1408	溶解在0.5毫米DMSO = 1000倍，存储冷冻等份
SB431542	abcamBiochemicals	ASC-163	溶解在DMSO = 1000倍，存储15毫米冻结等份
Dorsomorphin	圣克鲁斯	SC-200689	0.5毫米溶解在DMSO = 1000倍，存储冷冻等份
96孔U型底的超低附着板	康宁	7007
β-III微管蛋白抗体（鼠）	西格玛	T8660	用1:1000
β-III微管蛋白抗体（兔）	科文斯	PRB-435P	在1:2000
BRN3A抗体（POU4F1）	圣克鲁斯	SC-8429	使用1:500
			表1。/ STRONG>特定的试剂和设备。